Summary
Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.
Abstract
Das Darmepithel zeichnet sich durch eine extrem hohe Fluktuationsrate. Bei Säugetieren ist die gesamte epitheliale Auskleidung innerhalb von 4-5 Tagen erneuert. Intestinaler Stammzellen befinden sich am unteren Rand der Krypten Lieberkühn, sind bestimmt durch die Expression des Lgr5 -Gens und Homöostase durch ihre charakteristische hohe proliferative Rate1erhalten. In den Dünndarm Lgr5+ Stammzellen sind vermischt mit spezialisierten sekretorischen Zellen Paneth-Zellen genannt. Paneth-Zellen sezernieren antibakterielle Verbindungen (d. h., Lysozym und Cryptdins/Defensine) und eine Kontrollfunktion auf die Darmflora ausüben. Vor kurzem wurde eine neue Funktion für Paneth Zellen, nämlich ihre Fähigkeit zur Nische unterstützen Lgr5+ Stammzellen durch mehrere wichtige Liganden Wnt3, EGF und Dll12entdeckt.
Als Ex-Vivo isoliert und in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix kultiviert, ganze Darm Krypten führen zu langlebigen und selbst erneuern 3D-Strukturen genannt Organellen, die Krypta-Villus sehr ähneln epitheliale Architektur des Erwachsenen Dünndarm3. Organoide Kulturen, wenn hergestellt aus ganzen Krypten, ermöglichen die Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von der intestinalen Stammzellnische allerdings ohne Adressierung des Beitrags der einzelnen Komponenten, nämlich der Lgr5+ und Paneth-Zellen.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur organoide Assays, die die Fähigkeit der Paneth nutzt und Lgr5+ Zellen verbinden und Organellen bilden wenn Co kultiviert. Dieser Ansatz, hier als "organoide Rekonstitution Assay" bezeichnet (ORA), ermöglicht die genetische und biochemische Änderung Paneth oder Lgr5+ Stammzellen, gefolgt von der Rekonstitution in Organellen. So ermöglicht es die Funktionsanalyse der zwei Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische.
Introduction
Das Darmepithel ist das am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im Säugetier-Körper und als solche wurde das Objekt von einer Vielzahl von Studien, die darauf abzielen, die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von adulten Stammzellen, die ihren Wohnsitz am unteren Rand der Krypta der Lieberkühn, zweckgebundene durch Expression des Lgr5 -Gens und kanonischer Wnt Signale1abhängig. Insbesondere sind Lgr5+ Stammzellen flankiert und unterstützt durch spezielle Nische Zellen, d.h. Paneth-Zellen, die auch abhängig von Wnt signalisieren für ihre Reifung2. Zusammen, diese beiden Zelltypen zugrunde liegen Selbsterneuerung der intestinalen epithelialen Auskleidung und die täglichen homöostatische Gleichgewicht zu bewahren: Lgr5+ Stammzellen schnell teilen und geben Anlass zu Vorläuferzellen und mehr spezialisierte intestinale epitheliale Zellen; Paneth-Zellen liefern wesentliche Nische Faktoren (z. B.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ Stammzellen-2. Die Kapazität der intestinalen Krypten wenn vergoldet ex Vivo , organisierte und selbst erneuernde Strukturen bilden Organellen oder "Mini-Mut", genannt wurde als ein experimentelles Werkzeug, um Einblick in Prozesse wie Selbsterneuerung ausgeschöpft und Differenzierung in normalen und pathologischen Bedingungen einschließlich Krebs4. Organoide Kulturen wurden aus mehreren Geweben, einschließlich der Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Nieren, Maus-und Humanproben4eingerichtet. Der Extraktionsmethode und die Wachstumsfaktoren eingesetzt, um diese organoide Kulturen entwickeln sind gewebespezifisch und Multi-Linie Differenzierung und imitieren so nah wie möglich der ursprünglichen Stammzellnische in-vivo. Organellen können potenzielle Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Erbkrankheiten, die Beurteilung der therapeutische Wirksamkeit bei Krebs, die Analyse der Medikamententoxizität oder das Studium der Organogenese in-vitro-5haben.
Insgesamt ist die wichtigste Einschränkung der organoide Kulturen als aus Gewebeproben einen Mangel der Zelle-Spezifität. Zum Beispiel Darm Organellen hergestellt aus ganzen Darm Krypten erlauben nicht die Analyse der einzelnen Zellbestandteile umfasste innerhalb der Gewebe-Quelle (z.B.ganze Krypten enthalten Lgr5+, Paneth, und Vorläuferzellen).
Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, genannt ORA, die die Vorzüge der intestinalen organoide Kulturen mit der Funktionsanalyse der grundlegendsten Komponenten, nämlich Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen verbindet. Dies geschieht durch die einzigartige Fähigkeit der Paneth und Lgr5+ -Zellen um körperlich zu verknüpfen mit einander wenn Co inkubiert und Anlass zu Organellen2,6,10 geben. Wir nutzten diese Funktion und vorbehandelt zwei Zelltypen einzeln vor, so dass sie Organellen zu rekonstruieren. Wenn Sie dies tun, kann jede Zelle-Komponente bestimmten Droge, Wachstumsfaktor, biochemische Inhibitor, Gentechnik oder chemische Behandlung vor der Rekonstitution und organoide Bildung ausgesetzt werden. Deshalb wird mit der ORA-Assay erlauben die Bestimmung, ob eine spezifische medikamentöse Behandlung oder gentechnische Veränderung hat eine spezifische Wirkung auf die Stammzellen oder ihre Nische Pendant.
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Protocol
Alle Verfahren wurden nach lokalen Tierschutz Gesetze und Richtlinien durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte
- Autoklav 1 Satz Darm Schere, normalen Scheren und Pinzetten in einen sterilen Behälter.
- Statt einer 96-Well (Flachboden) Gericht in einem Inkubator bei 37 ° C.
- Bereiten Sie 10 mL komplette Kulturmedium mit den Reagenzien in Tabelle Materialien aufgeführt.
- Inkubieren Sie das komplette Medium bei 37 ° C im Wasserbad.
- Tauen Sie rekonstituierte Basalmembran, indem man sie in einen Eiskübel. Die rekonstituierte Basalmembran wird bei 4 ° C flüssig werden.
- Füllen Sie 4 Petrischalen mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder abgekürzt PBS (4 ° C).
2. Isolierung der kleinen Darm Krypten
- Opfern von CO2 Inhalation Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 Maus auf einem C57BL6/J-Hintergrund. Zerlegen Sie das Peritoneum längs mit einer Schere.
- Halten Sie den Magen mit der Zange und quer in zwei Hälften geschnitten.
- Mit der intestinalen Schere von nun an, ziehen Sie den Darm und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS.
Hinweis: Darm Scheren haben eine scharfe und eine stumpfe Spitze. Die stumpfe Spitze diese Schere soll nicht die Krypta-Villus Architektur beschädigt beim Öffnen des Darms. - Beginnen Sie damit die stumpfe Spitze in den Magen, und schieben Sie es durch den Pylorus. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Schere schneiden und mit der Zange.
- Sobald der gesamte Dünndarm längs geöffnet wird, indem Sie es mit der Zange halten in kaltem PBS waschen Sie und spülen Sie ihn sanft in die PBS-Lösung mit u-förmigen Bewegungen.
- Sobald die Hocker Reste gerodet werden, fahren Sie mit den Darm auf ein Schneidebrett, luminalen Seite nach oben zu glätten. Die luminalen Seite ist leicht erkennbar durch das Fehlen der Blutgefäße und durch sein blasses Aussehen im Vergleich zu den äußeren Teil.
- Entfernen Sie mit einer Glas-Folie vorsichtig die Zotten durch Abkratzen der abgeflachten Darms. Führen Sie diesen Schritt zweimal über die gesamte Länge des Gewebes.
- Schneiden Sie der Dünndarm mit einer sterilen chirurgischen Klinge in 2-5 mm Stücke.
- Legen Sie die kleinen Darm Fragmente in ein 50 mL-Tube mit 10 mL Eis kaltem PBS.
- Reinigen Sie die Gewebefragmente, entfernen alle restlichen Verunreinigungen durch pipettieren sie rauf und runter in die PBS. Verwerfen Sie überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die PBS völlig klar ist.
- Fügen Sie 15 mL kaltem PBS, um das endgültige Gesamtvolumen der PBS zu 25 mL. Fügen Sie 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 45 min auf einer Walze bei 4 ° c inkubieren
- Entsorgen Sie die PBS/EDTA.
- Fügen Sie 10 mL PBS und lösen Sie die Krypten, indem die Gewebefragmente Pipettieren hart nach oben und unten (mindestens dreimal). Den Überstand zu sammeln.
- Wiederholen Sie Schritt 2.13 viermal. Fügen Sie zu einem Endvolumen von 50 mL Kulturmedium.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation (300 X g für 5 min).
- Das Pellet in 10 mL Kulturmedium Aufschwemmen und pellet die Krypten durch Zentrifugieren (80 X g für 3 min).
3. einzelne Zelle Vorbereitung
- Verwerfen den überstand die gebeizte Krypten und ihnen in 1 mL Trypsin Like-Enzyme zusammen mit 50 µL Aufschwemmen DNAse (50 µg/mL).
- Inkubieren Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 32 ° C für 2 min.
- 10 mL Kulturmedium hinzugeben. Die Krypten in Einzelzellen zu distanzieren, hart Pipettieren oben und unten mindestens 5 Mal.
- Filtern Sie die Lösung durch ein 40 µm-Sieb (um Klumpen und andere Verunreinigungen zu beseitigen) und pellet-Einzelzellen 300 X g für 5 min.
(4) flow Cytometry und Beschichtung
- 50 mL 1 X Hank gepufferte Salzlösung oder HBSS/2% fetalen Kuh Serum (FCS) Lösung vorbereiten und das Pellet in 1 mL für jeden 106 Zellen Aufschwemmen
- Hinzu kommt die Zellsuspension BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) in einer Konzentration von 1: 100, und CD24-APC und CD117-PE sowohl bei einer Konzentration von 1: 250 Antikörper für 30 Minuten.
- Art Lgr5+ Stammzellen und Paneth Zellen in separaten Low binden Röhren. Einzelheiten zur Sortierung Protokolle für Lgr5+ und Paneth Zellen, siehe Roth Et Al. 7 und Schewe Et al. 6
- Zentrifuge der sortierten Zellen bei 300 X g für 5 min. der Zellen in 100 µL Medium mit den Komponenten wie 1.3 beschrieben Aufschwemmen (siehe die Tabelle der Materialien).
- Behandeln (z.B.durch chemische oder genetische Modifikation) Paneth-Zellen (n = 2000) oder die Lgr5+ -Stammzellen (n = 2000).
- Um Zellen zu behandeln, verwenden 5 µL der Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenz in einem Gesamtvolumen von 100 µL Nährmedium und kleine interferierende RNA (SiRNA) in einer Konzentration von 100 nM. 30 min bei 37 ° C für SiRNA oder für die notwendige Zeit für die gewählten Modifikation inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in 500 µL Kulturmedium.
- 300 X g für 5 min Zentrifugieren und die Zellen in 10 µL Kulturmedium Aufschwemmen.
- Bündeln die beiden zellulären Komponenten (Paneth oder Lgr5+ Zellen) in einer 20 µl Gesamtvolumen und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT
- Gemeinsam brüten die Paneth und Lgr5+ Zellen für 10 min bei RT
- 10 µL des Überstands und lassen ein Meniskus Flüssigkeit um sicher zu sein, nicht die Zelle Pellet Aspirieren.
- Die Zellen für ein Gesamtvolumen von 40 µL 30 µL rekonstituierte Basalmembran hinzu, Aufschwemmen der Zellen und in eine vorgewärmte 96-well-Platte-Platte. Nach 10 min, 200 µL kompletten Medium hinzufügen (siehe die Tabelle der Materialien). Wechsel-Medium alle 48 h.
- Graf organoide Multiplizität am 5. Tag.
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Representative Results
Die organoide Rekonstitution Assay ermöglicht die separate funktionelle Analyse der wesentlichen Nische und Stammzellforschung Komponenten des Darmepithels, hier durch kleine interferierende RNA (SiRNA) des Apc -Gens nachgewiesen.
Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir zuerst verwendet Fluoreszenz aktivierte Zelle sortieren (FACS) um 8000 Lgr5+ und 6000 Paneth Zellen von Inzucht C57BL6/J Mäusen zu trennen. In Figur 1aist ein Flussdiagramm des ORA Tests dargestellt. Organoide Rekonstitution Kapazität wurde durch Inkubation Lgr5+ Zellen mit SiRNA Oligonukleotide gegen die mRNA des Apc beurteilt oder umfasst eine verschlüsselte Sequenz (SCR) als Kontrolle. Nach der Behandlung wurden die gleichen SiRNA behandelten Lgr5+ Zellen entweder direkt in organoide Medium/rekonstituiert Basalmembran, vergoldet oder mit einer gleichen Anzahl von unbehandelten Paneth Zellen inkubiert und anschließend verchromt. Als Kontrolle wurden allein unbehandelte Lgr5+ Zellen überzogen (d. h.ohne Paneth Zellen) zu bestimmen, die Anzahl der Organellen aus unbehandelten Lgr5+ Zellen abgeleitet. Darüber hinaus als eine zusätzliche Kontrolle wurden Paneth Zellen allein überzogen, um zu überprüfen, für den Hintergrund des organoide Bildung abgeleitet von der Verschmutzung der Paneth-Lgr5 Zelle Dubletten im Paneth Zelle Tor sortiert. Wie erwartet, beeinflusst SiRNA vermittelter Knockdown von murinen Apc -gen in Lgr5+ Stammzellen (und die daraus resultierenden Aktivierung des kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg) positiv organoide Vielheit gegenüber unbehandelten Gegenstücke oder das Rührei-Steuerelement (Abbildung 1 b). Die konstitutive Aktivierung des Wnt rettete auch die Forderung nach Paneth Zellen, wie bereits berichtet1. Darüber hinaus erschien diese Organellen wie Hohlkugeln (Sphäroide), eine gut beschriebene Phänotyp für Apc-Mutant oder Wnt-stimulierten Organellen (Abbildung 1, Gruppe 1), im Vergleich mit der Morphologie von denen, die von Paneth-Lgr5 Zelle Dubletten (Abbildung 1 C, Gruppe 2)8,9. Gemeinsam, diese Ergebnisse zeigen, dass Neuaufbau Paneth Zellen und Lgr5+ Zellen können geben Einblick in zellspezifische Mechanismen innerhalb dieser zwei Zelltypen; morphologische Analyse der Organellen durch Mikroskopie kann in dieser Hinsicht wertvoll sein, da die Morphologie der Organellen die Zelle Zusammensetzung widerspiegelt (z. B.Sphäroide werden gebildet durch Lgr5+ nur Zellen). Ein weiterer wichtiger Parameter berücksichtigt werden, ist die Komplexität der organoide (z.B. die Anzahl der Krypta angehende Ereignisse).
Abbildung 1. Wirkung von SiRNA vermittelte Knockdown von Apc in Lgr5+ Zellen. (A) Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens. Lgr5 EGFP Reporter Mäuse (Lgr5EGFP IRES creERT2)1 waren beschäftigt, als eine Quelle von Lgr5+ Stammzellen sortiert. Paneth-Zellen wurden als angegeben und die zuvor beschriebenen6,7sortiert. (B) organoide Mannigfaltigkeit beobachtet nach Rekonstitution von Lgr5+ Stammzellen und Paneth Zellen. Wenn angegebenen Zellen mit SiRNA Oligonukleotide gegen Apc (SiRNA Apc) vorbehandelt wurden oder Rührei Steuersequenz (SCR). Die Sternchen zeigen statistisch signifikante Unterschiede (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Fehlerbalken beziehen sich auf SD (1) Lgr5+ -Zellen, Zellen (2) Lgr5+ , SCR, (3) Lgr5+ Zellen SiRNA Apc, (4) Lgr5+ Zellen + Paneth Zellen, (5) Lgr5+ SiRNA Apc + Paneth-Zellen, (6) Paneth-Zellen. (C) repräsentative Bilder von Organellen (1) Lgr5+ Zellen SiRNA Apc, (2) Lgr5+- Paneth Zellen abgeleitet. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die ORA ermöglicht die raffinierte funktionelle Analyse von zwei wesentlichen Komponenten der intestinalen Stammzellnische, nämlich Lgr5+ und Paneth Zellen. Dieser Ansatz wurde bisher von uns und anderen mit leichten Modifikationen6,10,11eingesetzt. Hier präsentieren wir Ihnen das ORA-Verfahren als eine reproduzierbare und standardisierte Laborprotokoll. Außerdem berichten wir über die Auswirkungen der Apc Herabregulation in Lgr5+ Stammzellen, als Beispiel für die Möglichkeit der Durchführung von genetischen (oder biochemischen6) Änderungen an den sortierten zellulären Komponenten. Kollektiv, die Daten zeigen, dass SiRNA vermittelter Knockdown von Apc verbessert die Stammzell-Funktion Lgr5+ Zellen, wie durch die erhöhte organoide Multiplizität (Abbildung 1 b).
Einige Vorteile der Verwendung von intestinalen 3D organoide Kulturen sind bereits verzeichnet worden, in Bewertungen4, einschließlich die verblüffende Ähnlichkeit ihrer Organisation mit derjenigen der Krypta-Villus Architektur in Vivo, insbesondere im Vergleich zu den Architektur von standard 2D Kulturmethoden mit immortalisierte Zelllinien. Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist jedoch, dass in den meisten Fällen, organoide, die Kulturen von ganzen Darm Krypten, ein Verfahren etabliert sind, die nicht, die funktionelle Analyse der einzelnen Komponenten und zulässt insbesondere über den Stamm und die Nische Zellen, hier vertreten durch Lgr5+ und Paneth Zellen, beziehungsweise.
Die ORA überwindet diese Beschränkungen. Stamm-und Nische können separat sortiert vom Tier und rekonstituiert Organellen zu generieren. So, dieser Ansatz ermöglicht die funktionelle Analyse dieser beiden zellulären Komponenten durch entweder beschäftigen Maus-Modellen, die mit bestimmten genetischen Veränderungen oder ausgesetzt bestimmte Stressfaktoren (z.B., DSS und/oder spezielle Diäten); oder direkt die sortierten Zellen genetisch zu ändern (SiRNA, CRISPR-Cas9) oder biochemisch, vor dem Neuaufbau damit Organellen zu generieren. Die Multiplizität, Morphologie, Selbsterneuerung Kapazität und Ausmaß der Differenzierung (und schließlich das Ausmaß des metaplastischen Änderungen) von der daraus resultierenden Organellen können als funktionelle Auslesen eingesetzt werden. Im Falle der genetischen Manipulation, wie SiRNA sollte eine morphologische Wirkung nicht hervorgeht, Zellen eine Stunde nach Transfektion, den Zuschlag für die mRNA des Interesses zu validieren analysiert werden. Paneth und Lgr5+ von Mäusen, die gentechnisch mit verschiedenen Mutationen zu untersuchen, ob verschiedene Mutationen in Stamm-und Nischen zu veränderten Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Zelltypen und verschiedene organoide führen auch sortiert werden können Bildung-Effizienz und/oder Morphologie.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind die Entfernung der Zotten (Schritt 2.7) und die Wiederfreisetzung der Zellen im HBSS/2%FCS (Schritt 4.1). Entfernung der Zotten ist entscheidend für die Paneth bereichern und Lgr5+ Zellen befindet sich im unteren Drittel der Krypten und zur Verbesserung der Effizienz der Sortierung. Obwohl FACS Protokolle häufig sortieren von Zellen in PBS/FCS nahe, die Verwendung von HBSS anstelle von PBS erhöht und Zellviabilität während der Sortierung Zeit stabil gehalten. Weitere wichtige Schritte sind Schritte 4.7 und 4.8, wo körperliche Vereinigung von Paneth und Lgr5+ Zellen ermöglicht dieser Linien zu Form Dubletten, die schließlich zu Organellen führen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte
Acknowledgments
Diese Studie wurde ermöglicht durch die Finanzierung von der niederländischen Krebsgesellschaft (KWF; EMCR 2012-5473) und World Cancer Research Fonds International (WCRF, Projekt Nr. 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
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