Summary
Intestinale organoid culturen van hele crypten gevestigd zijn en laat niet de analyse van zelf-vernieuwing en differentiatie in een cel-specifieke mode. Dit protocol beschrijft reconstitutie van gesorteerde stengel (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen, die aanleiding tot organoids geven terwijl het toelaten van hun voorafgaande biochemische en genetische modificatie en de functionaalanalyse.
Abstract
Het intestinaal epitheel wordt gekenmerkt door een zeer snelle Verwerkingsfrequentie. Bij zoogdieren, wordt de gehele epitheliale bekleding vernieuwd binnen 4-5 dagen. Volwassen intestinale stamcellen bevinden zich aan de onderkant van de crypten van Lieberkühn, door de expressie van het Lgr5 -gen zijn bestemd en homeostase via hun karakteristieke proliferatieve hoog1behouden. In de dunne darm, Lgr5+ stamcellen zijn vermengd met gespecialiseerde secretoire cellen genaamd Paneth cellen. Paneth cellen afscheiden van antibacteriële stoffen (d.w.z., lysozym en cryptdins/defensinen) en het uitoefenen van een controlerende rol op de darmflora. Meer onlangs, is een nieuwe functie voor Paneth cellen, namelijk hun capaciteit niche steun bieden aan de cellen van de stam van Lgr5+ door middel van verschillende belangrijke liganden zoals Wnt3, EGF en Dll12ontdekt.
Als ex vivo geïsoleerd en in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren en componenten van de extracellulaire matrix gekweekt, hele intestinale crypten aanleiding geven tot langlevende en zelf vernieuwen 3D structuren genoemd organoids die sterk lijken op de crypt-villosités epitheliale architectuur van de volwassen dunne darm3. Organoid culturen, als tot stand gebracht van hele crypten, toestaan dat de studie van zelf-vernieuwing en differentiatie van de intestinale stamcel niche, maar zonder een aanpak van de bijdrage van de afzonderlijke onderdelen, namelijk de Lgr5+ en Paneth cellen.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de organoid-bepaling die van de mogelijkheid van Paneth profiteert en Lgr5+ cellen vormen van organoids te koppelen wanneer mede gekweekt. Deze aanpak, aangeduid als de "organoid reconstitutie assay" (ORA), kan de genetische en biochemische wijziging van Paneth of Lgr5+ stamcellen, gevolgd door reconstitutie in organoids. Als zodanig, maakt het de functionele analyse van de twee belangrijkste componenten van de intestinale stamcel niche.
Introduction
Het intestinaal epitheel is is het snelst zichzelf vernieuwende weefsel in het lichaam van zoogdieren en, als zodanig, het object van een overvloed aan studies gericht op de identificatie en functionele karakterisering van de volwassen stamcellen, wonende aan de onderkant van de crypte van Lieberkühn, gereserveerde door expressie van het Lgr5 -gen en afhankelijk van de canonieke Wnt signalen1. Met name zijn de cellen van de stam van de Lgr5+ geflankeerd en ondersteund door gespecialiseerde niche cellen, d.w.z. de Paneth cellen, die ook afhankelijk zijn van de Wnt signalering voor hun rijping2. Samen, deze twee celtypes ten grondslag liggen aan de zelf-vernieuwing van de epitheliale darmwand en het dagelijkse homeostatische evenwicht bewaren: Lgr5+ stamcellen snel verdelen en aanleiding geven tot voorlopercellen en meer gespecialiseerde intestinale epithelial cellen; Paneth cellen essentiële niche factoren (bijvoorbeeld, Dll1, Wnt3, EGF) geven Lgr5+ 2van de cellen van de stam. De capaciteit van intestinale crypten wanneer vergulde ex vivo vormen van georganiseerde en zichzelf vernieuwend structuren organoids, of "mini-guts", genoemd als een experimenteel hulpmiddel om inzicht in processen zoals zelf-vernieuwing is benut en differentiatie in normale en pathologische omstandigheden waaronder kanker4. Organoid culturen zijn verschillende weefsel, met inbegrip van de darm, de alvleesklier, de lever, en de nier, zowel muis als menselijke specimens4vastgesteld. De extractiemethode en de groeifactoren werkzaam te ontwikkelen deze organoid culturen zijn weefsel-specifieke en ontworpen om te rijden meerdere lineage differentiatie en bootsen zo dicht mogelijk de oorspronkelijke cel van de stam-niche in vivo. Organoids wellicht potentiële toepassingen met inbegrip van de behandeling van genetische ziekten, de beoordeling van de therapeutische werking in kanker, de analyse van de drug toxiciteit of de studie van de organogenese in vitro5.
De belangrijkste beperking van organoid culturen als van weefselmonsters tot stand gebracht is over het algemeen een gebrek cel-specificiteit. Bijvoorbeeld, intestinale organoids vastgesteld van hele intestinale crypten niet toestaan de analyse van individuele cellulaire componenten omvatte binnen de bron van het weefsel (bvhele crypten bevatten Lgr5+, Paneth, en voorlopercellen).
Hier beschrijven we een nieuwe methode, hierna aangeduid als ORA, die de voordelen van intestinale organoid culturen met de functionele analyse van de meest fundamentele onderdelen, namelijk stam (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen combineert. Dit wordt bereikt door het unieke vermogen van Paneth en Lgr5+ cellen om fysiek te koppelen aan elkaar wanneer mede geïncubeerd en aanleiding tot organoids2,6,10 geven. Wij maakte gebruik van deze functie en vooraf behandeld de twee celtypes individueel alvorens deze te reconstrueren organoids. Daarbij elk onderdeel van de cel kan worden blootgesteld aan bepaalde drug, groeifactor, biochemische remmer, genetische modificatie, of chemische behandeling voorafgaand aan de reconstructie en de vorming van de organoid. Met behulp van de ORA bepaling staat dan ook toe de bepaling van de vraag of een specifieke medicamenteuze behandeling of genetische modificatie een bepaald effect op de cellen van de stam of de wederpartij van hun niche heeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden gedaan volgens lokale dierenwelzijn wetten en richtlijnen.
1. voorbereiding van de instrumenten, cultuurmedia en gerechten
- Autoclaaf 1 set van intestinale schaar, normale schaar en pincet in een steriele container.
- Plaats een 96-Wells (platte bodem) schotel in een incubator bij 37 ° C.
- 10 mL van volledige voedingsbodem voor te bereiden met de reagentia die zijn vermeld in tabel van materialen.
- Incubeer het volledige medium bij 37 ° C in een waterbad.
- Ontdooi gereconstitueerde kelder membraan door deze te plaatsen in een ijsemmer. De gereconstitueerde kelder membraan wordt vloeibaar bij 4 ° C zijn.
- Vul de 4 petrischalen met koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing of afgekort PBS (4 ° C).
2. isolatie van kleine intestinale crypten
- Offeren bij CO2 inademing een muis - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5op een C57BL6/J-achtergrond. Ontleden van het buikvlies lengterichting met een schaar.
- Houd de maag met de pincet en snijd het textielgedeelte in tweeën.
- Met behulp van de intestinale schaar van nu af aan, trek de darm en plaatst u deze in een petrischaal met PBS.
Opmerking: Intestinale schaar hebben een scherpe en een botte tip. Het botte uiteinde van deze schaar is bedoeld om de crypt-villosités architectuur niet te beschadigen tijdens het openen van de darm. - Start door het plaatsen van het botte uiteinde in de maag en duw het voorzichtig door de pylorus. Ga door met de schaar af te snijden en trekken met de pincet.
- Zodra de hele dunne darm lengterichting wordt geopend, het wassen in koud PBS positie houden met de pincet en spoel het zachtjes in de PBS-oplossing met U-vormige bewegingen.
- Zodra alle restanten van de ontlasting zijn uitgeschakeld, gaat u verder met het afvlakken van de darm op een snijplank, luminal kant naar boven. De luminal kant is gemakkelijk te herkennen door het ontbreken van bloedvaten en door zijn bleke verschijning in vergelijking met het buitenste gedeelte.
- Met een glasplaatje, zachtjes de villi door schrapen de afgevlakte darm te verwijderen. Voer deze stap tweemaal over de gehele lengte van het weefsel.
- Snijd de dunne darm met een steriele chirurgische mes in stukken van 2-5 mm.
- Plaats de kleine intestinale fragmenten in een tube van 50 mL met 10 mL ijs koud PBS.
- Reinig de weefsel fragmenten, verwijderen van alle resterende onzuiverheden waarbij ze op en neer in de PBS. Vloeistof wordt weggeworpen en herhaal deze stap totdat de PBS volledig duidelijk is.
- Voeg toe 15 mL koude PBS, om de totale eindvolume van PBS tot 25 mL. Voeg 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 45 minuten op een roller bij 4 ° C.
- Gooi de PBS/EDTA.
- Voeg 10 mL PBS en loskoppelen van de crypten hard waarbij de fragmenten van het weefsel op en neer (ten minste driemaal). De bovendrijvende vloeistof te verzamelen.
- Herhaal stap 2.13 vier keer. Voeg kweekmedium te bereiken een eindvolume van 50 mL.
- Pellet de cellen door middel van centrifugeren (300 x g gedurende 5 minuten).
- Resuspendeer de pellet in 10 mL gestolde voedingsbodem- and -pellet de crypten door middel van centrifugeren (80 x g gedurende 3 minuten).
3. eencellige voorbereiding
- Verwijder het supernatant van de Ingehuld crypten en resuspendeer hen in 1 mL trypsine achtige-enzymen samen met 50 µL DNAse (50 µg/mL).
- Incubeer de cellen in een waterbad bij 32 ° C gedurende 2 minuten.
- Voeg 10 mL gestolde voedingsbodem. De crypten distantiëren in afzonderlijke cellen door hard pipetteren omhoog en omlaag minstens 5 keer.
- Filtreer de oplossing door een zeef 40 µm (te elimineren bosjes en andere verontreinigingen)- and -pellet van de afzonderlijke cellen bij 300 x g gedurende 5 min.
4. Stroom Cytometry en beplating
- 50 mL 1 x Henks gebufferde zoutoplossing of HBSS/2% foetale koe serum (FCS) oplossing voor te bereiden en resuspendeer de pellet in 1 mL voor elke 106 cellen
- Voeg toe aan de celsuspensie BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119) met een concentratie van 1:100, en CD24-APC en CD117-PE zowel bij een concentratie van 1:250 antilichamen voor 30 min.
- Sorteren Lgr5+ stamcellen en Paneth cellen in aparte laag binden buizen. Voor meer informatie over het sorteren van protocollen voor Lgr5+ en Paneth cellen, zie Roth et al. 7 en Schewe et al. 6
- De gesorteerde cellen bij 300 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 100 µL medium met de onderdelen beschreven in 1.3 centrifuge (Zie de Tabel van de materialen).
- De Paneth cellen (bijvoorbeelddoor chemische of genetische modificatie) te behandelen (n = 2000) of de cellen van de stam van de Lgr5+ (n = 2000).
- Voor de behandeling van cellen, 5 µL van liposoom-gemedieerde transfectiereagens te gebruiken in een totaal volume van 100 µL cultuurmedium en Klein Mengend RNA (siRNA) met een concentratie van 100 nM. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor siRNA of voor de tijd die nodig is voor de gekozen wijziging.
- Wassen van de cellen tweemaal in 500 µL cultuurmedium.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in 10 µL cultuurmedium.
- Zwembad de twee cellulaire componenten (Paneth of Lgr5+ cellen) in een 20 µl totale volume en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
- Incubeer mede de Paneth en Lgr5+ cellen voor 10 min op RT.
- 10 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen en laat een meniscus van vloeistof om zeker te zijn niet gecombineerd de cel-pellet.
- Voeg 30 µL van gereconstitueerde kelder membraan naar de cellen voor een totaal volume van 40 µL en resuspendeer de cellen plaat in een voorverwarmde 96 goed bord. Na 10 min, voeg 200 µL van volledige medium (Zie de Tabel van de materialen). Verandering medium elke 48 uur.
- Graaf organoid multipliciteit bij dag 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bepaling van de reconstitutie organoid kunt de aparte functionele analyse van de essentiële onderdelen van de niche en cel van de stam van het intestinaal epitheel, hier gedemonstreerd door Klein Mengend RNA (siRNA) van de Apc -gen.
Dit om doel te bereiken, we eerst fluorescerende geactiveerde cell sorting (FACS) om te scheiden van 8000 Lgr5+ cellen en 6000 Paneth cellen van ingeteelde C57BL6/J-muizen gebruikt. In Figuur 1a, is een stroomdiagram van de ORA-assay afgebeeld. Organoid reconstitutie capaciteit werd beoordeeld door broeden Lgr5+ cellen met siRNA oligonucleotides gericht tegen de mRNA van Apc of omvat een gecodeerde reeks (SCR) als een besturingselement. Na de behandeling, werden dezelfde siRNA-behandeld Lgr5+ cellen ofwel rechtstreeks in organoid medium/gereconstitueerd kelder membraan, vergulde of geïncubeerd met een gelijk aantal onbehandelde Paneth cellen en vervolgens verguld uit. Als een besturingselement, onbehandelde Lgr5+ cellen werden verguld alleen (dat wil zeggen, zonder Paneth cellen) om te bepalen van het aantal organoids afgeleid van onbehandelde Lgr5+ cellen. Bovendien, als een extra controle, waren Paneth cellen alleen verguld om te controleren op de achtergrond van de organoid formatie afgeleid van de besmetting van Paneth-Lgr5 cel paren gesorteerd in de poort van de cel Paneth. Zoals verwacht, beïnvloed siRNA gemedieerde knockdown van het lymfkliertest Apc -gen in de cellen van de stam van de Lgr5+ (en de daaruit voortvloeiende activering van de canonieke Wnt/β-catenine signalering pathway) positief organoid veelheid in vergelijking met onbehandelde tegenhangers of het gecodeerde besturingselement (figuur 1B). De eis voor Paneth cellen, gered de constitutieve Wnt activering ook als eerder gemeld1. Bovendien, deze organoids verscheen als holle bollen (spheroïden), een goed beschreven fenotype voor Apc-mutant of Wnt-gestimuleerd organoids (Figuur 1 c, 1 paneel), in vergelijking met de morfologie van de verkregen Paneth-Lgr5-cel paren (Figuur 1 C, panel 2)8,9. Collectief, deze resultaten tonen aan dat bijenpopulatie Paneth cellen en Lgr5+ cellen kunnen inzicht geven op cel-specifieke mechanismen binnen deze twee celtypes; morfologische analyse van de organoids door microscopie kunnen waardevol zijn in dit opzicht aangezien de morfologie van de organoids de samenstelling van hun cel weerspiegelt (bijvoorbeeldspheroïden worden gevormd door Lgr5+ alleen cellen). De complexiteit van de organoid (bijvoorbeeld, het aantal crypt ontluikende gebeurtenissen) is een andere belangrijke parameter in aanmerking worden genomen.
Figuur 1. Effect van siRNA gemedieerde knockdown voor Apc in Lgr5+ cellen. (A) een stroomschema van de experimentele procedure. Lgr5 EGFP reporter muizen (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 werkten als een bron van Lgr5+ gesorteerd op stamcellen. Paneth cellen werden gesorteerd als aangegeven en eerder beschreven6,7. (B) Organoid multipliciteit waargenomen na reconstitutie van de cellen van de stam van de Lgr5+ en Paneth cellen. Wanneer de aangegeven cellen werden voorbehandeld met siRNA oligonucleotides gericht tegen de Apc ( ApcsiRNA) of vervormd (SCR) sequentie. De sterretjes geven statistisch significant verschillen (n = 3, * p < 0.05 ** p < 0,001). Foutbalken verwijzen naar cellen van de SD. (1) Lgr5+ , (2) Lgr5+ cellen SCR, (3) Lgr5+ cellen siRNA Apc, (4) cellen van de Lgr5+ + Paneth cellen, (5) Lgr5+ cellen siRNA Apc + Paneth cellen, (6) Paneth cellen. (C) representatieve beelden van organoids afgeleid van (1) Lgr5+ cellen siRNA Apc, (2) Lgr5+- Paneth cellen. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ORA kunt de verfijnde functionele analyse van de twee wezenlijke basiscomponenten van de intestinale stamcel niche, namelijk Lgr5+ en Paneth cellen. Deze aanpak heeft eerder gewerkt door ons en anderen met lichte wijzigingen6,10,11. Hier presenteren we de ORA-procedure als een reproduceerbare en gestandaardiseerde laboratorium protocol. Ook wij rapporteren over de gevolgen van Apc Downregulatie in de cellen van de stam van de Lgr5+ , als een voorbeeld van de invoeringsmogelijkheden van genetische (of biochemische6) wijzigingen in de gesorteerde cellulaire componenten. Collectief, uit de gegevens blijkt dat siRNA gemedieerde knockdown van Apc verbetert de functie van de cel van de stam van Lgr5+ cellen, zoals aangegeven door de veelheid van verhoogde organoid (figuur 1B).
Enkele voordelen van het gebruik van intestinale 3D organoid culturen zijn al opgenomen in beoordelingen4, met inbegrip van de opvallende gelijkenis van hun organisatie met die van het crypt-villosités het platform in vivo, vooral vergeleken met de architectuur van standaard 2D kweekmethoden met vereeuwigd cellijnen. Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode is echter dat in de meeste gevallen organoid culturen zijn gevestigd van hele intestinale crypten, een proces dat niet de functionele analyse van de individuele componenten en toelaat, in het bijzonder, van de stam en de niche cellen, hier vertegenwoordigd door Lgr5+ en Paneth cellen, respectievelijk.
De ORA overwint deze beperkingen. Cellen van de stam en niche kunnen afzonderlijk worden gesorteerd van het dier en voor het genereren van organoids gereconstitueerd. Als zodanig deze aanpak laat de functionele analyse van deze twee cellulaire componenten door beide gebruikmaking Muismodellen uitvoering van specifieke genetische modificaties of blootgesteld aan specifieke stressfactoren (b.v., DSS en/of specifieke diëten); of rechtstreeks wijzigen de gesorteerde cellen genetisch (siRNA, CRISPR-Cas9) of biochemically, vóór hen voor het genereren van organoids bijenpopulatie. De multipliciteit, morfologie, zelf-vernieuwing capaciteit en mate van differentiatie (en uiteindelijk de omvang van metaplastic veranderingen) van de resulterende organoids kunnen worden gebruikt als functionele read-outs. In het geval van genetische manipulatie, zoals siRNA, wanneer een morfologische effect niet duidelijk is, moeten cellen worden geanalyseerd één uur na de Transfectie te valideren de knockdown van de mRNA van belang. Paneth en Lgr5+ kunnen ook worden gesorteerd van Muizen genetisch gemanipuleerde met verschillende mutaties om te studeren of verschillende mutaties in de cellen van de stam en niche tot gewijzigde interacties tussen deze twee celtypes en een verschillende organoid leiden vorming efficiëntie en/of morfologie.
Kritische stappen in het protocol zijn de verwijdering van de villi (stap 2.7) en de resuspensie van de cellen in de HBSS/2%FCS (stap 4.1). Verwijdering van de villi is cruciaal voor het verrijken van Paneth en Lgr5+ cellen gelegen in het onderste derde van de crypten en ter verbetering van de doeltreffendheid van sorteren. Hoewel FACS protocollen meestal sorteren van cellen in PBS/FCS wijzen, het gebruik van HBSS in plaats van PBS verhoogd en levensvatbaarheid van de cellen gedurende de sorteer tijd stabiel. Andere belangrijke stappen zijn stappen 4.7 en 4.8, waar fysieke vereniging van Paneth en Lgr5+ cellen kunt deze lineages aan formulier-paren die uiteindelijk aanleiding tot organoids geven zal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten
Acknowledgments
Deze studie werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Nederlandse Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) en het wereld kanker onderzoek middelen International (WCRF; project no. 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
