Summary
Organoide intestinal culturas establecen de criptas todas y no permite el análisis de auto renovación y diferenciación de una manera específica de la célula. Este protocolo describe reconstitución de potencia ordenada (Lgr5+) y lugar (Paneth) células, que dan lugar a organoides permitiendo su modificación bioquímica y genética previa y análisis funcional.
Abstract
El epitelio intestinal se caracteriza por un índice de rotación extremadamente rápida. En mamíferos, la guarnición epitelial toda se renueva dentro de los 4-5 días. Las células madre intestinales residen en la parte inferior de las criptas de Lieberkühn son asignadas por la expresión del gen Lgr5 y preservar la homeostasis a través de su característica alta tasa proliferativa1. A lo largo del intestino delgado, Lgr5+ las células madre están entremezcladas con células secretoras especializadas llamadas células de Paneth. Células de paneth secretan compuestos antibacterianos (por ejemplo, la lisozima y cryptdins/defensinas) y ejercen un papel que controlaba en la flora intestinal. Más recientemente, se ha descubierto una nueva función para las células de Paneth, es decir, su capacidad para proporcionar apoyo de nicho a células Lgr5+ a través de varios ligandos claves como Wnt3, EGF y Dll12.
Cuando aislado ex vivo y cultivadas en presencia de factores específicos de crecimiento y componentes de la matriz extracelular, criptas intestinales toda dan lugar a larga vida y uno mismo-renovar estructuras 3D llamado organitas muy parecidos a la cripta vellosidad arquitectura epitelial del intestino adulto3. Organoide culturas, cuando estableció de criptas enteras, permiten el estudio de auto renovación y diferenciación del nicho de células madre intestinales, aunque sin abordar la contribución de sus componentes individuales, es decir, la Lgr5+ y Células de Paneth.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el análisis de organoides que se aprovecha de la capacidad de Paneth y células Lgr5+ para asociarse y formar organoides cuando cultivadas conjuntamente. Este enfoque, aquí denominado "ensayo de reconstitución de organoide" (ORA), permite la modificación genética y bioquímica de Paneth o Lgr5+ células, seguidas de reconstitución en organoides. Como tal, permite el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales.
Introduction
El epitelio intestinal es el tejido más rápidamente renueva a sí misma en el cuerpo mamífero y, como tal, ha sido objeto de una gran cantidad de estudios dirigidos a la identificación y caracterización funcional de las células madre adultas que residen en la parte inferior de la cripta de Lieberkühn, destinado por la expresión del gen Lgr5 y dependiente de señales Wnt canónico1. En particular, las células de vástago Lgr5+ flanqueadas y apoyadas por las células del nicho especializado, es decir, las células de Paneth, que también dependen de Wnt de señalización para su maduración2. Juntos, estos dos tipos celulares subyacen autorenovación de la guarnición epitelial intestinal y mantener el equilibrio homeostático diario: Lgr5+ células rápidamente se dividen y dan lugar a progenitoras y más especializan intestinal epitelial células; Células de Paneth proporcionan factores del nicho fundamental (p. ej., Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ células madre2. La capacidad de las criptas intestinales cuando plateado ex vivo para formar estructuras organizadas y renueva a sí misma llama organoides o "mini-entrañas", se ha explotado como una herramienta experimental para proporcionar la penetración en procesos tales como la auto renovación y diferenciación en condiciones normales y patológicas incluyendo cáncer4. Se han establecido culturas organoide de varios tejidos, incluyendo el intestino, páncreas, hígado y riñón de ratón y muestras humanas4. El método de extracción y los factores de crecimiento empleados para el desarrollo de las culturas de estos organoides son específicas de tejido y diseñado para impulsar la diferenciación multilineal y mímico lo más cerca posible el original nicho de células madre en vivo. Organoides pueden tener aplicaciones potenciales incluyendo el tratamiento de enfermedades genéticas, la evaluación de eficacia terapéutica en el cáncer, el análisis de toxicidad de la droga o el estudio de la organogénesis in vitro5.
En general, la principal limitación de organoide culturas cuando establecido a partir de muestras de tejido es la falta de especificidad celular. Por ejemplo, organitas intestinales establecidas de criptas intestinales toda no permiten el análisis de los componentes celulares, englobado dentro de la fuente de tejido (por ejemplo, contienen criptas todo Lgr5+, Paneth, y células progenitoras).
Aquí, describimos un nuevo método, conocido como ORA, que combina las ventajas de las culturas organoide intestinal con el análisis funcional de sus componentes más fundamentales, a saber, madre (Lgr5+) y células de nicho (Paneth). Esto se logra a través de la capacidad única de Paneth y células de Lgr5+ para asociar físicamente a otro cuando co incuban y dan lugar a organoides2,6,10. Aprovechando esta característica y tratados previamente los dos tipos celulares individualmente antes de lo que les permite reconstituir el organitas. Al hacerlo, cada componente de la célula puede estar expuesto a determinada droga, factor de crecimiento, inhibidor bioquímico, modificación genética o tratamiento químico antes de la reconstitución y la formación de organoide. Por lo tanto, usando el análisis ORA permitirá la determinación de si un determinado tratamiento farmacológico o modificación genética tiene un efecto específico sobre las células madre o sus contrapartes de nicho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos se realizaron según las pautas y leyes de bienestar animal local.
1. preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos
- Sistema de autoclave 1 intestinales tijeras, tijeras normales y pinzas en un recipiente estéril.
- Colocar un plato de 96 pozos (fondo plano) en una incubadora a 37 ° C.
- Preparar 10 mL de medio de cultivo completo con los reactivos indicados en la tabla de materiales.
- Incubar el medio completo a 37 ° C en un baño de agua.
- Descongele la membrana basal reconstituida colocando en un cubo de hielo. La membrana basal reconstituida se convertirá en líquido a 4 ° C.
- Llene 4 placas de Petri con solución salina tamponada con fosfato frío o abreviado PBS (4 ° C).
2. aislamiento de las criptas intestinales pequeñas
- Sacrificio por inhalación de CO2 de un Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 ratón sobre fondo C57BL6/J. Disecar el peritoneo longitudinalmente con un par de tijeras.
- Mantenga el estómago con el fórceps y cortadas transversalmente por la mitad.
- Con las tijeras intestinales de ahora en adelante, sacar el intestino y colocar en una placa de Petri con PBS.
Nota: Tijeras intestinales tienen una fuerte y una punta Roma. La punta Roma de estas Tijeras es no dañar la arquitectura de la cripta vellosidad al abrir el intestino. - Comenzar colocando la punta Roma en el estómago y empuje suavemente a través del píloro. Continúe cortando con las tijeras y tracción con el fórceps.
- Una vez que el intestino entero se abre longitudinalmente, lavar en PBS frío sujetándola con las pinzas y enjuáguelo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.
- Una vez que se eliminan todos los restos de heces, proceder a alisar el intestino en una tabla de cortar, luminal hacia arriba. El lado luminal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte exterior.
- Con un portaobjetos de vidrio, quite con cuidado las vellosidades raspando el intestino aplanado. Realizar este paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido.
- Trocear el intestino con una cuchilla quirúrgica estéril 2-5 mm.
- Colocar los pequeños fragmentos intestinales en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de PBS frío hielo.
- Limpiar los fragmentos de tejido, eliminando cualquier impureza restante transfiriendo hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repetir este paso hasta que el PBS es totalmente claro.
- Añadir 15 mL PBS frío, para llevar el volumen final total de PBS a 25 mL. Añadir 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 45 min sobre un rodillo de 4 ° c.
- Descartar el PBS/EDTA.
- Añadir 10 mL de PBS y separar las criptas mediante pipeteo duramente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo (por lo menos tres veces). Recoger el sobrenadante.
- Repita el paso 2.13 cuatro veces. Añadir el medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mL.
- Sedimenten las células por centrifugación (300 x g durante 5 min).
- Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo y las criptas de pellets por centrifugación (80 x g durante 3 min).
3. célula preparación
- Deseche el sobrenadante de las criptas sedimentados y resuspender en 1 mL de tripsina como-enzimas junto con 50 μl DNasa (50 μg/mL).
- Incubar las células en un baño de agua a 32 ° C por 2 min.
- Añadir 10 mL de medio de cultivo. Disocian las criptas en las células mediante pipeteo duramente hacia arriba y hacia abajo por lo menos 5 veces.
- Filtrar la solución a través de un tamiz de 40 μm (para eliminar grumos y otras impurezas) y de la pelotilla de las células a 300 x g durante 5 minutos.
4. galjanoplastia y citometría de flujo
- Preparar 50 mL de solución salina tamponada de 1 x Hank o solución de suero (FCS) HBSS/2% vaca fetal y resuspender el precipitado en 1 mL para cada 106 células
- Añadir a la suspensión de células BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) a una concentración de 1: 100 y CD24-APC y CD117-PE ambos a una concentración de anticuerpos de 1: 250 por 30 min.
- Tipo Lgr5+ células madre y células de Paneth en separado bajo atan los tubos. Para obtener más información sobre la distribución de protocolos para Lgr5+ y células de Paneth, véase Roth et al. 7 y Schewe et al. 6
- Centrifugar las células clasificadas a 300 x g durante 5 min resuspender las células en 100 μl de medio con los componentes descritos en 1.3 (véase la Tabla de materiales).
- Tratamiento (p. ej., por modificación química o genética) de las células de Paneth (n = 2000) o las células de vástago Lgr5+ (n = 2000).
- Para tratar células, se utilizan 5 μl de reactivo de transfección mediada por liposomas en un volumen total de 100 μl de medio de cultivo y ARN interferente pequeño (siRNA) a una concentración de 100 nM. Incubar durante 30 min a 37 ° C por siRNA o por el tiempo necesario para la modificación solicitada.
- Lavan las células dos veces en 500 μl de medio de cultivo.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 10 μl de medio de cultivo.
- Los dos componentes celulares de la piscina (Paneth o Lgr5+ células) 20 μl volumen total y centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
- Co incubar el Paneth y células de Lgr5+ durante 10 min a TA.
- Extraiga 10 μl del sobrenadante y deje un menisco de líquido para asegurarse para no aspirar el sedimento celulares.
- Añadir 30 μl de reconstituido la membrana basal a las células para un volumen total de 40 μl, resuspender las células y de la placa en una placa bien 96 precalentado. Después de 10 min, añadir 200 μL de medio completo (véase la Tabla de materiales). Medio de cambio cada 48 h.
- Cuenta de multiplicidad de organoide en día 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El ensayo de reconstitución de organoide permite el análisis funcional separado de los componentes esenciales del nicho y células del epitelio intestinal, aquí demostrada por ARN interferente pequeño (siRNA) del gene del Apc .
Para lograr este objetivo, primero utilizamos fluorescente celular activada (FACS) para separar células Lgr5+ 8000 y 6000 células de Paneth de ratones C57BL6/J endogámicas de clasificación. En la Figura 1a, se representa un diagrama de flujo del ensayo de ORA. Capacidad de reconstitución de organoide se evaluó por incubación de las células Lgr5+ con siRNA OLIGONUCLEÓTIDOS dirigidos contra el mRNA de Apc o que abarca una secuencia codificada (SCR) como control. Después del tratamiento, las células de Lgr5+ tratados con siRNA mismo eran ya sea plateadas directamente en organoide medio/reconstituido la membrana basal, o incubadas con igual número de las células de Paneth no tratadas y posteriormente plateadas hacia fuera. Como control, las células no tratadas de Lgr5+ fueron plateadas solo (es decir, sin células de Paneth) para determinar la cantidad de organoides derivados de las células no tratadas de Lgr5+ . Además, como un control adicional, las células de Paneth solo fueron plateadas para verificar los antecedentes de formación de organoides derivado de la contaminación de Dobletes de célula de Paneth-Lgr5 en la puerta de la célula de Paneth. Como era de esperar, caída mediada por siRNA del gene del Apc murino en las células de vástago Lgr5+ (y la consiguiente activación de la vía de señalización Wnt/β-catenina canónica) afectó positivamente organoide multiplicidad en comparación con contrapartes no tratadas o el control codificado (figura 1B). La activación constitutiva de Wnt también rescató la necesidad de las células de Paneth, previamente divulgados1. Además, estos organoides aparecieron como huecas esferas (esferoides), un fenotipo descrito bien para Apc-mutante u organitas Wnt-estimulado (figura 1, panel 1), en comparación con la morfología de las obtenidas de células de Paneth-Lgr5 dobletes (figura 1 C, panel 2)8,9. Colectivamente, estos resultados demuestran que reconstituir las células de Paneth y Lgr5+ células pueden dar conocimiento sobre los mecanismos celulares específicos dentro de estos dos tipos celulares; Análisis morfológico de los organoides por microscopia pueden ser valioso en este sentido ya que la morfología de los organoides refleja su composición celular (p. ej., esferoides están constituidos por Lgr5+ sólo de las células). Otro parámetro importante a tener en cuenta es la complejidad de los organoides (por ejemplo, el número de eventos de florecimiento de cripta).
Figura 1. Efecto de siRNA mediado caída de Apc en Lgr5+ células. (A) diagrama de flujo del procedimiento experimental. Lgr5 EGFP reportero ratones (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 fueron empleados como una fuente de Lgr5+ clasificar las células madre. Células de Paneth se clasifican como indicada y descrita6,7. (B) multiplicidad de organoide observado sobre la reconstitución de las células de vástago Lgr5+ y células de Paneth. Cuando las células indicadas fueron pretratadas con siRNA OLIGONUCLEÓTIDOS dirigen contra el Apc (siRNA Apc) o revueltos secuencia de control (SCR). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (n = 3, * p < 0.05 ** p < 0,001). Barras de error se refieren a células SD. (1) Lgr5+ , (2) Lgr5+ células de SCR, (3) Lgr5+ siRNA de células Apc, células Lgr5+ (4) + las células de Paneth, (5) Lgr5+ células siRNA Apc + las células de Paneth, células de Paneth (6). (C) imágenes representativas de organoides derivan de (1) Lgr5+ siRNA de células Apc, células de Paneth - Lgr5+(2). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ORA permite el refinado análisis funcional de los dos componentes esenciales del nicho de células madre intestinales, es decir, Lgr5+ y células de Paneth. Este enfoque ha sido empleado previamente por nosotros y otros con ligeras modificaciones6,10,11. Aquí, presentamos el procedimiento ORA como un protocolo de laboratorio estandarizadas y reproducibles. También, nos informe sobre los efectos de la desregulación de la Apc en las células de vástago Lgr5+ , como un ejemplo de la posibilidad de aplicación de genética (o bioquímicas6) modificaciones en los componentes celulares ordenados. Colectivamente, los datos muestran que siRNA mediado caída de Apc mejora la función de la célula de vástago de las células Lgr5+ , según lo indicado por la multiplicidad de organoide creciente (figura 1B).
Varias ventajas del uso de culturas de organoide intestinal de 3D ya se han enumerado en los comentarios4, incluyendo la semejanza llamativa de su organización con la de la cripta vellosidad arquitectura en vivo, especialmente en comparación con el arquitectura de los métodos de cultivo estándar 2D con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este método es que en la mayoría de los casos, organoide se establecen cultivos de criptas intestinales todo, un proceso que no permite el análisis funcional de sus componentes individuales y, en particular, del tallo y nicho células, aquí representadas por Lgr5+ y células de Paneth, respectivamente.
El ORA supera estas limitaciones. Las células madre y nicho pueden ordenadas del animal por separado y reconstituidas para generar organitas. Como tal, este enfoque permite el análisis funcional de estos dos componentes celulares ya sea empleando modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas o expuestos a factores de estrés específicos (e.g., DSS o dietas específicas); o modificando directamente las células clasificadas genéticamente (siRNA, CRISPR Cas9) o bioquímico, antes de reconstituir para generar organitas. La multiplicidad, morfología, capacidad de auto renovación y grado de diferenciación y eventualmente el grado de cambio metaplastic de organoides resultante pueden emplearse como lectura funcional. En el caso de la manipulación genética, como la de siRNA, cuando un efecto morfológico no es evidente, las células deben analizarse una hora después de transfección para validar la caída de los ARNm de interés. Paneth y Lgr5+ también puede ser clasificado de ratones genéticamente modificados con diferentes mutaciones para estudiar si diversas mutaciones en las células de vástago y nicho llevan a interacciones alteradas entre estos dos tipos celulares y un organoide diferentes eficacia de la formación y morfología.
Pasos críticos en el protocolo son la eliminación de las vellosidades (paso 2.7) y la resuspensión de las células de HBSS/2%FCS (paso 4.1). Eliminación de las vellosidades es fundamental para enriquecer Paneth y Lgr5+ células situado en el tercio inferior de las criptas y a mejorar la eficiencia de clasificación. Aunque los protocolos FACS comúnmente sugieren clasificar las células en PBS/FCS, el uso de HBSS en lugar de PBS aumentó y viabilidad celular mantuvo estable durante el tiempo de clasificación. Otros pasos importantes son pasos 4.7 y 4.8, donde física Asociación de Paneth y Lgr5+ células permite estos linajes a dobletes de forma que finalmente dará lugar a organoides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen ninguna competencia interés financiero u otros conflictos de intereses
Acknowledgments
Este estudio fue posible gracias a fondos de la sociedad holandesa del cáncer (KWF; EMCR 2012-5473) y el mundo el cáncer investigación fondos Internacional (WCRF, proyecto no. 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
