腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

Summary

腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5⁺) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth) 細胞のニッチします。

Abstract

腸の粘膜上皮は、非常に急速な率が特徴です。哺乳類、全体の上皮をリニューアルして、4-5 日以内。成人の腸管幹細胞 Lieberkühn の陰窩の下部に存在するLgr5遺伝子の発現による計上、その増殖率が高い特徴的な¹を介して恒常性を維持します。、小腸全体Lgr5⁺パネート細胞と呼ばれる特殊な分泌細胞と幹細胞が混在しています。パネート細胞は (すなわちリゾチーム、cryptdins/ディフェンシン) 抗菌化合物を分泌して腸内細菌叢の制御の役割を発揮します。もっと最近、パネート細胞、すなわち Wnt3、EGF, および Dll1²としていくつかのキー配位子Lgr5⁺幹細胞ニッチ サポートを提供する能力の新たな機能が発見されています。

腸陰窩が長命に上昇を与えるex vivoを分離すると特定の成長因子と細胞外マトリックス成分の存在下で培養したとクリプト絨毛のような高い organoids と呼ばれる 3 D 構造の自己更新³大人の小腸の上皮のアーキテクチャです。Organoid 文化、全体の陰窩から確立されたとき個々 のコンポーネント、すなわち、 Lgr5⁺の貢献に対処せず、腸管幹細胞ニッチの分化と自己複製の研究を許可してパネート細胞。

ここでは、Paneth の能力の活用における分析への新しいアプローチについて述べるし、 Lgr5⁺は関連付けるオルガノイドを形成する細胞と共培養します。このアプローチは、ここで「organoid 再構成法」という (ORA) Paneth の遺伝学的および生化学的な変更をことができますまたはLgr5⁺幹細胞オルガノイドに再構成が続きます。そのため、腸管幹細胞のニッチの 2 つの主要なコンポーネントの機能解析をことができます。

Introduction

腸上皮は哺乳類の体内で最も急速に自己更新組織で、同定と地下室の下部に存在する大人の幹細胞の機能解析を目的とした研究の茄多のオブジェクトをされていますLieberkühn、 Lgr5遺伝子の発現による目的税とカノニカル Wnt 信号¹に依存しています。特に、 Lgr5⁺幹細胞は並ぶ、専門にされたニッチ細胞、すなわちパネート細胞で、また彼らの成熟²Wnt シグナルに依存によってサポートされています。一緒に、これらの 2 つの細胞型腸上皮の自己複製の根底にあるし、毎日恒常性平衡を保持: Lgr5⁺幹細胞は急速に分割し、前駆細胞に上昇を与えるより専門的な腸上皮細胞;パネート細胞に不可欠なニッチな要因 (例えば、Dll1 Wnt3、EGF) を提供するLgr5⁺幹細胞²。メッキ前のヴィヴォ組織と自己の構造を形成する organoids、または「ミニ根性」と呼ばれるとき腸陰窩の能力は、自己更新などのプロセスへの洞察力を提供するために実験的なツールとして悪用されていると分化癌⁴を含む正常および病的条件。Organoid 文化は、腸、膵臓、肝臓、腎臓、マウスおよびひと試料⁴からを含むいくつかの組織から確立されています。抽出法およびこれら器官毛細文化を開発する採用の成長因子が組織特異的多系統分化を駆動し、できるだけ元の幹細胞ニッチを模倣するように設計体内。Organoids 遺伝的疾患の治療、がんの治療効果、薬物の毒性の解析または器官培養⁵研究の評価を含む潜在的なアプリケーションがあります。

全体的にみて、organoid 文化組織サンプルから確立されたときの主な制限は、細胞特異性の欠如です。たとえば、腸陰窩から確立された腸オルガノイドは組織のソースの内で包含される個々 の細胞成分の分析を許可しない (例えば、全体の陰窩を含むLgr5⁺、パネートと前駆細胞)。

ここでは、手法、オラと呼ばれるの最も基本的なコンポーネント、すなわち幹 (Lgr5⁺)、ニッチ (Paneth) 細胞の機能解析と腸管における文化の利点を組み合わせたについて述べる。Paneth のユニークな能力を通してそしてLgr5⁺細胞に物理的に互いの共同培養 organoids^2,6,10に上昇を与えるとを関連付けます。我々 はこの機能の利点を取り、オルガノイドを再構成する前に個別に 2 つのセル型が前処理します。その際、各細胞成分はある薬剤、成長因子、生化学的阻害剤、遺伝子組み換え、または再構成と organoid 形成前に化学治療に公開できます。したがって、又は分析を使用すると、特定の薬物治療や遺伝子組み換えが幹細胞またはそのニッチ相手に特定の効果をあるかどうかの決定ができます。

Protocol

すべてのプロシージャは、動物愛護の法律および指針に従って行われました。

1. 楽器、文化、メディア、料理の準備

1. 腸はさみ、通常のはさみや滅菌コンテナーに鉗子のオートクレーブ 1 セット。
2. 37 ° C でインキュベーターの場所 96 ウェル (フラットボトム) の皿
3. 材料の表に記載されている試薬を用いる完全な培養液 10 mL を準備します。
4. 37 ° c 水のお風呂で完全培地を孵化させなさい。
5. 雪解けは、氷のバケツに置くことで基底膜を再構成しました。再構成の基底膜は 4 ° C で液体になります。
6. 冷たいリン酸緩衝生理食塩水または省略された PBS (4 ° C) で 4 枚のペトリ皿を埋めます。

2. 小さな腸陰窩の分離

1. CO₂吸入によって C57BL6/J の背景にLgr5- eGFP IRES クレエ^t2マウスを犠牲に。縦はさみのペアで腹膜を解剖します。
2. 生検鉗子で胃を押しながら横方向に半分に切る。
3. さあ今から腸のはさみを使用して、腸を引き出し、PBS を含むペトリ皿に配置。
   メモ: 腸のはさみがある鋭い、鈍い先端。これらのはさみの鈍い先端は腸を開いている間クリプト絨毛アーキテクチャを損傷しないようにものです。
4. 胃に鈍い先端を配置することによって起動し、幽門をゆっくりします。はさみで切り、ピンセットで引っ張ってによって進みます。
5. 全小腸が縦に開かれる、鉗子で保持することによって冷たい PBS で洗い、軽く U 字の動きと PBS ソリューションでリンスします。
6. すべての便の残骸がクリアされれば腸内腔側をまな板の上を平らにするのに進みます。内腔側は血管の有無によって、その薄い外観外側の部分と比較するとわかりやすいです。
7. スライド ガラスと優しく削って平面的な腸絨毛を削除します。この手順では、組織の全体の長さに沿って 2 回。
8. 滅菌手術ブレードで 2-5 mm の部分に、小腸を切った
9. 10 mL の氷冷 PBS を含む 50 mL のチューブで腸の小片を置きます。
10. PBS の上下にそれらをピペッティングによる任意の残りの不純物を除去、組織片をクリーンアップします。上澄みを廃棄し、PBS が完全にクリアされるまでこの手順を繰り返します。
11. 15 mL 冷 PBS、25 mL の PBS の合計の最終巻をさせるを追加します。2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を加え、4 ° C でローラーの 45 分間インキュベート
12. PBS/EDTA を破棄します。
13. 10 mL の PBS を追加し、厳しくピペッティング組織片を上下 (3 回以上) で陰窩をデタッチします。上清を収集します。
14. 2.13 手順を繰り返します 4 回します。50 mL の最終巻に到達するための培養培地を追加します。
15. 遠心分離 (5 分 300 g x) によって細胞をペレットします。
16. 培地 10 mL にペレットを再懸濁し、遠心分離 (3 分 80 g x) によって陰窩をペレットします。

3. 単一セル準備

1. ペレットの陰窩の上澄みを廃棄し、一緒に 50 μ L 1 mL のトリプシン様酵素でそれらを再懸濁します DNAse (50 μ g/mL)。
2. 2 分の 32 ° C の水浴中で細胞を孵化させなさい。
3. 10 mL の培養液を追加します。少なくとも 5 回上下に厳しくピペッティングによる単一細胞に陰窩を切り離して考えます。
4. 40 μ m ストレーナー (塊と他の不純物を除去する) にソリューションをフィルターと 5 分の 300 x g で単一細胞のペレットします。

4. 流れの Cytometry とめっき

1. 1 x ハンクのバッファリングされた食塩または HBSS/2% 牛胎児血清 (FCS) ソリューションの 50 mL を準備し、すべての 10 の⁶セルの 1 mL にペレットを再懸濁します
2. 細胞懸濁液 BV421 林^- (CD31、CD45、TER119) 30 分のための 1: 250 抗体の濃度で 1: 100、および CD24 APC CD117 PE 両方の濃度に追加します。
3. 並べ替えLgr5⁺幹細胞と別低にパネート細胞バインド チューブ。並べ替えのためのプロトコルの詳細についてはLgr5⁺パネート細胞は roth 氏らを参照してください⁷ Scheweら⁶
   1. 300 x g で 5 分間で並べ替えられた細胞は、1.3 のように記述されているコンポーネントを 100 μ l 添加培地で細胞を再懸濁します遠心分離機 (材料の表を参照してください)。
4. パネート細胞の治療 (例えば、化学的または遺伝の修正によって) (n = 2000) またはLgr5⁺幹細胞 (n = 2000)。
   1. 総量が 100 μ L の培養液の 100 の濃度で小さな干渉 RNA (siRNA) リポソームを介したトランスフェクション試薬の 5 μ L を使用細胞を治療する nM。SiRNA または選択した変更のために必要な時間のための 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
5. 500 μ L の培養液中で 2 回洗浄を行う。
6. 5 分間 300 × g で遠心し、10 μ L の培養液中の細胞を再懸濁します。
7. 2 つの細胞成分をプール (パネートまたはLgr5⁺細胞) の 20 μ l の総ボリュームや 300 x g で室温 5 分間遠心
8. 共同インキュベート、パネートと室温 10 分間細胞のLgr5⁺
9. 上澄みの 10 μ L を削除し、細胞ペレットを吸い出してに確かに液体のメニスカスを残します。
10. 40 μ L の総ボリュームのセルを再構成した基底膜の 30 μ L を追加、細胞を再懸濁します、予め温めておいた 96 well プレートのプレートします。10 分後完全培地 200 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。変化媒体ごとの 48 時間。
11. 5 日目でカウントにおける多様性。

Representative Results

Organoid 再構成アッセイでは、 Apc遺伝子の小さな干渉 RNA (siRNA) を行い, ここで、腸上皮の幹細胞のニッチとの基本的なコンポーネントの個別の機能解析をことができます。

この目的を達成するために私たちはまず近交系 C57BL6/J マウスから 8000 Lgr5⁺細胞と 6000 のパネート細胞を分離する (FACS) を並べ替え蛍光活性化細胞を利用しました。図 1 aでオラ アッセイのフローチャートが描かれています。Organoid 溶解能力はApcの mRNA に対する siRNA オリゴヌクレオチドLgr5⁺の細胞を培養によって評価されたまたはコントロールとしてスクランブル シーケンス (SCR) を網羅します。治療後、同じ siRNA で処理されたLgr5⁺細胞どちらか直接 organoid 媒体/再構成した基底膜、メッキまたは未処理のパネート細胞の等しい数と培養, うちメッキ後.コントロールとして、未処理Lgr5⁺細胞は単独でメッキされた (すなわち、パネート細胞なし) 未処理Lgr5⁺細胞由来オルガノイドの数を決定します。さらに追加のコントロールとして、パネート細胞単独ではパネート細胞ゲートで並べ替え Lgr5 パネート細胞ダブレットの汚染から派生した organoid 形成の背景を確認するメッキだった。予想通り、 Lgr5⁺幹細胞 (とカノニカル Wnt/β-カテニン シグナル伝達経路の結果活性化) のマウスのApc遺伝子の siRNA を介したノックダウン プラスにおける多様性と比較した場合の影響を対応する未処理またはスクランブル コントロール (図 1 b)。構成の wnt シグナルの活性化は、以前に報告された¹としてパネート細胞の要件を救出しました。さらに、これら organoids 登場として中空球 (回転楕円体)、 Apcの記述表現型-変異体または Wnt 刺激 organoids (図 1パネル 1)、Lgr5 パネート細胞から得られるそれらの形態と比較するとダブレット (図 1 C、パネル 2)^8,9。総称して、これらの結果は、それを再構成することを示すパネート細胞とLgr5⁺細胞はこれらの 2 つのセル型のセル固有メカニズムに洞察力を与えることができます。顕微鏡によるオルガノイドの形態素解析はこの点で貴重なすることができます、オルガノイドの形態はその細胞の組成を反映するので (例えば、回転楕円体は、によって構成され、 Lgr5⁺細胞)。考慮するべき別の重要なパラメーターは、(例えば、クリプト新進イベント数) organoid の複雑さです。

図 1。SiRNA の効果を介した Lgr5 のApcの⁺セル。(A)実験手順のフローチャート。Lgr5^EGFPレポーター マウス (Lgr5^{EGFP IRES creERT2})¹にLgr5⁺のソースの幹細胞として用いられました。パネート細胞は、示されていると説明した^6,7としてソートされます。((B))における多重度のLgr5⁺幹細胞およびパネート細胞の再構成時に観察されます。前処理はマス目 siRNA オリゴヌクレオチドはApc (siRNA Apc) に対して指示されるまたは (SCR) 制御シーケンスをスクランブルします。アスタリスクは統計的に有意な違いを示す (n = 3、* p < 0.05 * * p < 0.001)。誤差範囲は、(1) の SD Lgr5⁺のセルを参照、(2) Lgr5⁺細胞は SCR、(3) Lgr5⁺セル siRNA Apc、(4) Lgr5⁺セル + パネート細胞, (5) Lgr5⁺siRNA Apc + パネート細胞、(6) のパネート細胞を細胞します。(C)オルガノイドの代表的なイメージは、(1) Lgr5⁺セル siRNA Apc、(2) Lgr5⁺- パネート細胞から派生しました。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

又は、2 つの基本的なコンポーネント腸管幹細胞ニッチすなわちLgr5⁺ 、パネート細胞の洗練された機能解析が可能します。このアプローチは、わずかな変更^6,10,11私たちと他の人が以前採用されています。再現性と標準化された実験室のプロトコルとして又は手順を紹介します。また、遺伝子導入の可能性の例としてLgr5⁺の幹細胞のApcダウンレギュレーションの効果に関する報告 (または生化学的な⁶) 並べ替えられた細胞成分に変更。総称して、データ表示 siRNA Apcの仲介ノックダウンLgr5⁺細胞の幹細胞の機能を高めるは、増加における多様性 (図 1 b) によって示される。

腸内の 3 D におけるカルチャを使用していくつかの利点は、既にレビュー⁴など、クリプト絨毛アーキテクチャの生体内で、それと自分の組織の著しい類似点と比べるとに記載されている、不死化細胞株と標準的な 2次元培養法から建築。ただし、このメソッドの主要な制限の 1 つはほとんどの場合、organoid 文化は腸陰窩から個々 のコンポーネントと機能の解析を許可しないプロセスが確立されて幹とニッチの特に、します。細胞、ここでそれぞれLgr5⁺ 、パネート細胞によって表されます。

これらの制限を克服して、オラ。茎およびニッチのセルは、別々 に動物からソートし、オルガノイドを生成する再構成することができます。など、このアプローチは特定の遺伝的改変を運ぶか採用マウス ・ モデルにより、これらの 2 つの細胞成分の機能解析または (例えば、DSS および/または特定のダイエット); 特定のストレス要因にさらさまたは直接遺伝子並べ替えセルを変更することによって (siRNA、CRISPR Cas9) または生化学的、オルガノイドを生成するそれらを再構成する前に。多様性、形態、自己複製能力と分化 (および最終的に化生変化の範囲) の結果オルガノイドの範囲は機能読み出しとして用いることができます。SiRNA などの遺伝的操作の場合形態学的効果は、明らかではないときのセルを分析し、興味の mRNA のノックダウンを検証するトランスフェクション後 1 時間。パネートとLgr5⁺茎およびニッチのセルの異なる変異はこれらの 2 つの細胞型と異なる organoid 相互作用変化につながるかどうか調査する異なる突然変異と遺伝子改変マウスから並べ替えることもできます生成効率および/または形態。

プロトコルの中で重要なステップは、絨毛 (ステップ 2.7) の除去と HBSS/2%FCS (手順 4.1) のセルの再懸濁。絨毛の除去はパネートを豊かにする重要なLgr5⁺細胞は陰窩と並べ替えの効率を改善するためにより低い三番目に位置します。FACS プロトコルは一般的、PBS/FCS のセルを並べ替えを示唆している、PBS ではなく HBSS の使用は増加し、細胞生存率を並べ替えの時間を通して安定した保持します。その他の重要なステップは、ステップ 4.7 ・ 4.8、物理パネート協会とLgr5⁺細胞organoids に上昇を与える最終的にフォーム ダブレットにこれらの系統をことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Final concentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Final concentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Final concentration: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium