Organoid beredning analysen (ORA) för den funktionella analysen av Intestinal Stem och nisch celler

Summary

Intestinal organoid kulturer är etablerade från hela kryptor och tillåter inte analys av självförnyelse och differentiering i en cell-specifika mode. Det här protokollet beskriver beredning av sorterade stem (Lgr5⁺) och nischade (Paneth) celler, som ger upphov till organoids samtidigt som deras tidigare biokemisk och genetisk modifiering och funktionell analys.

Abstract

Intestinala epitelet kännetecknas av en extremt snabb omsättningshastighet. Hos däggdjur förnyas hela epitelial slemhinnan inom 4-5 dagar. Intestinal stamceller bor längst ned i kryptor av Lieberkühn, är öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och bevara homeostas genom sin karaktäristiska höga proliferativ kurs¹. Hela tunntarmen, Lgr5⁺ stamceller samsas med specialiserade sekretoriska celler kallas Paneth celler. Paneth celler utsöndrar antibakteriell föreningar (dvs, lysozym och cryptdins/defensins) och utöva en kontrollerande roll på tarmfloran. Mer nyligen, har upptäckt en ny funktion för Paneth celler, nämligen deras kapacitet att stödja nisch Lgr5⁺ stamceller genom flera viktiga ligander som Wnt3, EGF och Dll1².

När isolerade ex vivo och odlade i närvaro av specifika tillväxtfaktorer och extracellulär matrix komponenter, hela tarmens kryptor ge upphov till långlivade och själv förnya 3D-strukturer som kallas organoids som mycket liknar de crypt-villus epitelial arkitekturen av vuxen tunntarmen³. Organoid kulturer, när etablerade från hela kryptor, tillåta studien av självförnyelse och differentiering av intestinal stamcellsnischen, men utan att ta itu med bidrag av dess enskilda komponenter, nämligen den Lgr5⁺ och Paneth celler.

Här beskriver vi en ny metod för organoid analysen som tar fördel av möjligheten för Paneth och Lgr5⁺ celler för att associera och bildar organoids när Co odlade. Detta synsätt, här benämnd ”organoid beredning assay” (ORA), tillåter de genetiska och biokemiska modifieringen av Paneth eller Lgr5⁺ stamceller, följt av beredning i organoids. Som sådan, gör det den funktionella analysen av de två viktigaste delarna av intestinal stamcellsnischen.

Introduction

Intestinala epitelet är den mest snabbt själv förnya vävnaden i kroppen hos däggdjur och, som sådan, har varit föremål för en uppsjö av studier syftar till att identifiera och funktionell karakterisering av de adulta stamceller som bor längst ned i kryptan av Lieberkühn, öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och beroende av kanoniska Wnt signaler¹. Noterbart är Lgr5⁺ stamceller flankerad och stöds av specialiserade nisch celler, dvs Paneth celler, vilket också beror på Wnt signalering för deras mognad². Tillsammans, dessa två celltyper ligger bakom självförnyelse av intestinal epitel slemhinnan och bevara den dagliga homeostatiska balansen: Lgr5⁺ stamceller snabbt dela upp och ge upphov till stamceller och mer specialiserade intestinal epitelial celler; Paneth celler ger väsentliga nisch faktorer (t.ex., Dll1, Wnt3, EGF) till Lgr5⁺ stamceller². Kapaciteten för intestinal kryptor när guldpläterade ex vivo att bilda organiserade och själv förnya strukturer kallas organoids, eller ”mini-tarmar”, har utnyttjats som en experimentell verktyg för att ge insikt i processer såsom självförnyelse och differentiering i normala och patologiska förhållanden inklusive cancer⁴. Organoid kulturer har fastställts från flera vävnader, inklusive tarmen, bukspottkörtel, lever och njure, från både mus och mänskliga prover⁴. Metoden utvinning och de tillväxtfaktorer som anställd att utveckla dessa organoid kulturer är vävnadsspecifika och utformade att köra flera härstamning differentiering och så nära som möjligt efterliknar ursprungliga stamcellsnischen invivo. Organoids kan ha potentiella tillämpningar inklusive behandling av genetiska sjukdomar, bedömning av terapeutisk effekt i cancer, analys av drug toxicitet eller studiet av organogenes in vitro-⁵.

Sammantaget är den största begränsningen av organoid kulturer när etablerade från vävnadsprover brist på cell-specificitet. Till exempel intestinal organoids etablerat från hela tarmens kryptor inte tillåter analys av enskilda cellkomponenter omfattade inom vävnad källan (t.ex., hela kryptor innehåller Lgr5⁺, Paneth, och progenitorceller).

Här beskriver vi en ny metod, kallad ORA, som kombinerar fördelarna med intestinal organoid kulturer med den funktionella analysen av dess mest grundläggande komponenter, nämligen stammen (Lgr5⁺) och nisch (Paneth) celler. Detta uppnås genom den unika förmågan av Paneth och Lgr5⁺ celler för att fysiskt associera med varandra när Co inkuberas och ge upphov till organoids^2,6,10. Vi drog fördel av denna funktion och pre behandlas de två celltyper individuellt innan de tillåts att rekonstruera organoids. När du gör så, varje cell komponent kan utsättas för någon viss drog, tillväxtfaktor, biokemiska hämmare, genmodifiering eller kemisk behandling innan beredning och organoid bildandet. Alltså kommer att med ORA analys möjliggöra fastställandet av huruvida en specifik läkemedelsbehandling eller genetisk modifiering har en specifik effekt på stamcellerna eller deras nisch motsvarighet.

Protocol

Alla förfaranden var klara enligt lokala djurskyddet lagar och riktlinjer.

1. beredning av instrument, kultur Media och rätter

1. Autoklav 1 uppsättning intestinal sax, normala sax och pincett i en steril behållare.
2. Placera en 96 brunnar (platt botten) maträtt i en inkubator vid 37 ° C.
3. Förbereda 10 mL av komplett odlingsmedium med reagenser i tabell i material.
4. Inkubera komplett mediet vid 37 ° C i ett vattenbad.
5. Tina rekonstituerade basalmembranet genom att placera det i en ishink. Rekonstituerade basalmembranet blir flytande vid 4 ° C.
6. Fyll 4 petriskålar med kall fosfatbuffrad koksaltlösning eller förkortad PBS (4 ° C).

2. isolering av små Intestinal kryptor

1. Offra av CO₂ inandning Lgr5- andra-IRES-CreER^t2 mus på en C57BL6/J-bakgrund. Dissekera bukhinnan longitudinellt med en sax.
2. Håll magen med tången och skär den tvären i hälften.
3. Med intestinal sax från nu på, dra ut tarmen och placera den i en petriskål med PBS.
   Obs: Intestinal sax har en skarp och en trubbig spets. Dessa sax trubbig spets är tänkt att inte skada crypt-villus arkitekturen medan öppna tarmen.
4. Börja genom att placera den trubbig spetsen in i magen och försiktigt trycka den genom pylorus. Fortsätt genom att skära med saxen och dra med tången.
5. När hela tunntarmen öppnas längdriktningen, tvätta den i kalla PBS genom att hålla det med tången och försiktigt skölja den i PBS lösningen med U-formade rörelser.
6. När alla pall resterna är avmarkerad, vidare till platta tarmen på en skärbräda, luminala sida upp. Den luminala sidan är lätt igenkännlig genom avsaknad av blodkärl och dess bleka utseende jämfört med den yttre delen.
7. Med en glasskiva, ta försiktigt bort villina genom skrapning tillplattad tarmen. Utföra detta steg två gånger längs hela längden av vävnad.
8. Skär tunntarmen med sterila kirurgiska blad i 2-5 mm bitar.
9. Placera små intestinal fragment i en 50 mL tub innehållande 10 mL is kallt PBS.
10. Ren vävnad fragment, ta bort eventuella kvarvarande föroreningar genom pipettering dem upp och ner i PBS. Kassera supernatanten och upprepa detta tills PBS är helt klart.
11. Tillsätt 15 mL kall PBS, för att få totala slutvolymen av PBS till 25 mL. Lägga till 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och inkubera i 45 min på en roller vid 4 ° C.
12. Kassera den PBS/EDTA.
13. Tillsätt 10 mL PBS och lossa kryptor genom hårt pipettering vävnad fragmenten upp och ner (minst tre gånger). Samla in supernatanten.
14. Upprepa steg 2.13 fyra gånger. Lägg till odlingsmedium för att nå en slutlig volym 50 ml.
15. Pellet cellerna genom centrifugering (300 x g för 5 min).
16. Återsuspendera pelleten i 10 mL odlingsmedium och pellet kryptor genom centrifugering (80 x g under 3 min).

3. enda Cell förberedelse

1. Avlägsna supernatanten av pelleterat kryptor och återsuspendera dem i 1 mL trypsin liknande-enzymer tillsammans med 50 µL DNAS (50 µg/mL).
2. Inkubera cellerna i ett vattenbad vid 32 ° C i 2 min.
3. Tillsätt 10 mL odlingsmedium. Separera kryptor i enstaka celler av hårt pipettering upp och ned minst 5 gånger.
4. Filtrera lösningen genom en 40 µm sil (för att eliminera klumpar och andra orenheter) och pellet enda cellerna vid 300 x g i 5 min.

4. flöde flödescytometri och plätering

1. Förbereda 50 mL 1 x Hanks buffrad saltlösning eller HBSS/2% fostrets Ko serum (FCS) lösning och återsuspendera pelleten i 1 mL för varje 10⁶ celler
2. Lägga till cellsuspensionen BV421 Lin^– (CD31, CD45, TER119) vid en koncentration på 1: 100, och CD24-APC och CD117-PE både vid en koncentration på 1: 250 antikroppar i 30 min.
3. Sortera Lgr5⁺ stamceller och Paneth celler in i separata låg binder rören. Mer information om sortering protokoll för Lgr5⁺ och Paneth celler, se Roth et al. ⁷ och Schewe o.a. ⁶
   1. Centrifugera sorterade cellerna vid 300 x g i 5 min. Omsuspendera cellerna i 100 µL medium med de komponenter som beskrivs i 1.3 (se Tabell för material).
4. Behandla (t.ex., genom kemiska eller genetisk modifiering) Paneth celler (n = 2000) eller den Lgr5⁺ stamceller (n = 2000).
   1. För att behandla celler, använder 5 µL Liposom-medierad transfection reagens i en total volym av 100 µL odlingsmedium och små störande RNA (siRNA) vid en koncentration på 100 nM. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C för siRNA eller för tid som krävs för den valda modifieringen.
5. Tvätta cellerna två gånger i 500 µL odlingsmedium.
6. Centrifugera vid 300 x g i 5 min och resuspendera cellerna i 10 µL odlingsmedium.
7. Pool i två cellulära komponenter (Paneth eller Lgr5⁺ celler) i en 20 µl totala volym och centrifugera vid 300 x g i 5 min på RT.
8. Co Inkubera Paneth och Lgr5⁺ celler för 10 min vid RT.
9. Ta bort 10 µL av supernatanten och låt en menisk vätska att inte aspirera cellpelleten.
10. Tillsätt 30 µL rekonstituerat basalmembranet i cellerna för en total volym på 40 µL, Omsuspendera cellerna och plattan i en pre värmde 96 väl platta. Efter 10 min, tillsätt 200 µL av komplett medium (se Tabell för material). Förändring medium varje 48 h.
11. Räkna organoid multiplicity dag 5.

Representative Results

Organoid beredning analysen kan den separata funktionella analysen av väsentliga nisch och stamceller komponenter av intestinal epitel, här visat av små störande RNA (siRNA) av Apc -genen.

För att uppnå detta mål måste utnyttjas vi först fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) för att separera 8000 Lgr5⁺ och 6000 Paneth celler från inavlade C57BL6/J möss. I figur 1aavbildas ett flödesschema ORA analysens. Organoid beredning kapacitet bedömdes genom ruvning Lgr5⁺ celler med siRNA oligonukleotider mot mRNA för Apc eller som omfattar en kodade sekvens (SCR) som en kontroll. Efter behandling, var samma siRNA-behandlade Lgr5⁺ celler antingen direkt klädd i organoid medium/rekonstitueras basalmembranet, eller inkuberas med lika antal obehandlade Paneth celler och därefter klädd ut. Som en kontroll, obehandlade Lgr5⁺ celler var klädd ensam (dvs.utan Paneth celler) att fastställa antalet organoids som härrör från obehandlade Lgr5⁺ celler. Dessutom som en ytterligare kontroll, var Paneth celler ensam klädd för att kontrollera för organoid bildandet härrör från kontaminering av Paneth-Lgr5 cell dubletter sorteras i stadsporten Paneth cell bakgrund. Som förväntat, påverkades siRNA medierad Nedslagning av murina Apc genen i Lgr5⁺ stamceller (och resulterande aktiveringen av den kanoniska Wnt/β-catenin signalvägen) organoid multiplicity jämfört obehandlade motsvarigheter eller kodade kontrollen (figur 1B). Konstituerande Wnt aktivering räddade också kravet på Paneth celler, som tidigare rapporterats¹. Dessutom dessa organoids verkade som ihåliga sfärer (spheroids), en väl beskrivna fenotyp för Apc-mutant eller Wnt-stimulerad organoids (figur 1 c, panel 1), jämfört med av dem som erhålls från Paneth-Lgr5 cell morfologi midjekort jacka (figur 1 C, panelen 2)^8,9. Sammantaget dessa resultat visar att beredning Paneth celler och Lgr5⁺ celler kan ge insikt på cell-specifika mekanismer inom dessa två celltyper; Morfologisk analys av organoids av mikroskopi kan vara värdefull i detta avseende eftersom morfologin av organoids återspeglar deras cell sammansättning (t.ex., spheroids utgörs av Lgr5⁺ celler endast). En annan viktig parameter att ta hänsyn till är komplexiteten i organoid (t.ex., antalet crypt spirande händelser).

Figur 1. Effekten av siRNA medierad knockdown för Apc i Lgr5⁺ celler. (A) flödesschema av experimentella förfarandet. Lgr5 ^Andra reporter möss (Lgr5^{andra-IRES-creERT2})¹ användes som en källa till Lgr5⁺ sorterade stamceller. Paneth celler sorterades som avsett och tidigare beskrivna^6,7. (B) Organoid multiplicity observerats vid beredning av Lgr5⁺ stamceller och Paneth celler. När angivna celler var förbehandlats med siRNA oligonukleotider riktad mot Apc (siRNA Apc) eller äggröra (SCR) reglersekvens. Asteriskerna visar statistiskt signifikanta skillnader (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Felstaplar referera till SD. (1) Lgr5⁺ celler, (2) Lgr5⁺ celler SCR, (3) Lgr5⁺ celler siRNA Apc, (4) Lgr5⁺ celler + Paneth celler, (5) Lgr5⁺ celler siRNA Apc + Paneth celler, (6) Paneth celler. (C) representativa bilder av organoids härrör från (1) Lgr5⁺ celler siRNA Apc, (2) Lgr5⁺- Paneth celler. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

ORA tillåter den raffinerade funktionell analysen av de två väsentliga delarna av intestinal stamcellsnischen, nämligen Lgr5⁺ och Paneth celler. Detta tillvägagångssätt har tidigare varit anställd av oss och andra med smärre ändringar^6,10,11. Här presenterar vi ORA förfarandet som ett reproducerbart och standardiserade laboratorium protokoll. Också, vi rapportera om effekterna av Apc nedreglering i Lgr5⁺ stamceller, som ett exempel på möjligheten att genomföra genetiska (eller biokemiska⁶) ändringar av sorterade cellulära komponenter. Sammantaget data visar att siRNA medierad Nedslagning av Apc förbättrar funktionen stamceller av Lgr5⁺ celler, som indikeras av ökad organoid multiplicityen (figur 1B).

Flera fördelar med att använda intestinal 3D organoid kulturer har redan listats i recensioner⁴, inklusive slående likheten av deras organisation med som crypt-villus arkitekturen i vivo, särskilt i jämförelse med den arkitekturen från standard 2D kultur metoder med förevigade cellinjer. En av de stora begränsningarna med denna metod är dock att i de flesta fall, organoid kulturer är etablerade från hela tarmens kryptor, en process som inte tillåter den funktionella analysen av dess enskilda komponenter och, i synnerhet av stammen och nisch celler, här företrädd av Lgr5⁺ och Paneth celler, respektive.

ORA övervinner dessa begränsningar. Stem och nisch celler kan separat sorteras från djuret och beredas för att generera organoids. Som sådan, denna strategi tillåter den funktionella analysen av dessa två cellulära komponenter genom att antingen anställa musmodeller bära särskilda genetiska modifikationer eller utsätts för specifika stressfaktorer (t.ex., DSS eller specialkost); eller genom att direkt ändra sorterade cellerna genetiskt (siRNA, CRISPR-Cas9) eller biokemiskt, före beredning av dem för att generera organoids. Den multiplicity, morfologi, självförnyelse kapacitet och grad av differentiering (och så småningom omfattningen av metaplastiska förändringar) av den resulterande organoids kan anställas som funktionell Läs-outs. När det gäller genetisk manipulation, såsom siRNA, när en morfologisk effekt inte är uppenbara, bör celler analyseras en timme efter transfection att validera Nedslagning av mRNA av intresse. Paneth och Lgr5⁺ kan också sorteras från möss genetiskt manipulerade med olika mutationer att studera huruvida olika mutationer i stammen och nisch celler leda till förändrad interaktioner mellan dessa två celltyper och en annan organoid bildandet effektivitet och/eller morfologi.

Kritiska steg inom protokollet är avlägsnandet av villina (steg 2,7) och resuspension av cellerna i HBSS/2%FCS (steg 4.1). Borttagning av villina är avgörande för att berika Paneth och Lgr5⁺ celler ligger i den nedre tredjedelen av kryptor och att förbättra effektiviteten av sortering. Även om FACS protokoll föreslå vanligen sortering celler i PBS/FCS, användning av HBSS istället för PBS ökat och höll cellviabilitet stabil under hela sortering. Andra viktiga steg är stegen 4.7 och 4.8, där fysiska sammanslutning av Paneth och Lgr5⁺ celler tillåter dessa härstamningar till formuläret midjekort jacka som kommer så småningom ge upphov till organoids.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Final concentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Final concentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Final concentration: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium