Summary
Кишечные органоид культур устанавливаются от всей склепы и не позволяют анализ самообновления и дифференциации в клетки конкретных моды. Этот протокол описывает воссоздание отсортированных стволовых (Lgr5+) и ниши (Paneth) клетки, которые порождают organoids обеспечивая их предыдущие биохимических и генетических изменений и функционального анализа.
Abstract
Кишечного эпителия характеризуется чрезвычайно быстрая текучесть. В млекопитающих весь эпителиальной выстилки обновляется в течение 4-5 дней. Кишечные стволовые клетки находятся в нижней части склепы Lieberkühn, выделяются по экспрессии гена Lgr5 и сохранения гомеостаза через их характерным Высокий пролиферативный1. На протяжении тонкого кишечника Lgr5+ стволовые клетки являются перемешан с специализированными секреторных клеток, называемых Paneth клеток. Paneth клетки секретируют антибактериальных соединений (то есть, лизоцима и cryptdins/дефензинов) и оказывают контрольный роль на кишечную флору. Совсем недавно Роман функция была обнаружена Paneth клеток, а именно их способность обеспечивать поддержку нишу Lgr5+ стволовые клетки через несколько ключевых лигандов как Wnt3, EGF и Dll12.
Когда изолированные ex vivo и культивировали при наличии конкретных факторов роста и компоненты внеклеточного матрикса, весь кишечные крипты порождают долгоживущих и самостоятельного обновления 3D структуры под названием organoids, весьма напоминающие склеп ворсинок Эпителиальный архитектура взрослых тонкой кишки3. Органоид культур, когда создана из всей склепы, позволяют исследования самообновления и дифференцировку стволовых клеток кишечника нишу, хотя без учета вклада ее отдельных компонентов, а именно Lgr5+ и Paneth клетки.
Здесь мы опишем новый подход к assay органоид, который использует способности Paneth и Lgr5+ клетки объединяться и создавать organoids когда совместно культивируемых. Этот подход, здесь называют «органоид воссоздание пробирного» (ОРА), позволяет генетических и биохимических изменений Paneth или Lgr5+ стволовых клеток, после растворения в organoids. Таким образом это позволяет функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника.
Introduction
Кишечного эпителия является наиболее быстро самостоятельного обновления тканей в организме млекопитающих и, таким образом, был объектом множества исследований, направленных на выявление и функциональной характеристике стволовых клеток взрослых, проживающих в нижней части склепа из Lieberkühn, целевых, экспрессия гена Lgr5 и зависит от канонических Wnt сигналы1. В частности, Lgr5+ стволовые клетки бокам и поддержке специализированных нишевых клетки, то есть Paneth клетки, которые также зависеть Wnt сигнализации для их созревания2. Вместе, эти типы две клетки лежат в основе самообновлению эпителиальной выстилки кишечника и сохранить ежедневно гомеостатических равновесия: Lgr5+ стволовые клетки быстро разделить и порождают прародителем и более специализированных кишечного эпителия клетки; Paneth клетки обеспечивают ниши основных факторов (например, Dll1, Wnt3, EGF) для Lgr5+ стволовые клетки2. Количество кишечных склепы когда покрытием ex vivo в форме организованных и самостоятельного обновления структуры под названием organoids, или «мини кишки», была использована как экспериментальный инструмент для обеспечения понимания процессов, таких как самообновления и дифференциация в нормальных и патологических условиях, включая рак4. Из нескольких тканей, в том числе кишечника, поджелудочной железы, печени и почек, как мышь, так и человеческих пробах4были созданы органоид культур. Метод добычи и факторы роста, занятых в разработке этих культур органоид ткане- и предназначены для привода мульти линии дифференциации и максимально точно имитировать оригинальные ниши стволовых клеток в vivo. Organoids могут иметь потенциальные приложений, включая лечения генетических заболеваний, оценка терапевтической эффективности в рак, анализ лекарственной токсичности или изучению органогенеза в vitro5.
В целом основным ограничением органоид культурах когда создана из образцов тканей является отсутствие клеток специфика. К примеру, кишечные organoids с целом кишечные крипты не позволяют анализ отдельных клеточных компонентов, входили в источнике ткани (например, содержат весь склепы Lgr5+, Paneth, и клетки-предшественники).
Здесь мы опишем новый метод, именуемый ORA, который сочетает в себе преимущества кишечных органоид культур с функционального анализа его самых основных компонентов, а именно стволовых (Lgr5+) и ниши (Paneth) клетки. Это достигается за счет уникальной способности Paneth и Lgr5+ клетки к физически связаны друг с другом совместно инкубировали при породить organoids2,6,10. Мы воспользовались этой функции и предварительно индивидуально типы двух клеток перед предоставлением им для воссоздания organoids. При этом каждый компонент ячейки могут подвергаться любого данного препарата, фактор роста, биохимические ингибитор, генетической модификации или химической обработки до растворения и органоид формирования. Таким образом используя ORA assay позволит определение о том, имеет ли конкретный препарат лечения или генетической модификации специфическое воздействие на стволовые клетки или их двойники нишу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были сделаны согласно местных животных законов и руководящих принципов.
1. Подготовка документов, средства массовой информации культуры и блюда
- Автоклав 1 набор кишечника ножницы, ножницы нормальной и щипцами в стерильный контейнер.
- Поместите блюдо 96-луночных (плоское дно) в инкубаторе при 37 ° C.
- Подготовка 10 мл полной питательной среды с реагентами, перечисленных в таблице материалов.
- Инкубируйте полного среднего при 37 ° C на водяной бане.
- Оттепель воссоздана базальной мембраны, поместив его в ведро льда. Восстановленный базальной мембраны станет жидким при температуре 4 ° C.
- Заполните 4 чашки Петри с холодной фосфат амортизированное saline или сокращенно PBS (4 ° C).
2. изоляция малых кишечные крипты
- Пожертвуйте при вдыхании CO2 мыши - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5на фоне C57BL6/J. Рассечь брюшину продольно с ножницами.
- Держите живот с щипцами и резать поперек пополам.
- Теперь с помощью кишечной ножницы, вытащить кишечника и поместите его в чашку Петри, содержащие PBS.
Примечание: Кишечные ножницы имеют острым и тупым кончиком. Тупым кончиком эти ножницы предназначен чтобы не повредить склеп ворсинок архитектуры при открытии в кишечнике. - Начните с размещения тупой совет в желудок и осторожно протолкнуть пилоруса. Перейти резки ножницами и потянув с щипцами.
- После продольно открыт весь кишечник, стирать в холодной PBS, удерживая его с щипцами и осторожно промойте его в растворе PBS с U-образной движений.
- После того, как будут удалены все остатки стул, переходите к придавить кишечника на разделочную доску, просветный стороной вверх. Люминал сторона легко узнаваемы, отсутствие кровеносных сосудов и его бледный вид, по сравнению с внешней части.
- С на стеклянное скольжение аккуратно удалите ворсинки соскабливания уплощенных кишечника. Выполните этот шаг два раза по всей длине ткани.
- Нарежьте тонкой кишки с стерильные хирургические лезвия 2-5 мм.
- Место небольшой кишечных фрагментов в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного льда PBS.
- Очистите фрагменты тканей, удаление любых оставшихся примесей, закупорить их вверх и вниз в PBS. Отменить супернатант и повторите этот шаг до тех пор, пока PBS совершенно ясно.
- Добавьте 15 мл холодной PBS, довести объем окончательный PBS до 25 мл. Добавить 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и проинкубируйте 45 мин на ролике на 4 ° C.
- Выбросите PBS/ЭДТА.
- Добавить 10 мл PBS и отсоедините склепы, жестко закупорить фрагменты тканей вверх и вниз (по крайней мере три раза). Соберите супернатант.
- Повторите шаг 2.13 четыре раза. Добавьте питательной среды для достижения окончательный объем 50 мл.
- Пелле клетки центрифугированием (300 x g 5 мин).
- Ресуспензируйте гранулы в 10 мл питательной среды и Пелле склепы центрифугированием (80 g x 3 мин).
3. одну ячейку подготовка
- Отменить супернатант гранулированных склепы и Ресуспензируйте их в 1 мл трипсина как ферменты вместе с 50 мкл DNAse (50 мкг/мл).
- Инкубируйте клетки в водяной бане при температуре 32 ° C на 2 мин.
- Добавьте 10 мл питательной среды. Отделить склепы в отдельные клетки, жестко закупорить вверх и вниз по крайней мере 5 раз.
- Фильтр решение через стрейнер 40 мкм (для устранения кусты и других примесей) и Пелле одной клетки на 300 g x 5 мин.
4. поток цитометрии и обшивка
- Подготовка 50 мл 1 x Хэнк буфферезированный раствор соли или HBSS/2% плода корова сыворотки (FCS) раствора и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл на каждые 106 клеток
- Добавьте в суспензию клеток BV421 Линь– (CD31, CD45, TER119) в концентрации 1: 100 и CD24-APC и CD117-PE как в концентрации 1: 250 антител на 30 мин.
- Сортировка Lgr5+ стволовых клеток и клеток Paneth в отдельный низкий связывать трубы. Дополнительные сведения о сортировке протоколы для Lgr5+ и Paneth клетки, смотрите рот и др. 7 и Шюи и др. 6
- Центрифуги, отсортированных клетки на 300 x g 5 мин Ресуспензируйте клетки в 100 мкл среде с компонентов, описанных в 1.3 (см. Таблицу материалов).
- Лечения (например, путем химического или генетические модификации) Paneth клетки (n = 2000) или Lgr5+ стволовые клетки (n = 2000).
- Для лечения ячейки, используйте 5 мкл Реагента липосомы опосредованной трансфекции в суммарный объем 100 мкл питательной среды и малые интерферирующие РНК (siRNA) в концентрации 100 Нм. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C для малых интерферирующих РНК или время, необходимое для выбранной модификации.
- Вымойте клетки дважды в 500 мкл питательной среды.
- Центрифуга на 300 g x 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 10 мкл питательной среды.
- Объединить два клетчатых компонентов (Paneth или Lgr5+ клетки) в 20 мкл общий объем и центрифуги на 300 x g 5 мин на RT.
- Совместное инкубировать Paneth и Lgr5+ клетки для 10 мин на RT.
- Удаление 10 мкл супернатант и оставить мениске жидкости быть уверенным не аспирационная Пелле ячейки.
- 30 мкл восстановленный базальной мембраны клеток для общего объема 40 мкл, Ресуспензируйте клетки и пластины в подогретым 96 пластины хорошо. После 10 минут, добавить 200 мкл полной среды (см. Таблицу материалов). Изменение среднего каждые 48 ч.
- Граф органоид кратности на 5 день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воссоздание пробирного органоид позволяет отдельный функциональный анализ основных компонентов ниши и стволовых клеток кишечного эпителия, здесь продемонстрировано малые интерферирующие РНК (siRNA) гена Apc .
Для достижения этой цели, мы впервые использовали флуоресцентный активированных клеток, сортируя (FACS), чтобы отделить 8000 Lgr5+ и 6000 Paneth ячейки от инбредных мышей C57BL6/J. На рисунке 1aизображен блок ORA assay. Восстановление потенциала органоид оценивалась путем инкубации клеток Lgr5+ с siRNA олигонуклеотиды, направленных против мРНК Apc или охватывающих кодированные последовательности (SCR) как элемент управления. После лечения же малых интерферирующих РНК лечение Lgr5+ клетки были либо непосредственно покрытием в органоид среднего/восстановленный базальной мембраны, или инкубировали с равное количество необработанных Paneth клеток и впоследствии покрытием из. Как элемент управления, неочищенные Lgr5+ клетки были покрытием одиночку (то есть, без клетки Paneth) чтобы определить количество organoids, полученные из необработанной Lgr5+ клеток. Кроме того, как дополнительный элемент управления Paneth клетки только были покрытием для проверки на фоне формирования органоид, производный от загрязнения Paneth-Lgr5 клеток Дуплеты отсортированы в ворота Paneth клеток. Как и ожидалось, siRNA опосредованной нокдаун гена мышиных Apc в Lgr5+ стволовые клетки (и результирующее активации канонической сигнальный путь Wnt/β-катенина) положительно сказалось органоид кратность по сравнению с неочищенные коллегами или омлет управления (рис. 1B). Учредительный Wnt активации также спасли требование Paneth клетки, как сообщалось ранее1. Кроме того, эти organoids появился как полых сфер (сфероидов), хорошо описана фенотип для Apc-мутанта или стимулировали Wnt organoids (рис. 1 c, Группа 1), когда по сравнению с морфологией тех, полученные из клеток Paneth-Lgr5 Дуплеты (рис. 1 C, Группа 2)8,9. Вместе, эти результаты показывают, что воссоздание Paneth клетки и Lgr5+ клетки могут дать представление на клетки конкретные механизмы в рамках этих типов двух клеток; морфологический анализ organoids по микроскопии может быть ценной в этом отношении, поскольку морфология organoids отражает их клеточный состав (например, учрежденных сфероидов Lgr5+ клетки только). Еще один важный параметр принимать во внимание, является сложность органоид (например, количество событий многообещающий склеп).
Рисунок 1. Эффект siRNA опосредованной нокдаун Apc в Lgr5+ клетки. (A) схема экспериментальной процедуры. Lgr5 EGFP репортер мышей (EGFP-IRES-creERT2Lgr5)1 были заняты как источник Lgr5+ сортировка стволовых клеток. Paneth клетки были отсортированы как указано и ранее описанные в6,7. (B) органоид кратности наблюдается после растворения Lgr5+ стволовых клеток и Paneth клетки. Когда указано клетки были предварительно обработанных с siRNA олигонуклеотиды, направленных против Apc (siRNA Apc) или платные последовательности управления (SCR). Звездочки показывают статистически значимых различий (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Планки погрешностей ссылаются на ячейки SD. (1) Lgr5+ , (2) Lgr5+ клетки SCR, (3) Lgr5+ клетки siRNA Apc, (4) клетки Lgr5+ + Paneth клеток, (5) Lgr5+ клетки siRNA Apc + Paneth, (6) Paneth клеток. (C) представитель изображения organoids производным от (1) Lgr5+ клетки siRNA Apc, (2) Lgr5+- Paneth клетки. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ORA позволяет изысканный функциональный анализ двух основных компонентов ниши стволовых клеток кишечника, а именно: Lgr5+ и Paneth клетки. Этот подход ранее работали с нами и другими с незначительными изменениями6,10,11. Здесь мы представляем ORA процедуры как воспроизводимость и стандартизированных лабораторных протокол. Кроме того, мы доклад о воздействии Даунрегуляция Apc в Lgr5+ стволовых клеток, например, возможность реализации генетического (или биохимических6) изменения в отсортированном клеточных компонентов. Коллективно, данные показывают, что siRNA опосредованной нокдаун Apc улучшает функции стволовых клеток Lgr5+ клеток, как свидетельствует увеличение органоид кратности (рис. 1B).
Несколько преимуществ использования кишечных 3D органоид культур уже были перечислены в обзоры4, включая поразительное сходство их организации с этим склеп ворсинок архитектуры в естественных условиях, особенно по сравнению с Архитектура из методов стандартного 2D культуры с увековечен клеточных линий. Однако один из основных недостатков этого метода является, в большинстве случаев, органоид культур устанавливаются от всей кишечные крипты, процесс, который не допускает функционального анализа ее отдельных компонентов и, в частности, стебель и ниши клетки, здесь представлена Lgr5+ и Paneth клетки, соответственно.
ORA преодолевает эти ограничения. Ниши и стволовые клетки можно отдельно сортируются от животных и восстановленный сформировать organoids. Таким образом этот подход позволяет функциональный анализ этих двух клеточных компонентов, либо используя мышь модели проведения конкретных генетических модификаций или подвергаются конкретные стресс-факторов (например, DSS или конкретной диеты); или непосредственно редактируя отсортированных клетки генетически (siRNA, ТРИФОСФАТЫ-Cas9) или биохимически, до воссоздания их для создания organoids. Кратность, морфология, самообновлению емкости и степени дифференциации (и в конечном итоге степень метапластические изменения) результирующий organoids могут использоваться как функциональной read-outs. В случае генетической манипуляции, например siRNA когда морфологических эффект не заметен, клетки должны быть проанализированы один час после трансфекции для проверки нокдаун mRNA интереса. Paneth и Lgr5+ также могут быть отсортированы от мышей, генетически с различными мутациями учиться ли изменены взаимодействия этих типов двух ячеек и различные органоид различных мутаций в клетках стволовых и ниши эффективности формирования и/или морфологии.
Важнейшие шаги в рамках Протокола являются удаления ворсинок (шаг 2.7) и ресуспендирования клеток в HBSS/2%FCS (шаг 4.1). Удаления ворсинок имеет решающее значение для обогащения Paneth и Lgr5+ клеток, расположенных в нижней трети склепов и улучшить эффективность сортировки. Хотя протоколы СУИМ обычно Сортировка ячеек в PBS/FCS, использование HBSS вместо PBS увеличилось и сохранить жизнеспособность клеток стабильным на протяжении всего времени сортировки. Другие важные шаги являются шаги 4.7 и 4.8, где физическая Ассоциация Paneth и Lgr5+ клетки позволяет этих линий для Дуплеты формы, которые в конечном итоге привести к organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы могут не конкурирующие финансового интереса или другие конфликты интересов
Acknowledgments
Это исследование стало возможным благодаря финансированию из голландского общества рака (KWF; EMCR 2012-5473) и рак исследований средств мирового (WCRF; проект № 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
