Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة

Published: November 20, 2017 doi: 10.3791/56329

Summary

تنشأ من أقبية كله الثقافات أورجانويد المعوية ولا تسمح التحليل الذاتي تجديد والتمايز بطريقة خاصة بالخلية. ويصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل الجذعية تم فرزها (Lgr5+) ومكانه الخلايا (بانته)، والتي تؤدي إلى أورجانويدس حين تمكينهم من قبل التعديل البيوكيميائية والوراثية والتحليل الوظيفي.

Abstract

ظهارة الأمعاء تتميز بمعدل دوران سريع للغاية. في الثدييات، ويتم تجديد البطانة الظهارية الكامل خلال 4-5 أيام. الخلايا الجذعية البالغة المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا Lieberkühn، وتخصص بالتعبير عن الجين Lgr5 ، والحفاظ على التوازن من خلال ما مميزة ارتفاع معدل التكاثري1. في جميع أنحاء الأمعاء، Lgr5+ يختلط الخلايا الجذعية مع الخلايا الافرازية المتخصصة تسمى الخلايا بانته. بانته الخلايا تفرز المركبات المضادة للبكتيريا (أيليسوزيمي وكريبتدينس/ديفينسينس)، وممارسة دور المسيطر على النباتات المعوية. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف وظيفة جديدة للخلايا بانته، وهي قدرتها على توفير الدعم المتخصصة بالخلايا الجذعية Lgr5+ من خلال عدة يغاندس الرئيسية ك Wnt3 ولو Dll12.

عندما عزل السابقين فيفو ومثقف حضور عوامل نمو محددة وعناصر المصفوفة خارج الخلية، الخبايا المعوية كله يؤدي إلى المعمرة والذاتي تجديد هياكل ثلاثية الأبعاد تسمى أورجانويدس التي تشبه جداً السرداب-زغابة هندسة الظهارية من الكبار الأمعاء الدقيقة3. الثقافات أورجانويد، عندما أنشأت من أقبية كله، تسمح دراسة التجديد الذاتي، والتفريق بين مكانة الخلايا الجذعية المعوية، على الرغم من دون التصدي لمساهمة مكوناتها الفردية، إلا وهي Lgr5+ و الخلايا بانته.

هنا، نحن تصف نهجاً جديداً للانزيم أورجانويد أن يستفيد من قدرة بانته و Lgr5+ الخلايا للمنتسبين وشكل أورجانويدس عندما شارك مثقف. هذا النهج، الذي يشار إليه هنا "أورجانويد إعادة الفحص" (أورا)، يسمح بتعديل الوراثية والبيوكيميائية بانته أو Lgr5+ الخلايا الجذعية، تليها إعادة تشكيل في أورجانويدس. على هذا النحو، فإنه يسمح للتحليل الوظيفي للعنصرين الرئيسيين في مكانة الخلايا الجذعية المعوية.

Introduction

ظهارة الأمعاء هو الأكثر سرعة الذاتي تجديد الأنسجة في جسم الثدييات، وقد تم على هذا النحو، هدفا لعدد كبير دراسات الرامية إلى تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية البالغة الذين يقيمون في الجزء السفلي من سرداب من Lieberkühn، اعتماداً على إشارات Wnt المتعارف عليه1والمخصصة بالتعبير عن الجين Lgr5 . جدير بالذكر أن الخلايا الجذعية Lgr5+ الذي كان واقفاً وتدعمها الخلايا المتخصصة المتخصصة، أي خلايا بانيث، التي تعتمد أيضا على Wnt يدل على نضوج2. معا، هذه أنواع الخلايا اثنين تكمن وراء الذاتي تجديد البطانة الظهارية المعوية والحفاظ على توازن التماثل الساكن اليومي: Lgr5+ تقسيم الخلايا الجذعية سريعاً، وأن تؤدي إلى السلف وأكثر تخصصا الأمعاء الظهارية الخلايا؛ خلايا بانته توفر عوامل أساسية متخصصة (مثلاً، لو Dll1، Wnt3،) إلى Lgr5+ الخلايا الجذعية2. تم استغلاله كأداة تجريبية لتوفير نظرة ثاقبة العمليات مثل الذاتي تجديد قدرة الخبايا المعوية عند مطلي السابقين فيفو لتشكيل هياكل المنظمة وتجديد ذاتي يسمى أورجانويدس، أو "ميني-الشجاعة"، و التباين في الظروف العادية والمرضية بما في ذلك السرطان4. وقد أقيمت الثقافات أورجانويد من أنسجة عدة، بما في ذلك الأمعاء، البنكرياس، والكبد والكلى، ومن الماوس والعينات البشرية4. طريقة استخراج وعوامل النمو المستخدمة لتطوير هذه الثقافات أورجانويد الخاصة بالانسجة والمصممة لدفع التمايز النسب المتعددة وتحاكي أكبر قدر ممكن من الخلايا الجذعية مكانة الأصلي المجراة في. وقد أورجانويدس التطبيقات المحتملة بما في ذلك معالجة الأمراض الوراثية، وتقييم الفعالية العلاجية في السرطان، وتحليل المخدرات سمية، أو دراسة organogenesis في المختبر5.

عموما، القيد الرئيسي للثقافات أورجانويد عندما أنشأت من عينات الأنسجة عدم التحديد في الخلية. على سبيل المثال، لا تسمح أورجانويدس المعوية المنشأة من الخبايا المعوية كله تحليل المكونات الخلوية الفردية ضمن المصدر الأنسجة (مثلاً، تحتوي على الأقبية كلها Lgr5+، بانته، و الخلايا السلف).

هنا، يمكننا وصف أسلوب رواية، يشار إلى أورا، الذي يجمع بين مزايا الثقافات أورجانويد المعوية مع التحليل الوظيفي لعناصرها الأساسية، إلا وهي الجذعية (Lgr5+) والخلايا المتخصصة (بانته). ويتحقق ذلك من خلال قدرة فريدة من نوعها بانيث والخلايا Lgr5+ المنتسبين فعلياً مع بعضها البعض عندما شارك المحتضنة وتؤدي إلى أورجانويدس2،،من610. ونحن استغل هذه الميزة وقبل يعامل أنواع الخلايا اثنين على حدة قبل السماح لهم بتشكيل أورجانويدس. عند القيام بذلك، يمكن أن يتعرض كل مكون من مكونات الخلية لأي المخدرات معين أو عامل النمو، مثبط البيوكيميائية، التعديل الوراثي أو العلاج الكيميائي قبل إعادة تشكيل وتكوين أورجانويد. ولذلك، استخدام مقايسة أورا سوف تسمح للبت في ما إذا كان العلاج من المخدرات محددة أو التحوير الوراثي له تأثير محددة على الخلايا الجذعية أو نظيرتها المتخصصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد فعلت جميع الإجراءات وفقا للقوانين المحلية الرفق بالحيوان، والمبادئ التوجيهية.

1-إعداد أدوات ووسائط الثقافة وأطباق

  1. مجموعة اﻷوتوكﻻف 1 مقص المعوية، ومقص عادي والملقط في حاوية معقمة.
  2. 96-فضلا عن مكان (مسطحة القاع) طبق في حاضنة في 37 درجة مئوية.
  3. إعداد 10 مل من إكمال الثقافة المتوسطة مع الكواشف المسرودة في الجدول للمواد.
  4. احتضان المتوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  5. ذوبان الجليد تشكيل الغشاء بوضعه في دلو الجليد. سوف يصبح الغشاء الطابق السفلي المعاد تشكيلها السائل في 4 درجات مئوية.
  6. ملء 4 أطباق بيتري مع المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات أو برنامج تلفزيوني المختصر (4 درجات مئوية).

2-عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة

  1. التضحية باستنشاق أول أكسيد الكربون2 ماوس Lgr5-اجفب-إيريس-كريرt2 على خلفية C57BL6/ي. تشريح الصفاق طوليا مع زوج من مقص.
  2. عقد المعدة مع الملقط وقطع عليه مستعرضة في نصف.
  3. باستخدام مقص المعوية من الآن فصاعدا، سحب الأمعاء ووضعه في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: لديك مقص معوي حاد وتلميح غير حادة. تلميح هذه المقصات حادة يراد لا تضر العمارة سرداب-زغابة أثناء فتح الأمعاء.
  4. ابدأ بوضع الحافة حادة في المعدة ودفعها بلطف من خلال بواب. المضي قدما من خلال قطع بالمقص وسحب مع الملقط.
  5. بمجرد فتح الأمعاء الدقيقة كلها طوليا، غسله في برنامج تلفزيوني الباردة خلال عقد مع الملقط وشطفه برفق في حل برنامج تلفزيوني مع الحركات على شكل U.
  6. مرة واحدة يتم مسح جميع مخلفات البراز، انتقل إلى تسطيح الأمعاء على قطع مجلس، لومينال الجانب الأعلى. الجانب لومينال يتم التعرف عليها بسهولة بغياب الأوعية الدموية ومظهره الباهت بالمقارنة مع الجزء الخارجي.
  7. مع شريحة زجاجية، بلطف إزالة الزوائد بتجريف الأرض الأمعاء. تنفيذ هذه الخطوة مرتين على طول كامل للأنسجة.
  8. قطع الأمعاء الدقيقة مع شفرة جراحية معقمة إلى قطع 2-5 ملم.
  9. ضع أجزاء الأمعاء الصغيرة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  10. تنظيف الأجزاء الأنسجة، إزالة أية شوائب المتبقية التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً في برنامج تلفزيوني. تجاهل المادة طافية وكرر هذه الخطوة حتى برنامج تلفزيوني واضح تماما.
  11. إضافة برنامج تلفزيوني الباردة 15 مل، لتحقيق الحجم الإجمالي النهائي لبرنامج تلفزيوني إلى 25 مل. إضافة حمض الإيثيلين 2 مم (يدتا) واحتضانها لمدة 45 دقيقة على اسطوانة في 4 درجات مئوية.
  12. تجاهل برنامج تلفزيوني/يدتا.
  13. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني، وفصل في الأقبية بقسوة بيبيتينج أجزاء الأنسجة صعودا وهبوطاً (ثلاث مرات على الأقل). جمع المادة طافية.
  14. كرر الخطوة 2.13 أربع مرات. إضافة الثقافة المتوسطة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 50 مل.
  15. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (300 غرام x لمدة 5 دقائق).
  16. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من الثقافة المتوسطة وبيليه في الأقبية بالطرد المركزي (80 x ز لمدة 3 دقائق).

3. إعداد وحيد الخلية

  1. تجاهل المادة طافية أقبية الأعلاف وريسوسبيند لهم في 1 مل التربسين مثل الإنزيمات جنبا إلى جنب مع 50 ميليلتر الدناز (50 ميكروغرام/مل).
  2. احتضان الخلايا في حمام مائي عند 32 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  3. أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة. ننأى الأقبية في الخلايا المفردة بقسوة بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات على الأقل.
  4. تصفية الحل من خلال مصفاة 40 ميكرومتر (التخلص من كتل وغيرها من الشوائب) وبيليه الخلايا المفردة في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.

4-التدفق الخلوي والطلاء

  1. إعداد 50 مل الحل الملح مخزنة في هانك x 1 أو HBSS/2% البقر الجنين المصل (FCS) الحل وريسوسبيند بيليه في 1 مل لكل 10 من6 خلايا
  2. إضافة إلى خلية تعليق لين BV421(CD31، CD45، TER119) بتركيز 1: 100، و CD24-آسيا والمحيط الهادئ و CD117-PE على حد سواء بتركيز 1: 250 الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة.
  3. نوع Lgr5+ الخلايا الجذعية والخلايا بانته إلى انخفاض منفصلة ربط الأنابيب. لمزيد من التفاصيل حول الفرز بروتوكولات من أجل Lgr5+ وخلايا بانته، يرجى الاطلاع على روث et al. 7 و Schewe et al. 6
    1. أجهزة الطرد المركزي خلايا تم فرزها في ز 300 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر المتوسطة مع المكونات المذكورة كما هو الحال في 1.3 (انظر الجدول للمواد).
  4. (مثلاً، بتعديل المواد الكيميائية أو الوراثية) علاج الخلايا بانته (n = 2000) أو الخلايا الجذعية Lgr5+ (n = 2000).
    1. لعلاج الخلايا، استخدم 5 ميليلتر من تعداء الحويصلية بوساطة كاشف في إجمالي حجم 100 ميليلتر ثقافة متوسطة وصغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA) بتركيز 100 نانومتر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ل siRNA أو الوقت اللازم للتعديل الذي تم اختياره.
  5. تغسل الخلايا مرتين في 500 ميليلتر الثقافة المتوسطة.
  6. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند الخلايا في 10 ميليلتر الثقافة المتوسطة.
  7. تجمع العنصرين الخلوية (بانته أو Lgr5+ الخلايا) في الحجم الإجمالي ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت 20
  8. شارك احتضان بانته والخلايا Lgr5+ لمدة 10 دقائق في الرايت
  9. إزالة 10 ميليلتر من المادة طافية وترك غضروف السائل للتأكد لم نضح بيليه الخلية.
  10. إضافة 30 ميليلتر من الغشاء المعاد تشكيلها للخلايا لإجمالي حجم 40 ميكروليتر، ريسوسبيند الخلايا ولوحة في لوحة جيدا 96 المعالجون مسبقاً. بعد 10 دقيقة، إضافة 200 ميليلتر من المتوسطة كاملة (انظر الجدول للمواد). تغير متوسط كل 48 ساعة.
  11. عد تعدد أورجانويد في اليوم الخامس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح التحليل إعادة تشكيل أورجانويد تحليل المكونات الأساسية المتخصصة والخلايا الجذعية ظهارة الأمعاء، أثبت هنا صغيرة تدخل الجيش النيبالي الملكي (siRNA) الجين Apc وظيفية منفصلة.

لتحقيق هذا الهدف، علينا أولاً تستخدم خلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفصل 8000 Lgr5+ الخلايا والخلايا بانته 6000 من الفطرية C57BL6/ياء الفئران. ويرد في الشكل 1 ألف، مخطط انسيابي للمقايسة أورا. وقيمت أورجانويد إعادة تشكيل القدرات التي تفرخ الخلايا Lgr5+ مع النوكليوتيد siRNA الموجهة ضد مرناً آسيا والمحيط الهادئ أو يشمل تسلسل مجمعة (SCR) كعنصر تحكم. بعد العلاج، والخلايا Lgr5+ نفس معاملة siRNA كانت أما مطلي بصورة مباشرة في أورجانويد المتوسطة/إعادة تشكيل غشاء الطابق السفلي، أو المحتضنة مع عدد متساو من الخلايا بانته غير المعالجة ومطلي في وقت لاحق من. كعنصر تحكم، كانت مطلي غير المعالجة Lgr5+ خلايا مفردة (أيدون خلايا بانيث) لتحديد عدد أورجانويدس المستمدة من الخلايا Lgr5+ غير المعالجة. وعلاوة على ذلك، كعنصر إضافي، كانت مطلي بانته الخلايا وحدها للتحقق من خلفية تشكيل أورجانويد المستمدة من تلوث بانته-Lgr5 دوبليتس الخلية فرز في بوابة الخلية بانته. كما هو متوقع، ضربة قاضية وساطة siRNA الجين Apc مورين في الخلايا الجذعية Lgr5+ (وتفعيل الناتجة مسار الإشارات Wnt/بيتا-كاتينين المتعارف عليه) تأثرا إيجابيا تعدد أورجانويد بالمقارنة مع نظرائهم غير المعالجة أو عنصر التحكم المجمعة (الشكل 1B). تفعيل Wnt التأسيسي أنقذ أيضا الحاجة إلى الخلايا بانته، كما ذكر سابقا1. وعلاوة على ذلك، ظهرت هذه أورجانويدس جوفاء مجالات (الماغنيسيوم)، النمط الظاهري وصفاً جيدا آسيا والمحيط الهادئ-المسخ أو حفز Wnt أورجانويدس (الشكل 1، الفريق 1)، بالمقارنة مع مورفولوجية لتلك التي تم الحصول عليها من الخلايا بانته-Lgr5 8،دوبليتس (الشكل 1 ج، الفريق 2)9. مجتمعة، هذه النتائج تدل على أن إعادة تشكيل خلايا بانته و Lgr5+ الخلايا يمكن أن تعطي فكرة على الآليات الخاصة بخلية داخل هذه الأنواع الخلية اثنين؛ تحليل الخصائص المورفولوجية أورجانويدس بالفحص المجهري يمكن أن تكون ذات قيمة في هذا الصدد منذ مورفولوجية أورجانويدس يعكس تكوين خلية (مثلاً، تشكل الماغنيسيوم Lgr5+ الخلايا فقط). هي معلمة هامة أخرى أن تؤخذ في الاعتبار تعقيد أورجانويد (مثلاً، عدد الأحداث مهدها سرداب).

Figure 1
الشكل 1. أثر siRNA وساطة ضربة قاضية ل آسيا والمحيط الهادئ في Lgr5+ الخلايا. (أ) تخطيط انسيابي الإجراءات التجريبية. Lgr5 اجفب المراسل الفئران (Lgr5اجفب-آيريس--creERT2)1 واستخدمت كمصدر Lgr5+ فرز الخلايا الجذعية. تم فرز الخلايا بانته ك المشار إليه وهو موضح سابقا6،7. (ب) لاحظ تعدد أورجانويد عند إعادة تشكيل الخلايا الجذعية Lgr5+ وبانته الخلايا. عندما الخلايا المشار إليها كانت pretreated مع النوكليوتيد siRNA الموجهة ضد الجيش الشعبي الكونغولي (siRNA Apc) أو سارعت تسلسل التحكم (SCR). وتشير العلامات النجمية إلى فروق معتد بها إحصائيا (n = 3، * p < 0.05 * * ف < 0.001). أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. (1) Lgr5+ الخلايا، والخلايا (2) Lgr5+ SCR، siRNA الخلايا Lgr5+ (3) آسيا والمحيط الهادئ، (4) خلايا Lgr5+ + خلايا بانيث، (5) Lgr5+ الخلايا siRNA Apc + بانته الخلايا، والخلايا بانته (6). (ج) صور الممثل من أورجانويدس المستمدة من siRNA الخلايا Lgr5+ (1) آسيا والمحيط الهادئ، (2) Lgr5+-بانته الخلايا. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أورا يسمح التحليل الوظيفي المكرر المكونات الأساسية اثنين من مكانة المعوية الخلايا الجذعية، هي خلايا بانته و Lgr5+ . هذا النهج قد استخدمت سابقا من قبل لنا ولغيرنا مع تعديلات طفيفة6،،من1011. نقدم هنا، الإجراء أورا كبروتوكول مختبر استنساخه وموحدة. أيضا، ونحن تقريرا عن آثار downregulation Apc في الخلايا الجذعية Lgr5+ ، كمثال على إمكانية تنفيذ الوراثية (أو البيوكيميائية6) تعديلات على المكونات الخلوية تم فرزها. جماعياً، تشير البيانات إلى أن siRNA وساطة ضربة قاضية آسيا والمحيط الهادئ يعزز وظيفة الخلايا الجذعية من خلايا Lgr5+ ، كما هو مبين بتعدد أورجانويد زيادة (الشكل 1B).

العديد من المزايا من استخدام الثقافات أورجانويد 3D المعوية قد أدرجت فعلا في ملاحظات4، بما في ذلك تشابه ملفتة للنظر للمنظمة مع ذلك من زغابة سرداب العمارة في فيفو، خاصة عند مقارنتها الهندسة المعمارية من أساليب الثقافة 2D القياسية مع خطوط الخلايا مخلدة. بيد أحد أوجه القصور الرئيسية في هذا الأسلوب هو أنه في معظم الحالات، أورجانويد الثقافات تنشأ من الخبايا المعوية كله، عملية تسمح بالتحليل الوظيفي من مكوناتها الفردية، وعلى وجه الخصوص، من مكانة وتنبع الخلايا، والممثلة هنا Lgr5+ وخلايا بانته، على التوالي.

أورا يتغلب على هذه القيود. يمكن فرز من الحيوان الخلايا الجذعية ومكانه بشكل منفصل وإعادة تشكيل لتوليد أورجانويدس. على هذا النحو، هذا النهج يتيح التحليل الوظيفي لهذين العنصرين الخلوية بنماذج الماوس يعمل فيها أما إجراء التعديلات الوراثية المحددة أو تتعرض لعوامل الإجهاد محددة (مثلاً، مفاجآت صيف دبي و/أو الوجبات الغذائية محددة)؛ أو عن طريق مباشرة تعديل الخلايا تم فرزها وراثيا (siRNA، كريسبر-Cas9) أو كيميائيا، قبل إعادة تشكيل لهم لتوليد أورجانويدس. ويمكن توظيف تعدد، مورفولوجيا، القدرات الذاتي تجديد، ومدى التمايز (وفي نهاية المطاف مدى التغيرات أعراض) من أورجانويدس الناتجة ك read-outs الوظيفية. في حالة التلاعب بالجينات، مثل siRNA، عندما لا يكون لها تأثير مورفولوجية واضحة، الخلايا ينبغي تحليله ساعة واحدة بعد تعداء للتحقق من صحة ضربة قاضية مرناً للفائدة. بانته و Lgr5+ يمكن أيضا فرز من الفئران المهندسة وراثيا مع طفرات مختلفة لدراسة ما إذا كانت الطفرات المختلفة في الخلايا الجذعية والمتخصصة تؤدي إلى تغير التفاعلات بين أنواع هذه الخلية اثنين وأورجانويد مختلفة تشكيل الكفاءة و/أو مورفولوجيا.

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول هي إزالة الزوائد (الخطوة 2.7) واستثارة الخلايا في HBSS/2%FCS (الخطوة 4، 1). إزالة الزوائد الحاسم لإثراء بانته و Lgr5+ خلايا تقع في الثلث السفلي من الأقبية وتحسين كفاءة الفرز. على الرغم من أن بروتوكولات نظام مراقبة الأصول الميدانية توحي عادة فرز الخلايا في برنامج تلفزيوني/سفح المنحدر القاري، زاد استخدام هبس بدلاً من برنامج تلفزيوني وأبقى خلية البقاء مستقرة طوال الوقت الفرز. خطوات هامة أخرى هي الخطوات 4.7 و 4.8، حيث المادية رابطة بانته و Lgr5+ الخلايا تسمح هذه الأنساب للنموذج دوبليتس التي سوف تؤدي في نهاية المطاف إلى أورجانويدس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفين لها أي مصلحة مالية المتنافسة أو غيرها تضارب المصالح

Acknowledgments

وأمكن هذه الدراسة بتمويل من "جمعية السرطان الهولندية" (كوف؛ EMCR 2012-5473) و "العالم السرطان البحث الصناديق الدولية" (WCRF؛ المشروع رقم 2014-1181)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F12 * Thermo Fisher Scientific 12634-010
Glutamax * Thermo Fisher Scientific 35050061 Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin * Thermo Fisher Scientific 15140122 Final concentration: 1%
Hepes * Thermo Fisher Scientific 15630080 Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF * Thermo Fisher Scientific PMG8041 Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin * Peprotech 250-38 Final concentration: 100 ng/ml
y27632 * Sigma Y0503 Final concentration: 10 µM
Jagged-1 * Anaspec Bio AS-61298 Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin * R&D systems 3474-RS-050 Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC Qiagen GS11789 Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019
CD24 APC Biolegend 101814
c-kit PE Biolegend 105808
BV 421 CD31 Biolegend 102424
BV 421 CD45 Biolegend 103134
BV421 TER119 Biolegend 116234
HBSS Thermo Fisher Scientific 14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J Jackson Laboratories 008875
Low binding tubes Eppendorf Z666548-250EA
Matrigel Corning 356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  2. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  5. Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
  6. Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
  7. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
  8. Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
  9. Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
  10. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
  11. Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، مسألة 129، القناة الهضمية المصغر أورجانويدس، Lgr5+ وقف الخلايا، خلايا بانيث، المعوية الخلايا الجذعية المتخصصة، أورجانويد إعادة تشكيل المقايسة، وثقافة المشارك المعوية
تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt,More

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt, M., Fodde, R. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (129), e56329, doi:10.3791/56329 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter