Organoid rekonstitution Assay (ORA) for den funktionelle analyse af Intestinal stilk og Niche celler

Summary

Tarm organoid kulturer er etableret fra hele krypter og tillader ikke, at analysen af selvfornyelse og differentiering i en celle-specifikke mode. Denne protokol beskriver rekonstituering af sorterede stilk (Lgr5⁺) og niche (Paneth) celler, som giver anledning til organoids samtidig med at deres forudgående biokemiske og genetiske modifikation og funktionelle analyse.

Abstract

Den intestinale epitel er karakteriseret ved en meget hurtig omsætningshastighed. Hos pattedyr, er hele epithelial foring fornyes inden for 4-5 dage. Tarm stamceller fra voksne bor i bunden af Krypter af Lieberkühn, er øremærket ved ekspression af Lgr5 -gen og bevare homøostase gennem deres karakteristiske høje proliferativ sats¹. I hele tyndtarmen, Lgr5⁺ stamceller er sammenblandet med specialiserede sekretoriske celler kaldet Paneth cellerne. Paneth celler udskiller antibakterielle stoffer (dvs., lysozym og cryptdins/defensins) og udøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. For nylig, en ny funktion er blevet opdaget for Paneth cellerne, nemlig deres kapacitet til at niche støtte Lgr5⁺ stamceller gennem flere centrale ligander som Wnt3, EGF og Dll1².

Når isoleret ex vivo og kulturperler bestemte vækstfaktorer og ekstracellulære matrix komponenter, hele tarm Krypter give anledning til langlivede og selvstændig fornyelse 3D strukturer kaldet organoids, der meget ligner krypt-villus epitelial arkitektur af voksen tyndtarmen³. Organoid kulturer, når etableret fra hele Krypter, tillade studiet af selvfornyelse og differentiering af den intestinale stamcelle niche, uden dog at tackle bidrag af dens enkelte komponenter, nemlig Lgr5⁺ og Paneth cellerne.

Her, vi beskrive en ny tilgang til organoid analysen, der udnytter muligheden i Paneth og Lgr5⁺ celler til at knytte og danne organoids når Co kulturperler. Denne tilgang, betegnes som "organoid rekonstitution assay" (ORA), tillader den genetiske og biokemiske ændring af Paneth eller Lgr5⁺ stamceller, efterfulgt af rekonstituering i organoids. Som sådan, det giver mulighed for den funktionelle analyse af de to vigtigste komponenter i tarm stamcelle niche.

Introduction

Den intestinale epitel er den mest hurtigt selv fornyelse væv i pattedyr kroppen og som sådan har været genstand for et utal af undersøgelser med henblik på identifikation og funktionel karakterisering af de voksne stamceller bosat nederst i krypten af Lieberkühn, øremærkede ved ekspression af Lgr5 -gen og afhængige af canonical Wnt signaler¹. Især, er Lgr5⁺ stamceller flankeret og støttet af specialiserede niche celler, dvs Paneth cellerne, som også afhænger af Wnt signalering til deres modning². Sammen, disse to celletyper ligge til grund for self-fornyelse af den intestinale epitel foring og bevare den daglige homeostatiske balance: Lgr5⁺ stamceller hurtigt dividere og give anledning til Stamform og mere specialiseret intestinale epitel celler; Paneth cellerne give væsentlige niche faktorer (f.eks.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5⁺ stilk celler². Kapacitet af intestinal Krypter når forgyldt ex vivo til at danne organiseret og selvstændig fornyelse strukturer kaldes organoids, eller "mini-modet", er blevet udnyttet som en eksperimentel redskab til at give indsigt i processer som selvfornyelse og differentiering i normale og patologiske betingelser herunder kræft⁴. Organoid kulturer har været etableret fra flere væv, herunder tarm, bugspytkirtel, lever og nyrer, fra både musen og menneskelige prøver⁴. Metoden udvinding og vækstfaktorer ansat til at udvikle disse organoid kulturer er væv-specifikke og designet til at køre flere lineage differentiering og efterligner så tæt som muligt de oprindelige stamceller niche in vivo. Organoids kan have potentielle applikationer, herunder behandling af genetiske sygdomme, vurderingen af den terapeutiske virkning i kræft, analyse af lægemiddeltoksicitet eller studiet af organogenesis in vitro-⁵.

Samlet set er den største begrænsning af organoid kulturer når etableret fra vævsprøver manglende celle-specificitet. For eksempel tarm organoids etableret fra hele tarm Krypter ikke tillader analyse af enkelte cellulære komponenter omfattede inden for væv kilde (f.eks.hele Krypter indeholder Lgr5⁺, Paneth, og stamceller).

Her, beskriver vi en roman metode, betegnes som ORA, der kombinerer fordelene ved tarm organoid kulturer med den funktionelle analyse af dets mest grundlæggende komponenter, nemlig stilk (Lgr5⁺) og niche (Paneth) celler. Dette opnås gennem en unik evne af Paneth og Lgr5⁺ celler for at fysisk forbinder med hinanden når Co udruget og give anledning til organoids^2,6,10. Vi tog fordel af denne funktion og forbehandlet to celletyper individuelt før den tillader dem at rekonstruere organoids. Når du laver så hver celle komponent kan blive udsat for enhver given stof, vækstfaktor, biokemiske inhibitor, genetisk modifikation eller kemisk behandling inden rekonstitution og organoid dannelse. Derfor vil tillade bruge ORA assay bestemmelse af om en specifik behandling eller genetisk modificering har en specifik virkning på stamcellerne eller deres niche modstykke.

Protocol

Alle procedurer blev gjort lokale dyrevelfærd love og retningslinjer.

1. forberedelse af instrumenter, dyrkningsmedier og retter

1. Autoklave 1 sæt intestinal saks, normal saks og pincet i en steril beholder.
2. Sted en 96-brønd (flad bund) fad i en inkubator ved 37 ° C.
3. Forberede 10 mL af komplet næringssubstratet med de reagenser, der er anført i tabel af materialer.
4. Inkuber den fuldstændige medium ved 37 ° C i et vandbad.
5. Tø rekonstitueret basalmembranen ved at placere den i en isspand. Rekonstitueret basalmembranen bliver flydende ved 4 ° C.
6. Fyld 4 petriskåle med kolde fosfatbufferet saltopløsning eller forkortet PBS (4 ° C).

2. isolering af lille tarm Krypter

1. Ofre af CO₂ indånding en Lgr5- eGFP-IRES-CreER^t2 mus på en C57BL6/J baggrund. Dissekere bughinden på langs med en saks.
2. Hold maven med pincet og skære det sprængsnorene i halve.
3. Ved hjælp af intestinal saks fra nu af, trække sig ud af tarmen og placere det i en petriskål, som indeholder PBS.
   Bemærk: Tarm saks har en skarp og en stump spids. Den stumpe spids af disse saks er beregnet til at skade krypt-villus arkitektur under åbningen af tarmen.
4. Start ved at placere den stumpe spids ind i maven og forsigtigt skubbe det gennem pylorus. Fortsætte ved at skære med saks og trække med pincet.
5. Når hele tyndtarmen er åbnet på langs, vaske det i koldt PBS ved at holde det med pincet og forsigtigt skylle det i PBS løsning med U-formede bevægelser.
6. Når alle taburet resterne er ryddet, fortsætte med at flade tarmen på et skærebræt, luminale side op. Den luminale side er let genkendeligt ved fravær af blodkar og af dens bleg udseende sammenlignet med den ydre del.
7. Med et glas dias, forsigtigt fjerne villi ved skrabning den fladtrykte tarmen. Udføre dette trin to gange langs hele længden af væv.
8. Skær tyndtarmen med en steril kirurgiske kniv i 2-5 mm udskæringer.
9. Placer de lille tarm fragmenter i en 50 mL tube indeholder 10 mL af is kold PBS.
10. Rense væv fragmenter, at fjerne enhver resterende urenheder af pipettering dem op og ned i PBS. Kassér supernatanten og Gentag dette trin, indtil PBS er helt klart.
11. Tilføj 15 mL koldt PBS, for at bringe den samlede endelige mængden af PBS til 25 mL. Tilføj 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) og Inkuber i 45 min på en rulle på 4 ° C.
12. Kassér PBS/EDTA.
13. Der tilsættes 10 mL PBS og frigør Krypter ved hårdt pipettering væv fragmenter op og ned (mindst tre gange). Indsamle supernatanten.
14. Gentag trin 2.13 fire gange. Tilføje næringssubstrat for at nå en endelige rumfang paa 50 mL.
15. Sammenpresse cellerne ved centrifugering (300 x g for 5 min).
16. Resuspenderes i 10 mL af næringssubstratet og pellet Krypter ved centrifugering (80 x g i 3 min).

3. enkelt celle forberedelse

1. Supernatanten pelleted krypter og resuspend dem i 1 mL trypsin lignende-enzymer sammen med 50 µL DNAse (50 µg/mL).
2. Inkuber celler i et vandbad ved 32 ° C i 2 min.
3. Der tilsættes 10 mL af næringssubstratet. Adskille Krypter i enkelte celler ved hårdt pipettering op og ned i det mindste 5 gange.
4. Opløsningen filtreres gennem et 40 µm si (til at fjerne klumper og andre urenheder) og pellet de enkelte celler ved 300 x g i 5 min.

4. flow flowcytometri og Plating

1. Forberede 50 mL 1 x Hank salt bufferopløsning eller HBSS/2% føtal ko serum (FCS) og resuspenderes i 1 mL for hver 10⁶ celler
2. Tilføje til cellesuspension BV421 Lin^- (CD31, CD45, TER119) ved en koncentration på 1: 100, og CD24-APC og CD117-PE begge på en koncentration af 1:250 antistoffer i 30 min.
3. Form Lgr5⁺ stamceller og Paneth cellerne i separate lav binde rør. Yderligere oplysninger om sorterings protokoller for Lgr5⁺ og Paneth cellerne, se venligst Roth et al. ⁷ og Schewe et al. ⁶
   1. De sorterede celler ved 300 x g i 5 min. Resuspend celler i 100 µL medium med de komponenter, der er beskrevet i 1.3 der centrifugeres (Se Tabel af materialer).
4. Behandling (f.eks.af kemiske eller genetiske modifikation) Paneth cellerne (n = 2000) eller stamceller Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. For at behandle celler, bruge 5 µL Liposom-medieret Transfektion reagens i en samlet maengde paa 100 µL næringssubstratet og små interfererende RNA (siRNA) ved en koncentration på 100 nM. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C for siRNA eller for den nødvendige tid til den valgte ændring.
5. Vaske cellerne to gange i 500 µL næringssubstratet.
6. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min og resuspend celler i 10 µL næringssubstratet.
7. Pool to cellulære komponenter (Paneth eller Lgr5⁺ celler) i en 20 µl samlede volumen og centrifugeres ved 300 x g i 5 min på RT.
8. Co Inkuber Paneth og Lgr5⁺ celler i 10 min på RT.
9. Fjerne 10 µL af supernatanten og forlade en menisken væske være sikker på at ikke Aspirér celle pellet.
10. Tilføje 30 µL rekonstitueret basalmembranen til cellerne for en samlet maengde paa 40 µL, resuspend cellerne og plade i en pre varmede 96 godt plade. Efter 10 min, tilsættes 200 µL af komplette mellemstore (Se Tabel af materialer). Skift mellem hver 48 timer.
11. Grev organoid mangfoldighed på dag 5.

Representative Results

Organoid rekonstitution assay tillader den separate funktionelle analyse af de væsentlige niche og stamceller komponenter i den intestinale epitel, her vist ved små interfererende RNA (siRNA) af Apc -genet.

For at nå dette mål må udnyttet vi først fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) for at adskille 8000 Lgr5⁺ celler og 6000 Paneth cellerne fra indavlede C57BL6/J mus. I figur 1a, er et rutediagram ORA assay afbildet. Organoid rekonstitution kapacitet blev vurderet ved at inkubere Lgr5⁺ celler med siRNA oligonukleotider rettet mod mRNA af Apc eller omfatter en scrambled sekvens (SCR) som en kontrol. Efter behandling, var de samme siRNA-behandlede Lgr5⁺ celler enten direkte belagt i organoid medium/rekonstitueres basalmembranen, eller inkuberes med et tilsvarende antal ubehandlet Paneth cellerne og efterfølgende forgyldt ud. Som kontrol, ubehandlet Lgr5⁺ celler blev forgyldt alene (dvs.uden Paneth cellerne) til at bestemme antallet af organoids stammer fra ubehandlet Lgr5⁺ celler. Desuden som en ekstra kontrol, var Paneth cellerne alene belagt for at kontrollere, om der på baggrund af organoid dannelse afledt af kontaminering af Paneth-Lgr5 celle dubletter sorteres i Paneth celle gate. Som forventet, påvirket siRNA medieret knockdown af murine Apc -genet i Lgr5⁺ stamceller (og de deraf følgende aktivering af den kanoniske Wnt/β-catenin signalvejen) positivt organoid mangfoldighed i forhold til ubehandlet modparter eller kontrolelementet krypteret (figur 1B). Den konstitutive Wnt aktivering reddede også kravet om Paneth cellerne, som tidligere rapporteret¹. Desuden, disse organoids dukkede op som hule kugler (spheroids), et godt beskrevet fænotype for Apc-mutant eller Wnt-stimuleret organoids (figur 1 c, bedømmelseskomite 1), sammenlignet med morfologi af dem, der opnås fra Paneth-Lgr5 celle dubletter (figur 1 C, bedømmelseskomite 2)^8,9. Kollektivt, disse resultater viser, at retablere Paneth cellerne og Lgr5⁺ celler kan give indsigt på celle-specifikke mekanismer inden for disse to celletyper; morfologisk analyse af organoids ved mikroskopi kan være værdifulde i denne henseende, da organoids morfologi afspejler deres celle sammensætning (fxspheroids udgøres af Lgr5⁺ celler kun). Et andet vigtigt parameter at tages i betragtning er kompleksiteten af organoid (fx, antallet af crypt spirende begivenheder).

Figur 1. Effekt af siRNA medieret knockdown af Apc i Lgr5⁺ celler. (A) rutediagram af forsøgsmetoden. Lgr5 ^EGFP reporter mus (Lgr5^{EGFP-IRES-creERT2})¹ var ansat som en kilde til Lgr5⁺ sorteret stamceller. Paneth cellerne blev sorteret som anført og tidligere beskrevne^6,7. (B) Organoid mangfoldighed observeret efter rekonstituering af Lgr5⁺ stamceller og Paneth cellerne. Når angivne celler blev forbehandlet med siRNA oligonukleotider rettet mod Apc (siRNA Apc) eller scrambled (SCR) kontrolsekvens. Stjernerne angiver statistisk signifikante forskelle (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0,001). Fejllinjer refererer til celler, SD. (1) Lgr5⁺ , (2) Lgr5⁺ celler SCR, (3) Lgr5⁺ celler siRNA Apc, (4) Lgr5⁺ celler + Paneth cellerne, (5) Lgr5⁺ celler siRNA Apc + Paneth cellerne, (6) Paneth cellerne. (C) repræsentative billeder af organoids stammer fra (1) Lgr5⁺ celler siRNA Apc, (2) Lgr5⁺- Paneth cellerne. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

ORA tillader den raffinerede funktionel analyse af de to væsentlige komponenter i den intestinale stamcelle niche, nemlig Lgr5⁺ og Paneth cellerne. Denne tilgang har tidligere været ansat ved os og andre med mindre ændringer^6,10,11. Vi præsenterer her, ORA procedure som laboratorier reproducerbare og standardiseret protokol. Også, vi rapport om virkningerne af Apc downregulation i Lgr5⁺ stamceller, som et eksempel på muligheden for gennemføre genetiske (eller biokemiske⁶) ændringer af de sorterede cellulære komponenter. Kollektivt, dataene viser, at siRNA medieret knockdown af Apc forbedrer funktionen stamcelle Lgr5⁺ celler, som angivet ved øget organoid mangfoldighed (figur 1B).

Flere fordele ved at bruge intestinal 3D organoid kulturer har allerede været opført i anmeldelser⁴, herunder den slående lighed i deres organisation med at krypt-villus arkitektur i vivo, især sammenlignet med den arkitektur fra standard 2D kultur metoder med udødeliggjort cellelinjer. Men en af de store begrænsninger i denne metode er, at i de fleste tilfælde, organoid kulturer er etableret fra hele tarm Krypter, en proces, som ikke tillader den funktionelle analyse af dens enkelte bestanddele, og især af stænglen og niche celler, her repræsenteret ved Lgr5⁺ og Paneth cellerne, henholdsvis.

ORA overvinder disse begrænsninger. Stængel og niche celler kan være separat sorteret fra dyret og rekonstitueres til at generere organoids. Som sådan, denne tilgang giver mulighed for den funktionelle analyse af disse to cellulære komponenter af enten ansætte musemodeller bærer specifikke genetiske modifikationer eller udsat for specifikke stressfaktorer (f.eks., DSS og/eller specifikke kost); eller ved direkte at ændre de sorterede celler genetisk (siRNA, CRISPR-Cas9) eller biokemisk, før retablere dem til at generere organoids. Mangfoldighed, morfologi, selvfornyelse kapacitet og omfanget af differentiering (og i sidste ende omfanget af metaplastic ændringer) af den resulterende organoids kan være ansat som funktionelle udlæsning. I forbindelse med genetisk manipulation, såsom siRNA, når en morfologisk effekt ikke er indlysende, skal celler analyseres én time efter Transfektion at validere knockdown af mRNA af interesse. Paneth og Lgr5⁺ kan også sorteres fra musene genetisk manipuleret med forskellige mutationer til at undersøge, om forskellige mutationer i stilken og niche celler føre til ændret interaktioner mellem disse to celletyper og en anderledes organoid dannelsen effektivitet og/eller morfologi.

Kritiske trin i protokollen er fjernelse af villi (trin 2.7) og ophvirvling af celler i HBSS/2%FCS (trin 4.1). Fjernelse af villi er afgørende for at berige Paneth og Lgr5⁺ celler placeret i den nederste tredjedel af krypter og at forbedre effektiviteten af sortering. Selv om FACS protokoller foreslå almindeligt sortering celler i PBS/FCS, brug af HBSS i stedet for PBS steg og holdt cellernes levedygtighed stabil gennem hele sortering. Andre vigtige skridt er trin 4.7 og 4.8, hvor fysisk sammenslutning af Paneth og Lgr5⁺ celler tillader disse lineages til form dubletter, der i sidste ende vil give anledning til organoids.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Final concentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin *	Peprotech	250-38	Final concentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Final concentration: 10 µM
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin *	R&D systems	3474-RS-050	Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend	102424
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low binding tubes	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium