Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Organoid rekonstituering analysen (ORA) for funksjonell analyse av Intestinal stammen og nisje celler

doi: 10.3791/56329 Published: November 20, 2017

Summary

Intestinal organoid kulturer er etablert fra hele Krypter og tillater ikke analyse av selvtillit fornyelse og differensiering i en celle-spesifikk måte. Denne protokollen beskriver rekonstituering av sorterte stamme (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler, som gir opphav til organoids mens deres tidligere biokjemiske og genetiske modifikasjoner og funksjonell analyse.

Abstract

Intestinal epitel er preget av en ekstremt rask omløpshastighet. I pattedyr, er hele epithelial fôr fornyet i 4-5 dager. Voksen intestinal stamceller finnes nederst i krypten i Lieberkühn, er øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og bevare homeostase gjennom sine karakteristiske proliferativ høyt1. Gjennom hele tynntarmen, Lgr5+ stamceller er blandet med spesialiserte sekretoriske celler kalt Paneth celler. Paneth celler skiller antibakterielle forbindelser (dvs., lysozyme og cryptdins/defensins) og utøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. Flere nylig, en ny funksjon har blitt oppdaget for Paneth cellene, nemlig evnen til å gi nisje støtte til Lgr5+ stamceller gjennom flere viktige ligander som Wnt3 og EGF Dll12.

Når isolerte ex vivo og kultivert i nærvær av bestemte vekstfaktorer og ekstracellulær matrix komponenter, hele intestinal Krypter gi opphav til varige og selvtillit fornyelse 3D strukturer kalt organoids som ligner svært krypt-villus epitel arkitektur av voksen tynntarmen3. Organoid kulturer, når etablert fra hele crypts tillate studiet av selvtillit fornyelse og differensiering av intestinal stamcelleforskningen nisje, men uten å ta opp forholdet mellom de enkelte komponentene, nemlig den Lgr5+ og Paneth celler.

Her beskriver vi en ny tilnærming til den organoid analysen som utnytter muligheten for Paneth og Lgr5+ celler for å knytte og danner organoids da co kulturperler. Denne her referert til som "organoid rekonstituering analysen" (ORA), tillater den genetiske og biokjemiske modifikasjon av Paneth eller Lgr5+ stamceller, etterfulgt av rekonstituering i organoids. Slik kan funksjonell analyse av de to viktigste komponentene av intestinal stamcelleforskningen nisje.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intestinal epitel mest raskt selv fornyende vevet i pattedyr kroppen og, som sådan, har vært gjenstand for en overflod av studier for identifikasjon og funksjonell karakteristikk av voksne stamceller bosatt nederst på crypt av Lieberkühn, øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og avhengig av kanoniske Wnt signaler1. Spesielt er Lgr5+ stamceller flankert og støttes av spesialiserte nisje celler, i.e. Paneth celler, som også avhenger av Wnt Signaliser for deres modning2. Sammen disse to celletyper populasjonsgjennomsnittet selvtillit fornyelse av intestinal epithelial fôr og bevare den daglige homøostatisk balanse: Lgr5+ stamceller raskt dele og gi opphav til stamfar og mer spesialiserte intestinal epithelial celler. Paneth celler gir viktig nisje faktorer (f.eksDll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ stamceller2. Kapasiteten til intestinal Krypter når belagt ex vivo å danne organisert og selv fornyende strukturer kalt organoids, eller "mini-guts", har blitt utnyttet som en eksperimentell verktøy for å gi innsikt i prosesser som selvtillit fornyelse og differensiering i normal og patologiske forhold inkludert kreft4. Organoid kulturer er opprettet fra flere vev, inkludert tarmen, bukspyttkjertelen, leveren og nyre, fra både mus og prøver fra mennesker4. Utvinning metoden og vekstfaktorer ansatt for å utvikle disse organoid kulturer er vev-spesifikke og utformet for å kjøre flere avstamning differensiering og etterligne så nært den opprinnelige stamcelleforskningen nisje i vivo. Organoids kan ha potensielle programmer inkludert behandling av genetiske sykdommer, vurdering av terapeutiske effekten i kreft, analyse av medikament toksisitet eller studiet av organogenesen i vitro5.

Total, den viktigste begrensningen av organoid kulturer når etablert fra vevsprøver er mangel på celle-spesifisitet. For eksempel intestinal organoids etablert fra hele intestinal Krypter tillater ikke analyse av mobilnettet enkeltkomponenter omfattet vev kilden (f.ekshele Krypter inneholder Lgr5+, Paneth, og stamfar celler).

Her beskriver vi en roman metoden, kalles ORA, som kombinerer fordelene med intestinal organoid kulturer med funksjonell analyse av de mest grunnleggende komponentene, nemlig stem (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler. Dette oppnås gjennom unike evne til Paneth og Lgr5+ cellene skal fysisk knytte hverandre når co ruges og gi opphav til organoids2,6,10. Vi tok nytte av denne funksjonen og pre-behandlet de to celletyper individuelt tidligere tillater seg å gjeninnføre organoids. Når du gjør dette, kan hver celle komponent utsettes for enhver gitt narkotika, vekstfaktor, biokjemiske inhibitor, genetisk modifisering eller kjemisk behandling før rekonstituering og organoid formasjon. Derfor kan bruker ORA analysen bestemme om en bestemt behandling eller genetisk modifisering har en bestemt effekt på stamceller eller deres nisje motpart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer ble gjort i henhold til lokale dyrevelferd lover og retningslinjer.

1. forberedelse av instrumenter og kultur medier retter

  1. Autoclave 1 sett av intestinal saks, normal saks og tang i en sterile containeren.
  2. Plass en 96-brønnen (flat bunn) rett i en inkubator på 37 ° C.
  3. Klargjør 10 mL av fullstendig kultur medium med reagensene oppført i tabell av materialer.
  4. Inkuber komplett middels på 37 ° C i et vannbad.
  5. Tine rekonstituert kjelleren membran ved å plassere den i en isen bøtte. Rekonstituert kjelleren membranen blir flytende ved 4 ° C.
  6. Fyll 4 Petri retter med kalde fosfat-bufret saltvann eller forkortet PBS (4 ° C).

2. isolering av små Intestinal Krypter

  1. Ofre for CO2 innånding Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 musen på C57BL6/J bakgrunn. Dissekere peritoneum langs med en saks.
  2. Hold magen med tang og halvert det tverrgående.
  3. Ved hjelp av intestinal saks fra nå av, trekke ut tarmen og plasserer den i en Petriskål inneholder PBS.
    Merk: Intestinal saks har en skarp og en butt tupp. Sløv spissen av disse saks er ment å ikke skade krypt-villus arkitektur under åpning av tarmen.
  4. Start ved å plassere den Butt tuppen i magen og skyv det gjennom pylorus. Fortsett ved å klippe med saksen og trekke med tang.
  5. Når hele tynntarmen åpnes langs, vask den i kaldt PBS ved å holde med tang og forsiktig rense den i PBS løsningen med U-formet bevegelser.
  6. Når alle krakk restene fjernes, fortsette å flate tarmen på et skjærebrett, luminal side opp. Siden luminal er lett gjenkjennelig ved at blodårer og blek utseende sammenlignet med den ytre delen.
  7. Med et glass lysbilde, Fjern villi ved skraping flat tarmen. Utføre dette trinnet to ganger langs hele lengden av vev.
  8. Skjær tynntarmen med sterilt kirurgisk blad i 2-5 mm biter.
  9. Plasser små intestinal fragmenter i et 50 mL rør som inneholder 10 mL av is kaldt PBS.
  10. Rengjør vev fragmenter, fjerner urenheter gjenværende av pipettering dem opp og ned i PBS. Forkast nedbryting og gjenta dette trinnet til PBS er helt klart.
  11. Legge til 15 mL kaldt PBS, for å få det endelige totalvolumet på PBS 25 mL. Legg 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og ruge for 45 min på en rull på 4 ° C.
  12. Kast PBS/EDTA.
  13. Tilsett 10 mL PBS og koble crypts av hardt pipettering vev fragmenter opp og ned (minst tre ganger). Samle nedbryting.
  14. Gjenta trinn 2.13 fire ganger. Legge til kultur medium for å nå et endelig antall 50 mL.
  15. Pellets cellene med sentrifugering (300 x g i 5 min).
  16. Resuspend pellet i 10 mL av kultur medium og pellets crypts med sentrifugering (80 x g for 3 min).

3. enkeltcelle forberedelse

  1. Forkaste nedbryting av pelleted crypts og resuspend dem i 1 mL trypsin som-enzymer med 50 µL DNAse (50 µg/mL).
  2. Inkuber cellene i et vannbad ved 32 ° C i 2 minutter.
  3. Legge til 10 mL av kultur medium. Distansere crypts på enkeltceller av hardt pipettering opp og ned minst 5 ganger.
  4. Filtrere løsningen gjennom en 40 µm sil (for å unngå klumper og andre urenheter) og pellets enkeltceller 300 x g i 5 min.

4. strømme cytometri og Plating

  1. Forberede 50 mL 1 x Hanks bufrede salt løsning eller HBSS/2% fosterets ku serum (FCS) løsning og resuspend pellet i 1 mL for hver 106 celler
  2. Legge til celle suspensjon BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119) i en konsentrasjon av 1: 100, og CD24-APC og CD117-PE både i en konsentrasjon av 1:250 antistoffer i 30 min.
  3. Sorter Lgr5+ stilk celler og Paneth celler i separate lav binde rør. For detaljer om sortering protokoller for Lgr5+ og Paneth celler, se Roth et al. 7 og Schewe et al. 6
    1. Sentrifuger sorterte cellene på 300 x g for 5 min. Resuspend cellene i 100 µL medium med komponentene beskrevet som 1.3 (se Tabell for materiale).
  4. Behandle (f.eksav kjemiske eller genetisk modifisering) Paneth cellene (n = 2000) eller stamceller Lgr5+ (n = 2000).
    1. For å behandle celler, bruke 5 µL av liposome-mediert transfection reagensen i et totalt volum på 100 µL kultur medium og lite forstyrrende RNA (siRNA) i en konsentrasjon av 100 nM. Inkuber i 30 min på 37 ° C for siRNA eller tiden nødvendig for valgte ombygging.
  5. Vask cellene to ganger i 500 µL kultur medium.
  6. Sentrifuge 300 x g i 5 min og resuspend cellene i 10 µL kultur medium.
  7. Forene de to mobilnettet komponentene (Paneth eller Lgr5+ celler) i en 20 µl totalt volum og sentrifuge 300 x g for 5 min på RT.
  8. Co ruge Paneth og Lgr5+ celler i 10 min på RT.
  9. Fjerne 10 µL nedbryting av og la en menisk væske å forsikre ikke inneholder cellen pellets.
  10. Legge til 30 µL av rekonstituert kjelleren membran celler for et totalt volum på 40 µL resuspend cellene og plate i en forvarmes 96 godt plate. Etter 10 min, legger du til 200 µL av komplett medium (se Tabell for materiale). Endre medium hver 48 timer.
  11. Antall organoid mangfold på dag 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Organoid rekonstituering analysen tillater separat funksjonell analyse av de viktigste nisje og stamcelleforskningen komponentene for intestinal epitel, her demonstrert av lite forstyrrende RNA (siRNA) av Apc genet.

For å oppnå dette, utnyttet vi først fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) for å skille 8000 Lgr5+ cellene og 6000 Paneth fra innavlet C57BL6/J mus. Et flytskjema til ORA analysen er avbildet i figur 1a. Organoid rekonstituering kapasitet ble vurdert av rugende Lgr5+ celler med siRNA oligonucleotides rettet mot mRNA fra Apc eller omfatter en kryptert sekvens (SCR) som en kontroll. Etter behandling, var de samme siRNA-behandlet Lgr5+ cellene enten direkte belagt i organoid medium/rekonstituert kjelleren membran, eller inkubert med samme antall ubehandlede Paneth celler og deretter belagt ut. Som en kontroll, ubehandlet Lgr5+ celler var belagt alene (dvs.uten Paneth celler) til å bestemme antall organoids avledet fra ubehandlet Lgr5+ celler. Som en ekstra kontroll, var Paneth celler alene belagt for å finne bakgrunnen avledet fra forurensning av Paneth-Lgr5 celle doublets sortert i Paneth celle porten organoid-formasjonen. Som forventet, påvirket siRNA mediert knockdown av murine Apc genet i Lgr5+ stamceller (og resulterende aktivering av de kanoniske Wnt/β-catenin signalveien) positivt organoid mangfold i forhold til ubehandlet kolleger eller kryptert kontrollen (figur 1B). Konstituerende Wnt aktiveringen også reddet kravet for Paneth celler, som tidligere rapportert1. Videre disse organoids dukket opp som hule kuler (spheroids), en godt beskrevet fenotypen for Apc-mutant eller Wnt-stimulert organoids (figur 1 c, panelet 1), sammenlignet med morfologi av dem fra Paneth-Lgr5-cellen doublets (figur 1 C, panelet 2)8,9. Samlet disse resultatene viser at gjenoppbygge Paneth celler og Lgr5+ celler kan gi innsikt på celle-spesifikke mekanismer i disse to celletyper; morfologisk analyse av organoids av mikroskopi kan være nyttig i denne sammenheng siden morfologi av organoids gjenspeiler celle sammensetningen (f.eksspheroids er konstituert av Lgr5+ celler bare). En annen viktig parameter tas hensyn er kompleksiteten i organoid (f.eks, antall krypten spirende hendelser).

Figure 1
Figur 1. Effekten av siRNA mediert knockdown av Apc i Lgr5+ celler. (A) flytskjema for den eksperimentelle prosedyren. Lgr5 EGFP reporter mus (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 ble brukt som en kilde til Lgr5+ sortert stamceller. Paneth celler ble sortert som indikerte og tidligere beskrevet6,7. (B) Organoid mangfold observert på rekonstituering Lgr5+ stilk celler og Paneth celler. Når angitte celler var forbehandlet med siRNA oligonucleotides rettet mot Apc (siRNA Apc) eller kryptert (SCR) kontroll-sekvensen. Stjernene angir statistisk signifikante forskjeller (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Feilfelt se SD. (1) Lgr5+ celler, (2) Lgr5+ celler SCR, (3) Lgr5+ celler siRNA Apc, (4) Lgr5+ celler + Paneth celler, (5) Lgr5+ celler siRNA Apc + Paneth celler, (6) Paneth celler. (C) representant bilder av organoids avledet fra (1) Lgr5+ celler siRNA Apc, (2) Lgr5+- Paneth celler. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ORA tillater raffinert funksjonell analyse av de to viktigste komponentene for intestinal stamcelleforskningen nisje, nemlig Lgr5+ og Paneth celler. Denne tilnærmingen har vært tidligere ansatt og andre små modifikasjoner6,10,11. Her presenterer vi ORA prosedyren som en reproduserbar og standardisert laboratorium protokoll. Også vi rapportere om virkningene av Apc downregulation i Lgr5+ stamceller, som et eksempel på muligheten for å implementere genetisk (eller biokjemiske6) endringer i sorterte cellulære komponenter. Samlet data viser at siRNA mediert knockdown fra Apc forbedrer funksjonen stilk cellen i Lgr5+ celler, som indikert av økt organoid mangfoldet (figur 1B).

Flere fordeler ved intestinal 3D organoid kulturer har allerede vært oppført i anmeldelser4, inkludert slående likheten av organisasjonen med det på krypt-villus arkitektur i vivo, spesielt i forhold til den arkitektur fra standard 2D kultur metoder med udødeliggjort linjer. Men er en av de store begrensningene av denne metoden at i de fleste tilfeller, organoid kulturer opprettes fra hele intestinal Krypter, en prosess som ikke tillater funksjonell analyse av de enkelte komponentene, og særlig av stammen og nisje celler, her representert ved Lgr5+ og Paneth celler, henholdsvis.

ORA overvinner disse begrensningene. Stilk og nisje celler separat sorteres fra dyret og rekonstituert for å generere organoids. Derfor denne tilnærmingen tillater funksjonell analyse av disse to cellulære komponenter enten ansette musen modeller bærer genetiske endringer eller utsatt for bestemte stress faktorer (f.eks, DSS og/eller bestemte dietter); eller ved direkte å endre sorterte cellene genetisk (siRNA, CRISPR-Cas9) eller biokjemisk, før gjenoppbygge dem til å generere organoids. Mangfold, morfologi, selvtillit fornyelse kapasitet og grad av differensiering (og til slutt omfanget av metaplastic endringer) av den resulterende organoids kan benyttes som funksjonell read-outs. Ved genetisk manipulasjon, som siRNA, når en morfologiske effekten ikke er tydelig, bør celler bli analysert en time etter transfection validere knockdown av mRNA rundt. Paneth og Lgr5+ kan også sorteres mus genmodifiserte med ulike mutasjoner å studere om ulike mutasjoner i stammen og nisje celler føre til endrede samspillet mellom disse to celletyper og en annen organoid dannelse effektivitet og/eller morfologi.

Avgjørende skritt i protokollen er fjerning av villi (trinn 2.7) og rørets cellene i HBSS/2%FCS (trinn 4.1). Fjerning av villi er avgjørende å berike Paneth og Lgr5+ celler ligger i nedre tredjedel av crypts og forbedre effektiviteten til sortering. Selv om FACS protokoller tyder vanligvis sortering celler i PBS/FCS, bruk av HBSS i stedet for PBS økt og holdt cellen levedyktighet stabilt gjennom sortering tiden. Andre viktige trinn er fremgangsmåten 4.7 og 4.8, hvor fysisk sammenslutning av Paneth og Lgr5+ celler lar disse linjene til skjemaet doublets som vil til slutt gi opphav til organoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse eller andre interessekonflikter

Acknowledgments

Denne studien ble gjort mulig med midler fra den hollandske Kreftforeningen (KWF; EMCR 2012-5473) og World Cancer Research midler International (WCRF, prosjektet nr 2014-1181)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F12 * Thermo Fisher Scientific 12634-010
Glutamax * Thermo Fisher Scientific 35050061 Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin * Thermo Fisher Scientific 15140122 Final concentration: 1%
Hepes * Thermo Fisher Scientific 15630080 Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF * Thermo Fisher Scientific PMG8041 Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin * Peprotech 250-38 Final concentration: 100 ng/ml
y27632 * Sigma Y0503 Final concentration: 10 µM
Jagged-1 * Anaspec Bio AS-61298 Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin * R&D systems 3474-RS-050 Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC Qiagen GS11789 Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019
CD24 APC Biolegend 101814
c-kit PE Biolegend 105808
BV 421 CD31 Biolegend 102424
BV 421 CD45 Biolegend 103134
BV421 TER119 Biolegend 116234
HBSS Thermo Fisher Scientific 14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J Jackson Laboratories 008875
Low binding tubes Eppendorf Z666548-250EA
Matrigel Corning 356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  2. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  5. Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
  6. Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
  7. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
  8. Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
  9. Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
  10. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
  11. Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. 436-450 (2016).
Organoid rekonstituering analysen (ORA) for funksjonell analyse av Intestinal stammen og nisje celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt, M., Fodde, R. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (129), e56329, doi:10.3791/56329 (2017).More

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt, M., Fodde, R. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (129), e56329, doi:10.3791/56329 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter