Bioengineering

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

Published: November 20, 2017 doi: 10.3791/56329

Matthias Schewe¹, Andrea Sacchetti¹, Mark Schmitt¹, Riccardo Fodde¹

¹Department of Pathology, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center

Summary

תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5⁺), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.

Abstract

האפיתל במעי מאופיין על ידי שיעור תחלופה מהירה בצורה קיצונית. ביונקים, הציפוי אפיתל כולו מתחדש תוך 4-5 ימים. תאי גזע בוגרים מעיים שוכנים בתחתית המופרש אמורים לעבור על ידי ביטוי של הגן Lgr5 , לשמור על הומאוסטזיס באמצעות שלהם האופיינית בקצב גבוה proliferative¹. לאורך כל המעי הדק, Lgr5⁺ תאי גזע שנטוו עם תאים הפרשה מיוחדים הנקראים תאי Paneth. תאי Paneth מפרישים חומרים אנטי בקטריאליים (קרי, ליזוזים ו cryptdins/defensins) ולעשות מאמץ תפקיד השליטה על הפלורה במעיים. לאחרונה, פונקציה הרומן התגלה עבור תאי Paneth, כלומר היכולת שלהם לספק תמיכה נישה לתאי גזע Lgr5⁺דרך מספר ליגנדים מפתח Wnt3, EGF ו- Dll1².

כאשר מבודדים לשעבר vivo ותרבותית בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית, כוכים מעיים כל להצמיח מאריכים וקרא עצמית חידוש מבנים תלת-ממד organoids המזכירים מאוד את הקריפטה-סיסי ארכיטקטורה האפיתל של המעי הדק למבוגרים³. תא צורב תרבויות, כאשר הוקמה מתוך כל כוכים, לאפשר המחקר של התחדשות עצמית ובידול של הגומחה תאי המעי, אך ללא התייחסות התרומה של מרכיבים בודדים, כלומר Lgr5⁺, תאי Paneth.

כאן, אנו מתארים את הגישה של הרומן וזמינותו תא צורב כי מנצל היכולת של Paneth ו Lgr5⁺ תאים כדי לשייך ויוצרים organoids כאשר ותרבותית משותפת. גישה זו, המכונים כאן "תא צורב שיחזור assay" (אורה), מאפשרת שינוי גנטי וביוכימי של Paneth או Lgr5⁺ תאי גזע, ואחריו שיחזור לתוך organoids. ככזו, היא מאפשרת ניתוח תפקודי של שני מרכיביה העיקריים של גומחת תאי גזע מעיים.

Introduction

האפיתל במעי הוא הרקמה ביותר במהירות עצמי המתחדש בגוף יונקים ו, בתור שכזה, היה מושא שפע של מחקרים שמטרתם זיהוי ואפיון פונקציונאלי של תאי גזע בוגרים המתגוררים בחלק התחתון של התת-קרקעי המופרש, תגייס לביטוי של הגן Lgr5 ותלוי ונ ט הקנוני אותות¹. ראוי לציין, תאי גזע Lgr5⁺מוקף, נתמך על ידי תאים נישה מיוחדים, קרי Paneth תאים, אשר גם תלוי ונ ט איתות שלהם התבגרות². יחד, מסוגי התאים שני ביסוד התחדשות עצמית של רירית אפיתל המעי, לשמר את האיזון homeostatic יומי: Lgr5⁺ תאי גזע במהירות לחלק, להצמיח קדמון, יותר והתמחה מעיים אפיתל תאים; תאי Paneth לספק נישה חיוני גורמים (למשל, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5⁺ גזע תאים². הקיבולת של מעיים כוכים כאשר מצופה ex-vivo כדי ליצור מבנים מאורגנים עצמי המתחדש שנקרא organoids, או "מיני-אומץ", נוצלה ככלי ניסיוני כדי לספק תובנות תהליכים כגון התחדשות עצמית, בידול בתנאים נורמליים ופתולוגיים כולל סרטן⁴. תא צורב תרבויות הוקמו מתוך מספר רקמות, לרבות המעי, הלבלב, הכבד, הכליה, העכבר והן דוגמאות האנושי⁴. שיטת החילוץ של גורמי גדילה המועסקים לפתח תרבויות תא צורב אלה הם רקמות ספציפיות נועד כונן מרובה שושלת היוחסין בידול ואת לחקות ככל האפשר את גומחת תאי גזע המקורי ויוו. Organoids ייתכן יישומים אפשריים כולל הטיפול של מחלות גנטיות, להערכת יעילות טיפולית בסרטן, הניתוח של רעילות התרופה או המחקר של organogenesis במבחנה⁵.

הכולל, המגבלה העיקרית של תרבויות תא צורב כאשר נוצרו מדגימות רקמה הוא חוסר תא-ירידה לפרטים. לדוגמה, מעיים organoids נוצרו מכוכים מעיים כל אינם מאפשרים הניתוח של רכיבים בודדים הסלולר הקיף בתוך המקור רקמות (למשל, מכילים כוכים כל Lgr5⁺, Paneth, ו ובתאים).

כאן, אנו מתארים שיטה, המכונה אורה, המשלבת את היתרונות של תרבויות תא צורב מעיים עם ניתוח תפקודי של מרכיביו הבסיסיים ביותר, כלומר גזע (Lgr5⁺) ותאים נישה (Paneth). זו מושגת באמצעות היכולת הייחודית של Paneth, Lgr5⁺ תאים לשיוך פיזית עם אחד לשני כאשר שיתוף מודגרות להצמיח organoids²^,⁶^,¹⁰. אנו ניצלו תכונה זו, טרום טיפול בנפרד את סוגי תאים שני מתנים את אותם צריך להשרות organoids. תוך כדי כל רכיב תא תיחשף כל נתון סמים, פקטורי גדילה, מעכב הביוכימי, ההנדסה הגנטית או טיפול כימי לפני שיחזור ויצירת תא צורב. לכן, שימוש וזמינותו אורה יאפשר הקביעה של הטיפול בתרופה מסוימת או ההנדסה הגנטית יש אפקט מסוים על תאי גזע או עמיתו הנישה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים נעשו על פי חוקים לרווחת בעלי חיים מקומיים והנחיות.

1. הכנת כלי נגינה, תרבות המדיה ומנות

אוטוקלב 1 סט של מעיים מספריים, מספריים רגילה, מלקחיים במיכל סטרילי.
מניחים צלחת 96-ובכן (בתחתית שטוח) בתוך אינקובטור ב 37 º C.
הכינו 10 מ"ל של מדיום תרבות שלמה עם ריאגנטים המפורטים בטבלה של חומרים.
דגירה המדיום מלאה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
הפשרת קרום המרתף משוקם על ידי הצבת זה דלי קרח. קרום המרתף משוקם יהפכו נוזליים ב 4 ° C.
למלא 4 צלחות פטרי עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח או PBS מקוצר (4 ° C).

2. בידוד של כוכים קטנים במעיים

מקריב על ידי שאיפת₂ CO עכבר - eGFP-IRES-CreER^t2 Lgr5על רקע C57BL6/J. לנתח את הצפק longitudinally עם מספריים.
להחזיק את הבטן עם המלקחיים, עד לפיצוץ ערמוני.
בעזרת המספריים מעיים מעכשיו, להוציא את המעי ולמקם אותו בצלוחית המכילה PBS.
הערה: מספריים מעיים יש פנייה חדה, עצה בוטה. הקצה הקהה של גזרי נועד כדי לא לגרום נזק הארכיטקטורה קריפטה-סיסי בעת פתיחת המעי.
להתחיל על ידי הצבת קצה קהה לתוך הקיבה ואקדם בעדינות השוער. המשך על ידי חיתוך עם המספריים ומושך עם המלקחיים.
ברגע המעי הדק כל נפתח longitudinally, לשטוף אותה ב- PBS קר על ידי החזקתה עם המלקחיים, בעדינות לשטוף אותה עם הפתרון PBS בתנועות בצורת U.
לאחר כל שאריות צואה נמחקים, להמשיך לשטח את המעי על קרש חיתוך, בצד luminal למעלה. הצד luminal הוא קל לזיהוי על ידי העדר של כלי דם ועל ידי מראה חיוור בהשוואה החלק החיצוני.
עם זכוכית להסיר בעדינות את villi על ידי גירוד המעי שעברו שיטוח. לבצע שלב זה פעמיים לאורך כל הרקמה.
לחתוך המעי הדק עם להב כירורגי סטרילי לחתיכות של 2-5 מ מ.
הצב השברים במעיים קטן בצינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של PBS קר קרח.
לנקות את השברים רקמות, הסרת כל הטומאות הנותרים על-ידי pipetting אותם מעלה ומטה ב-, טוב, מגניב. למחוק את תגובת שיקוע, חזור על שלב זה עד מגניב נקי לחלוטין.
הוסף PBS קר 15 מ"ל, כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS 25 מ. להוסיף 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולאחר תקופת דגירה של 45 דקות על גלגלת ב 4 º C.
למחוק את PBS/EDTA.
להוסיף 10 מ של PBS ולנתק את כוכים מאת בחומרה pipetting שברי רקמת למעלה ולמטה (לפחות שלוש פעמים). לאסוף את תגובת שיקוע.
חזור על שלב 2.13 ארבע פעמים. להוסיף תרבות בינונית להגיע נפח סופי של 50 מ.
גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (300 גר' x עבור 5 דקות).
Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של תרבות בינוני, גלולה של כוכים על ידי צנטריפוגה (80 g x במשך 3 דקות).

3. תא ותא הכנה

למחוק את תגובת שיקוע של כוכים pelleted, resuspend אותם ב 1 מ"ל טריפסין כמו-אנזימים יחד עם 50 µL DNAse (50 µg/mL).
דגירה התאים בתוך אמבט מים-32 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
להוסיף 10 מ של תרבות בינוני. מביצועם של כוכים לתוך תאים בודדים על-ידי בחומרה pipetting למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים.
לסנן את הפתרון דרך מסננת 40 µm (כדי למנוע גושים וזוהמה אחרים), גלולה את התאים ב g x 300 במשך 5 דקות.

4. flow Cytometry, ציפוי

להכין 50 מ של תמיסת מלח במאגר של האנק x 1 או HBSS/2% פרה עוברית סרום (FCS) פתרון, resuspend בגדר ב 1 מ"ל עבור כל 10⁶תאים
להוסיף תא ההשעיה לין BV421^–(CD31, CD45, TER119)-ריכוז של בטחונות, ואת CD24-APC CD117-PE שני-ריכוז של נוגדנים 1:250 למשך 30 דקות.
מיון Lgr5⁺ תאי גזע, תאי Paneth לנמוך נפרד מאגד צינורות. לפרטים על מיון פרוטוקולים עבור Lgr5⁺ , תאי Paneth, נא עיין רוט. et al. ⁷ ו. Schewe et al. ⁶
1. צנטריפוגה בתאים ממוינים ב g 300 x עבור 5 דק Resuspend התאים 100 µL בינוני עם הרכיבים תיאר כמו 1.3 (ראה את הטבלה של חומרים).
לטיפול (למשל, על ידי שינוי כימי או גנטי) תאי Paneth (n = 2000) או תאי גזע Lgr5⁺ (n = 2000).
1. כדי להתייחס תאים, להשתמש µL 5 של תרביות תאים בתיווך ליפוזום ריאגנט הנפח הכולל של 100 µL תרבות בינוני ו RNA מפריעות קטן (siRNA)-ריכוז של 100 ננומטר. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C עבור siRNA או הזמן הדרוש עבור השינוי שבחרת.
לשטוף פעמיים בתאים 500 µL תרבות בינוני.
צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend את התאים בינוני 10 של תרבות µL.
מאגר הרכיבים הסלולר שני (Paneth או Lgr5⁺ תאים) µl הנפח הכולל 20 ו צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-RT.
שיתוף דגירה של Paneth ו Lgr5⁺תאים 10 דקות ב- RT.
להסיר µL 10 של תגובת שיקוע ולהשאיר מניסקוס של נוזל כדי לוודא לרוקן לא בגדר התא.
להוסיף 30 µL של קרום המרתף משוקם על התאים עבור הנפח הכולל של 40 µL, resuspend את התאים, צלחת בצלחת טוב 96 ומחוממת מראש. לאחר 10 דקות, הוסף 200 µL בינוני מלא (ראה את הטבלה של חומרים). שינוי בינוני כל 48 שעות.
תא צורב Count ריבוי ביום 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תא צורב שיחזור וזמינותו מאפשר ניתוח פונקציונלי נפרדים של הרכיבים החיוניים נישה, תאי גזע של האפיתל במעי, הפגינו כאן על ידי RNA מפריעות קטן (siRNA) של הגן Apc .

כדי להשיג מטרה זו, אנו קודם מנוצל פלורסנט תא מופעל מיון (FACS) כדי להפריד בין 8000 Lgr5⁺תאים ותאים Paneth 6000 לבין עכברים C57BL6/J המפגרים. ב- איור 1a, מתואר בתרשים זרימה של אורה וזמינותו. תא צורב שיחזור קיבולת הוערכה על ידי המקננת תאים Lgr5⁺ עם oligonucleotides siRNA נגד את ה-mRNA של Apc או המקיף רצף מקושקשות (SCR) כפקד. לאחר הטיפול, שטופלו siRNA לאותם Lgr5⁺ התאים היו או ישירות מצופה תא צורב מחדש/בינוני קרום המרתף, או מודגרות עם מספר שווה של תאי Paneth לא מטופל, לאחר מכן מצופה החוצה. כפקד, לא מטופל Lgr5⁺ תאים מצופים לבד (כלומר, ללא תאי Paneth) כדי לקבוע את מספר organoids שמקורם תאים Lgr5⁺ ללא טיפול. יתרה מזאת, כמו פקד נוספים, תאי Paneth לבד מצופים כדי לבדוק הרקע של היווצרות תא צורב נגזר הזיהום של Paneth-Lgr5 תא doublets ממוינת השער תאי Paneth. כצפוי, siRNA נוקאאוט בתיווך של הגן Apc מאתר תאי גזע Lgr5⁺ (ובכל וכתוצאה מכך הפעלת מסלול איתות הקנוני ונ ט/β-catenin) מושפעת באופן חיובי ריבוי תא צורב בהשוואה עמיתיהם לא מטופל או את הפקד בצורה משובשת (איור 1B). הפעלת ונ ט מכוננת הציל גם את הדרישה תאי Paneth, כפי שדווחה בעבר¹. יתר על כן, organoids אלה הופיעו כדורים חלולים (spheroids), הפנוטיפ תיאר היטב עבור Apc-מוטציה או מגורה-חגיגת organoids (איור 1C, לוח 1), בהשוואה המורפולוגיה של אלה המתקבל Paneth-Lgr5 תא ⁸^,doublets (איור 1 C, לוח 2)⁹. באופן קולקטיבי, תוצאות אלו ממחישות את לשחזר תאי Paneth ו Lgr5⁺ תאים יכול לתת תובנה על מנגנונים תאים ספציפיים בתוך מסוגי התאים שני; ניתוח מורפולוגי של organoids על ידי מיקרוסקופ יכול להיות יקר במובן זה מאז המורפולוגיה של organoids משקף את הרכב התא שלהם (למשל, היוו spheroids על ידי Lgr5⁺ תאים בלבד). פרמטר חשוב נוסף כדי לקחת בחשבון הוא המורכבות תא צורב (למשל, מספר האירועים ניצני קריפטה).

איור 1. ההשפעה של siRNA מתווכת נוקאאוט של Apc ב- Lgr5⁺ תאים. תרשים זרימה של ההליך ניסיוני (א) . Lgr5 ^EGFP כתב עכברים (Lgr5^{EGFP-IRES-creERT2})¹ הועסקו כפי מקור Lgr5⁺ ממוין תאי גזע. תאי Paneth היו הממוינת המצוין, שתואר לעיל⁶^,⁷. (B) ריבוי תא צורב נצפתה על בנייתו מחדש של תאי גזע Lgr5⁺ ו- Paneth תאים. כאשר pretreated היו תאים המצוין עם siRNA oligonucleotides נגד Apc (siRNA Apc) או מקושקשות רצף הבקרה (SCR). הכוכביות מציינות הבדלים משמעותיים סטטיסטית (n = 3, * p < 0.05 * * p < 0.001). קווי שגיאה להפנות אל תאים SD. (1) Lgr5⁺ , (2) Lgr5⁺ תאים SCR, Lgr5⁺ (3) תאים siRNA Apc, (4) תאים Lgr5⁺ + תאי Paneth, (5) Lgr5⁺תאים siRNA Apc + תאי Paneth, תאי Paneth (6). (ג) להחליפן בתמונות של organoids נגזר Lgr5⁺ (1) תאי siRNA Apc, תאי - Paneth Lgr5⁺(2). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אורה מאפשר ניתוח פונקציונלי מעודן של שני מרכיבים חיוניים של הגומחה תאי המעי, כלומר Lgr5⁺ותאי Paneth. גישה זו כבר מועסקים בעבר עם שינויים קלים⁶^,¹⁰^,¹¹מאת, ואחרים. כאן, אנו מציגים את ההליך אורה כפרוטוקול מעבדה מתוקננת הדירים. בנוסף, אנחנו מדווחים על ההשפעות של Apc downregulation בתאי גזע Lgr5⁺, כדוגמה האפשרות של יישום גנטי (או ביוכימי⁶) שינויים מרכיבי התא הממוין. באופן קולקטיבי, הנתונים מראים את siRNA נוקאאוט בתיווך של Apc משפר את תפקוד תאי גזע תאים Lgr5⁺ , כמצוין על-ידי ריבוי מוגבר תא צורב (איור 1B).

מספר יתרונות השימוש תא צורב 3D מעיים תרבויות כבר צוינו הדעת⁴, כולל את הדמיון הבולט של הארגון שלהם עם זה של ה קריפטה-סיסי אדריכלות ויוו, במיוחד בהשוואה ל- ארכיטקטורה מפעולות תרבות 2D סטנדרטי עם שורות תאים מונצח. עם זאת, אחת המגבלות הגדולות של שיטה זו היא ברוב המקרים, תא צורב תרבויות הוקם מתוך כל המעי כוכים, תהליך אשר אינו מאפשר את אנליזה פונקציונלית של מרכיבים בודדים בפרט, של גזע ושל נישה תאים, כאן המיוצג על-ידי Lgr5⁺ , תאי Paneth, בהתאמה.

אורה מתגבר על מגבלות אלה. תאי גזע ונישה יכול להיות בנפרד ממוין מהחיה, מחדש ליצירת organoids. ככזה, גישה זו מאפשרת ניתוח תפקודי של שני המרכיבים הסלולר לפי מודלי העכבר המעסיקים או נושא ספציפי שינויים גנטיים או חשוף גורמים ספציפיים (למשל, DSS ו/או דיאטות מסוים); או על-ידי ישירות שינוי בתאים ממוינים גנטית (siRNA, CRISPR-Cas9) או מבחינה ביוכימית, לפני לשחזר אותם כדי לייצר organoids. הריבוי, מורפולוגיה, יכולת התחדשות עצמית וההיקף של בידול (וגם בסופו של דבר את היקף השינויים metaplastic) את organoids וכתוצאה מכך יכול להיות מועסק הקריאות פונקציונלי. במקרה של הנדסה גנטית, כגון siRNA, כאשר אפקט מורפולוגי אינו ניכר, תאים צריך להיות מנותח שעה לאחר תרביות תאים כדי לאמת את נוקאאוט של mRNA עניין. Paneth ו Lgr5⁺ ניתן גם למיין של עכברים מהונדסים גנטית עם מוטציות שונות ללמוד אם מוטציות שונות בגן תאי גזע ונישה להוביל שינו אינטראקציות בין אלה סוגי שני תאים תא צורב שונים היווצרות יעילות ו/או מורפולוגיה.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם הסרת villi (שלב 2.7) את resuspension של תאי HBSS/2%FCS (שלב 4.1). הסרת villi הוא קריטי כדי להעשיר Paneth ו Lgr5⁺ תאים ממוקם השליש התחתון של כוכים וכדי לשפר את היעילות של מיון. למרות FACS פרוטוקולים בדרך כלל מציעה מיון התאים ב- PBS/FCS, השימוש HBSS במקום PBS גדל, נשמרים תא הכדאיות יציבה לאורך כל הזמן המיון. צעדים חשובים אחרים הם שלבים 4.7 ו- 4.8, שבו הפיזי התאחדות Paneth ו Lgr5⁺ תאים מאפשר שושלות אלה כדי doublets טופס זה יהיה בסופו של דבר להצמיח organoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש עניין כספי מתחרים או אינטרסים אחרים

Acknowledgments

מחקר זה התאפשר על ידי מימון ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF; EMCR 2012-5473) את העולם סרטן מחקר קרנות הבינלאומי (WCRF; פרויקט מס ' 2014-1181)

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Final concentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Final concentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Final concentration: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium