Summary
Işık büyük birimlerde en az çapı ile teslim etmek için bir doku delici ışığının oluşturmak için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Bu iletişim kuralı optogenetic manipülasyonlar insan dışı primat beyin için geliştirilmiş bir büyük hacimli ışığı açıklar. Işık yüzey alanı yayan maddedir ışığı ile kazınmış uç, değiştirilmiş bir plastik optik fiber böyle > 100 x o geleneksel bir elyaf. İnşaat büyük hacimli ışığının açıklayan ek olarak, bu iletişim kuralı bile hafif dağıtım sağlamak için kullanılan kalite kontrol kalibrasyon ayrıntıları. Ayrıca, bu iletişim kuralını ekleme ve büyük hacimli ışığı kaldırmak için teknikler açıklanır. Yüzeysel ve derin yapıları aydınlatılmış. Bu büyük hacimli ışığı fiziksel olarak bir elektrot birleştiğinde olabilir gerekmez ve ışığı, değil cam, plastik çünkü geleneksel optik lifler paramparça ne zaman o sadece durumlarda Bükülür. Bu ışığı davranışsal ilgili doku birimlerde (≈ 10 mm3) daha fazla penetrasyon hasar daha geleneksel bir fiber optik ile ışık sunar çünkü davranış çalışmalar optogenetics insan dışı primatlar kullanarak kolaylaştırır.
Introduction
Milisaniye kesin, ışık odaklı nöronal denetimi için izin Optogenetic araçları yaygın fonksiyonel fizyolojisi ve kemirgenler ve omurgasızlar davranışı incelemek için kullanılır. Ancak, teknik sorunlar optogenetics ~ 100 x kemirgen beyin 1' den daha büyük bir hacme sahip insan dışı primat beyin kullanımı sınırlı olabilir.
İnsan dışı primatlar çalışmalarda optogenetics kolaylaştırmak için bir ışığı iki rakip gol gidermek amacıyla tasarlanmıştır: büyük hacimli aydınlatma ve en az penetrasyon hasar. Adres bu kaygıları için önceki girişimleri diğer pahalı geldim. Demetleri lifleri aydınlatmak daha büyük birimleri ancak artan çap ve böylece, hasar2,3. Konik cam elyaf azaltmak penetrasyon hasar, ancak dar odak ışık ışık yüzey alanlarını yayan < 100 µm2 4,5. Dış beyin aydınlatma dura bir pencereden sınama penetrasyon hasar kaçınmanızı sağlar ve büyük hacimli aydınlatma için izin verebilir, ancak yalnızca bir kaç yüzeysel beyin alanları6için kullanılabilir.
Büyük hacimli, küçük çaplı ışığı (Şekil 1a) oluşturmak için bir plastik fiber konik ısıdır ve çekirdek ve kaplama optik ucu (Şekil 1bc) kazınmış. Işık dar bir noktaya odaklanmak diğer konik lifleri, gravür ışık eşit olarak dışarı belgili tanımlık uç, böylece, ışık geniş geniş bir alanı (şekil 1 de) dağıtma kenarlarında kaçmak izin verir. Penetrasyon hasar penetrasyon çapı için orantılı, bu ışığı penetrasyon hasarı daha geleneksel bir lif vardır, henüz o vardır çünkü > 1 ile daha geniş yüzey alanı ve sunar ışığı yayan ışık x 100/100 ışık güç bir beyin hayalet (%1,75 özel) dansitesi (şekil 1e). Onlar kendi ışık yayan yüzeyler eşit ışık güç yoğunlukları varken Monte Carlo modeli (şekil 1f) hafif formada geleneksel bir elyaf ve büyük hacimli ışığı arasındaki farkı gösterir. Her ışığı tek tek (şekil 2a, b) ucu (Şekil 2 c) boyunca bile hafif dağıtım sağlamak için entegre bir küre kullanılarak kalibre edilmiş.
Bu büyük hacimli ışığı davranış ve insan dışı primatlar nöronal ateş etmeye optogenetic manipülasyon ile doğrulandı. Fiber ucu uzunluğu herhangi bir beyin bölgesinde ve her hayvanın bireysel alıcı alan eşleştirme için özelleştirilebilir. Işığı aydınlatma uzunluğu span nöronal kayıtları için derinlemesine bir elektrot ile eşleştirilmiş. Çünkü lif herhangi bir renk görünür ışığın taşıyabilir, Ayrıca, bu herhangi bir kullanılabilir kullanılabilir optogenetic molekülleri ile eşleştirilmiş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: tüm hayvan yordamlar NIH kılavuzlarınıza uygun olarak vardı ve tarafından Massachusetts Institute of teknoloji Komitesi hayvan bakım kabul edildi.
1. ışığı imalat
- 250 µm çapı plastik en az 10 cm istenen toplam ışığı uzunluktan daha uzun olan fiber optik bir bölümünü kesmek için keskin makas çifti kullanın.
- 15-20 cm polietilen ceket plastik fiber optik 22 ölçüm tel striptizci kullanarak bir ucundan kaldır.
- Distal güvenli bir tablo mengene kelepçe lif soyulmuş ucunun çoğu 3-5 cm.
- Lif ceketli sonu gergin bir sürekli sabit çekme ile bir elinde tut. Fiber ahlak dik yere paralel olmalıdır. Isıtma ve soğutma bu incelir gibi lif düz ve gergin kalması (adımları 1,5 ve 1,6 aşağıdaki) boyunca lif üzerinde sürekli bu gerginlik korumak.
- Çift sıcaklık ısı tabancası (570/1000 ° F,), en düşük fiyat ayarı kullanarak fiber soyulmuş bölüm çapı 60-100 mikron veya insan saçı çapını hakkında için inceltilerek kadar ısı.
- Sürekli gerginlik üzerinde lif lif soğutmak izin verirken korumak. Başarısızlık gerginlik korumak için kıvırmak lif neden olabilir.
- Diseksiyon mikroskop altında inceltilmiş uç çapı onaylayın. Alternatif olarak, bunun yerine Çap pergeli birini kullanabilirsiniz.
- Fiber yeterince ince değil, 1.4 ile 1.6 istenen uç çapı ulaşmak için gerektiği gibi yineleyin.
- İsteğe bağlı yeniden çekerek eğer koyarsanız küçük bir işareti lif en dar kısmı böylece ısı silah ortasına lif en dar kısmı hedefleyen bu tekrar ısıtılmış.
- Lif çok ince ise, baştan.
- Fiber tam soğuduktan sonra elde istenen çap, lif en dar noktası 3 cm üstünde ikisinden biri yan çimdik. Hızlı bir çekme lif ekseni boyunca keskin, konik ipucu oluşturmak için iki ayrı.
- Altında bir düşük güç (örneğin, 4 X) konik uç diseksiyon mikroskop üstünde inceleyin. Ucu çatallı veya ( şekil 1f) kıvrılmış, fiber atın. Laboratuvar bant son 5 mm maruz bırakarak uç, sonuna yakın bir parçası yerleştirerek konik ucunu Etch
- hazırla. Bant gravür ışık emisyon İstenilen uzunlukta yukarıda lif korur. Bu ipucu uzunluğu primat korteks hedef bölgedeki kalınlığına göre seçildi. Daha uzun veya daha kısa uzunluğu aydınlatma istenilen uzunluğa bağlı olarak maruz olabilir. Farklı etch ucu uzunluğu isterseniz, laboratuvar bant kenarına yakın için veya uzak konik ucunu taşınabilir.
- , Başparmak ve işaret parmağı arasında küçük (~ 1 inç x 2 inç) kare 5 mikron silikon karbid alıştırma sayfası üzerinden katlayın. Alıştırma sayfası iki taraf arasında fiber ucu yerleştirin ve yavaşça küçük dairesel hareketler kullanarak fiber sanki bir BB başparmak ve işaret parmağı arasında inişli çıkışlı etch. Sık sık tüm tarafların eşit olarak kazınmış lif döndürür. Fiber ipucu görünür “ pürüzlü ” un kazınmış alanları genellikle düzgün görünür iken, kazınmış alanlarda çıplak gözle.
- Sayfası alıştırma 3 μm kalınlığında alüminyum oksit ile tekrar adım 1.11.
- Işığı kazınmış ipucu ters ucunda bir bağlayıcı yapıştırmayın. Bu bir optik kablo veya lazer ışığı sağlar.
Not: Bu yöntem cam tamir için tercih edilen yöntem farklı / silika optik lifler halkalar. Metal yüksük plastik Optik lif, lif ve hakla sonra yapıştırma zarar verebilir bir birim olarak parlatma daha sert plastik fiber optik olarak küçük parçaları metal parlatma işlemi sırasında üretilen çünkü kendilerini düz i ciddi lif katıştırabilirsiniz.- 5 mm polietilen ceket 22 ölçüm tel striptizci kullanarak ışığı ters sonundan kaldırın.
- Ucunu yüzeyi pürüzsüz düz bir sıcak bıçak ile kesmek.
- Gittikçe daha hassas alıştırma ile düz ucunu Lehçe sayfaları: 5 mikron, 3 mikron, 1 mikron ve 0.3 µm.
- Düz eklemek bir 260 µm iç çap paslanmaz çelik yüksük kadar yüksük sonu ile aynı hizada ucunu karşısında.
- Görsel olarak karşı tarafındaki diğer ucuna düzgün ve eşit bir lif mikroskopla parlatılır onaylayın.
- Fiber yüksük kaldırmak ve aşağı dönük fiber yüksük dikey olarak tablonun kenar bant.
- 1 mL şırınga plastik epoksi ile doldurun ve bir künt 18 gauge iğne şırıngaya takın.
- İğne yüksük aşağı epoksi uygulamak için kullanın. Yüksük tamamen epoksi ile doldurmak.
- Lif yüksük takın.
- Herhangi bir aşırı epoksi cilalı yüzey fiber gerekirse kurutma önce ıslak bir hav bırakmayan silin silin. Aksi takdirde, aşırı epoksi-ebilmek var olmak çıkarmak sonra 12-24 h.
- Lif yavaşça kalibrasyon kadar saklamak ve toz kapağı üzerinde yüksük yerleştirin.
2. Işığı kalibrasyon ve kalite kontrol
Not: ışık non-lineer fiber ucundan farklı mesafelerde çıktı için bu yöntemleri kalibrasyon için değerlendirmek. Genellikle düzensiz ışık dağılımı sonuçları bir “ inişli çıkışlı ” veya “ dalgalı ” konik.
- Bir ışık koruyucu oluştur diyafram ışık emici folyo ( Şekil 2) kullanarak entegre küre üst için.
Not: Ne zaman cilt önlemek için folyo emici işleme ışık ışık yansıtan lekeler oluşturmasını yağlar eldiven giymek.- Kat 2 ” 4 ” parça folyo emici üzerinde kendi üzerinde bir 2 oluşturmak için ışık ” x 2 ” Meydanı. alternatif bir yöntem olduğunu bir 2 kesmek için ” x 2 ” kare bir ışık emici yan ve yan (Yani yansıtan bir ışık ile Standart alüminyum folyo bir tarafı); Sonraki adım. diyafram işlemek için sıkıcı bir kenar sağlar ancak, katlanır yöntemi daha güvenlidir
- kat laboratuvar teyp veya olmayan katlanmış kenarları bağlamak için kare kenarları boyunca Elektrik bandı. Bu her iki taraf bir arada tutan ve kesikler keskin kenarlar üzerinden karşı korur.
- 26 gauge iğne kullanarak meydanın ortasına bir delik delmek.
- Entegre küre büyük kap üzerinde çıkarın ve açılması diyafram ile kaplayın. Delik merkezine yerleştirin. Diyafram bir ışık emici ve yan yansıtan bir ışık ile oluşturulursa, yer kadar yan emici ışık ve aşağı, entegre küre içine bakacak şekilde yan yansıtan ışık.
Not: Toz ve enkaz entegre küre girmesini önlemek için ve ortalanmış delik için diyafram laboratuvar bant ile entegre küre dışına güvenli.
- Ölçü hafif bir micromanipulator veya stereotaksik kol ve entegre bir küre kullanılarak 500 µm artışlarla ipucu boyunca çıktı.
Not: Lazer üzerinde olduğunda uygun dalga boyu koruyucu gözlük takılmalıdır.- Fiber karşı tarafındaki diğer ucuna bir lazer veya ışık bağlanmak kaynak, ama henüz çıkış ışık tetiklemek değil.
- Işığı stereotaksik sahibi (prefe için güvenlirably laboratuvar bant ile) ucu sahibinin alt altında 7-10 mm.
- Vida stereotaksik indirdiğimde stereotaksik yuvasına
- Işığı diyafram ortasına delikle hizalayın. İpucu diyafram tam olarak aynı düzeyde olduğunda micromanipulator sıfır.
- Turn off Oda ışıkları ve entegre küre sıfır.
- Lazer (veya diğer ışık kaynağı) tetikler ve entegre küre kullanarak çıkış toplam ışık gücü ölçmek.
Not: Kalibrasyon test etmek için olası en düşük ışık çıkışını kullanın. - Lif 500 µm entegre Küre ve tekrar içine adım 2.2.6 indirin.
- Lif entegre küre düşürücü ve 500 µm artışlarla toplam ışık verimi toplam ışık gücü düzeyleri kapalı kadar ölçme devam
Uyarı: Bir kez tüm belgili tanımlık uç Küre'ye toplam ışık gücü kapalı seviyesine. Fiber düşürmeye devam kazınmış ötesinde daha--dan 1-2 mm uzunluğu ipucu. Entegre küre alt ucu temasa geçerse, o eritebilir ve/veya entegre küre berbat.
- Toplam ışık gücü gibi bir işlev ne kadar lif doğrusallık onaylamak için entegre küre içine düşürüldü çıkış komplo tarafından eşit şekilde kazınmış bir lif onaylayın.
3. Vivo içinde aydınlatma
Not: burada, bu yöntemlerin bir insan dışı primat yerine plastik bir modeli kullanarak gösterilir.
- İmplant 25 mm çapında kayıt odası deneme önce ilgi beyin alan üzerinde implante.
- Deneme önce anatomik manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gerçekleştirin. Odasında bir özel kayıt ızgara koyun ve kılavuz görselleştirme ve dura ve hedef beyin yapıları düzeyde belirlenmesi için izin vermek için steril cerrahi yağ ile doldurun.
- Önce her test oturumu bir kule mikro-yola hazırlayın.
- Ucu eğimli ucu orta ve alt ile 25 ölçüm Kılavuzu tüp üstünde belgili tanımlık götürmek kıskaç. İki kelepçeler Kılavuzu tüp düz kalmasını sağlamak için kullanılır. Bu kelepçeler her ikisi de el ile isterseniz taşınabilirler.
Not: Kılavuzu tüp epoxied veya kelepçeler için lehimli. - Büyük hacimli ışığı aynı sürücüdeki üst kelepçe içinde güvenli. Şunu sıkıca sürücü motor bağlı.
- Büyük hacimli ışığı Kılavuzu tüpünden tamamen iş parçacığı ve ışığı ucu Kılavuzu tüp ipucu uzanır onaylayın.
Not: Kılavuzu tüp ucu olarak beyin zarı mesafeden hedef beyin bölgesinin alt kenar boşluğuna eşittir Geçmiş uzanır ışığı uzunluğu belirlenir üzerinden MRI. - Kılavuz tüp ve ışığı antiseptik çözüm (örneğin, chlorohexidine) sterilize etmek için emmek.
- Ucu eğimli ucu orta ve alt ile 25 ölçüm Kılavuzu tüp üstünde belgili tanımlık götürmek kıskaç. İki kelepçeler Kılavuzu tüp düz kalmasını sağlamak için kullanılır. Bu kelepçeler her ikisi de el ile isterseniz taşınabilirler.
- Temiz oda içinde özel bir steril kılavuz yerleştirin ve bir vida odası tarafında ile önceden belirlenmiş bir yönelim, güvenli. Burada gösterilen kılavuz 1 mm aralığı vardır; Ancak, boşluğu gerektiği gibi özelleştirilmiş olabilir.
Not: Bu kılavuz ve anatomik MRI kullanılan yönlendirme için aynı olması gerekir. - Stereotaksik mikro-sürücü sahibi önceden belirlenmiş bir yönelim kayıt odasında üzerinde güvenli.
- Steril, künt forseps kullanarak ışığı çekerek Kılavuzu tüp sterilize ışığı geri çek. Işığı ucu 5-10 mm Kılavuzu tüp ucu yukarıda olmalıdır.
Not: Işığı dışa doğru kılavuz tüp ve kelepçe arasında yay olacak. Bu esnek ışığı zarar vermez. - Sahibi için mikro sürücü takmak ve Kılavuzu tüpü hedef kılavuz deliğe yerleştirin.
- Daha düşük mikro-sürücü sahne Kılavuzu tüp sadece beyin zarı düzey arası olana.
Not: İsterseniz, ikinci bir mikro-sürücü bir elektrot ile sahne alanı'nda yerleştirilir ve bir farklı bir kılavuz deliğe indirdi. Yerel alan bu elektrot potansiyel ışığı yerleşim doğrulamak için kullanılan bir mesafe bağımlı hafif yapı gösterecektir. - , Işığı el ile steril Forseps ile alt deneyin.
- Herhangi bir direnç ise, ışığı geri çek 5 - 10 mm, doku yeniden deneyin ve yerleşmek izin vermek için 10 dk bekle.
- İse hala direnç ikinci denemede, ışığı ipucu kılavuz 0,25 mm tüp ve yeniden deneyin Kılavuzu tüpün içine, alt geri çek.
- Işığı slaytlar arasında herhangi bir direniş olmadan Kılavuzu tüp kadar yineleyin.
- Daha düşük ışığı kadar gergin.
Uyarı: Işığı direnci karşı zorla itmeyin. Bu gibi durumlarda Kılavuzu tüp genellikle beyin zarı tam olarak nüfuz değil. Fiber zorla iterek kendisi üzerinde beyin girme ve muhtemelen yok ucu ( şekil 1 g) fiber önleme eğmek için neden olur.
- Kurmak daha büyük optik veya lazer ışığı diğer ucundaki yüksük bağlayın.
- Işık yok insan dışı primat görünür olduğundan emin olun.
- Geçirmeyen koruyucu kullanın veya tam kayıt kuleleri kapsayacak şekilde folyo emici ışık.
- Tüm optik bağlantıları folyo emici lşıktan yapılmış korumalı zarflarda yerleştirin.
- Tüm patch kablolar ile folyo veya siyah Elektrik bandı emici her iki ışık kalkan.
- İlave bir önlem olarak insan dışı primat arkasında deneyinde kullanılan aynı ışık rengi bir yem ışık yayan diyot (LED) banka yerleştirin ve LED'ler sürekli 2.5 Hz de flash. Bu gözleri tamamen karanlığa ayarlama engeller. Yanlışlıkla ışık sızıntısı olsaydı, bu yanıp sönen ışık davranış tetikleyici olarak hizmet den sızıntıyı önlemek için yardımcı olacağını.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük beyin cilt insan dışı primatlar olarak aydınlatma için davranışsal ilgili optogenetic manipülasyon sağlar. Acker vd. (2016) kullanılan bu büyük hacimli ışığı kırmızı kayar Halorhodopsin, bellek güdümlü saccades iki al yanaklı maymun içinde ön göz alana (FEF) zamansal katkısını çalışmaya Jaws 7 ile. Özellikle, FEF nöronlar Jaws içeren bir viral vektör ile enjekte ve büyük hacimli ışığı hedef sununun, gecikme süresi veya motor hazırlama süreci bellek güdümlü saccade görev sırasında kullanarak kırmızı ışık ile aydınlatılmış 8. şekil 3 deney koşulları gösterir. (Örneğin, bellek güdümlü saccades uygun hedef konuma yürütme hataları) hata oranları aydınlatmalı hedefler enjekte alıcı alanında için ancak hedefler karşısında inactivation site için önemli ölçüde arttı / aydınlatma (Şekil 4a).
Optogenetics tarafından indüklenen davranışsal değişikliklerin yanı sıra, büyük hacimli ışığı izin için nöronların inactivation korteks (şekil 4 c) ve ışık teslim üzerinde 4.5 mm (şekil 4b), tam 2.5 mm span üzerinden kanıtladığı gibi Yerel alan optik kaynaklı olası artifakı 8.
Resim 1 . Büyük hacimli ışığı geniş ışık dağıtır
bir) fiber optik/çiftleşme kol/aydınlatıcı arabirimi. b) Etched çekirdek ve kaplama geniş ışık yaymak. c) ışık yayan 5 mm uzunluğundaki kazınmış ipucu. d) ipucu karşılaştırılması şekil geleneksel bir elyaf ve büyük hacimli ışığı için. e) ışığı ve geleneksel optik fiber beyinde 1" kübik hayalet (%1,75 agar) eşit toplam giriş ışık güçlerle. f) 3 mm ucu uzunluğu (solda) ve bir Kongre ile büyük hacimli ışığının orta kesit Monte Carlo modelleri düz i ciddi lif onların ışık yayan yüzeyler üzerinde eşit ışık güç yoğunlukları ile eşit çapı. Acker vd., ek yöntemler 2016 bu modelin ayrıntılı bilgi için bkz. g) arızalı büyük hacimli ışığı kıvrılmış ipucu ile. h) Kılavuzu tüpünden çıkan hasarlı büyük hacimli ışığı ipucu. Bu şekil değiştiren ve kısmen Acker vd, 2016 8yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Büyük hacimli ışığı kalibrasyon
Bu rakam Acker vd., 2016 küçük değişikliklerle yeniden basıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Bellek-güdümlü Saccade görev aydınlatma veya Sham farklı zamanlarda.
Bu rakam Acker vd, 2016 8yeniden basıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Optogenetic inhibisyon büyük hacimli aydınlatma ile davranış ve Elektrofizyolojik etkileri
bir) hata oranları aydınlatma ile önemli ölçüde arttı. b) 2.5 mm kalınlığında korteksin kapsayan nöronların inhibisyonu gösteren Raster araziler. c) 4.5 mm yayılan bir ışık artifakı gösterilen yerel alan potansiyeli. İçin b) ve c), dokunma are aralıklı 0,5 mm ayrı korteks, n derinlik üzerinde 426 denemeler =. Bu rakam uyarlanmış ve Acker vd, 20168yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic araçları hastalığı ve Fizyoloji Rodents incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bir aydınlatıcı büyük beyin birimi teknik sorun optogenetics insan olmayan primatlarda kullanımı sınırlıdır. Maymunlar çalışmalarda öncü küçük birimleri, belki de aydınlatmak için büyük ışık güç yoğunlukları (~ 100 mW/mm2 ile 20 W/mm2) kullanılan < 1 mm3ve korteks4, eksitatör opsins ile bildirilen mütevazı davranışsal etkileri 9,10,11 ve12üstün olacaklar bir inhibitör opsin.
Bu nedenle, bir büyük hacimli ışığı ışık teslim edilmek üzere büyük doku birimleri için geliştirilmiştir. Bu ışığı ve kırmızı kayar halorhodopsin, Jaws, sağlam, optogenetically-sürücü davranışı insan dışı primatlar8' de gözlemlendi.
Burada açıklanan protokol denemenin amacı ve hedef doku bölgesinin geometri bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, fiber kazınmış ucu uzatılmış veya aydınlatılmış için alanının boyutuna bağlı olarak kısaltılmış. İpucu açıklanan daha kalın bir ucu ile çekilmiş olması veya daha büyük bir çap lif daha sağlam bir ışığı oluşturmak için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı bir kabartma fiber uç açıklar iken, fiber uç ve bir daha distal segment için bitişik olmayan aydınlatma, etch için uygun.
Kalite kontrol denetimleri bu protokol önemli bir parçası olur. Büyük hacimli ışığı ucu çatallı olmak veya (şekil 1 g) kıvrılmış, özellikle mekanik bozuksa ya da bu çok ince başlangıçta çekilir. Fiber uygun miktarda güç ile tutarlı bir şekilde çekmek birkaç saatlik uygulamaları çoğu Denemecileri gerekir. Düşük maliyetli (tavsiye plastik fiber optik daha az $ 0,03/metre maliyeti) lifler yapma göz önüne alındığında, birçok Denemecileri sadece lifleri halkalar için mükemmel ipuçları ile yapıştırmayın ve, bu nedenle, lifleri küçük ipucu kusurları için en az % 30 atın. Kalibrasyon sırasında keşfetti düzensiz ışık dağıtım fiber uç yeniden parlatma ve lif yeniden kalibre düzeltilebilir.
Ayrıca, ışığı ucu her deneyden sonra kontrol edilmelidir. Kılavuzu tüp dura nüfuz önce deneyci Kılavuzu tüpünden ışığı zorlarsa, ışığı kendi üzerinde geri Bükülür ve beyin gitmeyeceksiniz. Genellikle, bu gibi durumlarda (şekil 1 h) ışığı ipucu yok edilir. Kenara Direniş'e ışığı ekleme, yerel alan potansiyel bir deney kontrol için uygun ışığı yerleşim olarak hizmet vermektedir. Işığı kadar dura bükülmüş, yerel alan potansiyel deneme sırasında uygun ışığı yerleşim için bir onay görür karakteristik hafif yapı gösterir değil.
Büyük hacimli ışığı aynı anda birden çok kortikal katmanlara teslim ışık için tasarlanmıştır, ancak derin katmanları tutumlu süre en yüzeysel kortikal katmanları aydınlatıcı veya tek bir katman korteksin aydınlatıcı için uygun değil tek tek. Çok dağınık şekilde belirli aydınlatma istenirse ışık daha dar odak geleneksel lifleri veya yüzeysel aydınlatma pencerelerden dura 6 daha uygun olabilir. Ayrıca, büyük hacimli ışığı esnekliğini bir avantaj ve bir sınırlama var. Cam optik lifler, aksine bu ışığı beyin dokusunda paramparça değil, ancak, bu esneklik de ışığı büyük kortikal mesafe üzerinden (örneğin, 10 mm veya daha fazla) ilerlemek zorlaştırır. Bu nedenle, bir çok derin beyin yapısı (örneğin, pulvinar) hedeflemek için bir kılavuz tüp dura geçmiş ve ek mekanik takviye sağlamak için beyin dokusu içine gelişmiş gerekir.
Genel olarak, insan dışı primatlar birimlerinde davranışsal ilgili beyin, optogenetics insan dışı primat çalışmalar için uyum sağlamak için bir anahtar aydınlatma verdiğinden bu yöntemi önceki yöntemleri üzerinde önemli bir avantaj sunuyor. Bu yöntem rhesus maymunları FEF içinde gösterilen iken, birçok diğer beyin bölgeleri ve hatta diğer benzer şekilde büyük beyin türler çalışacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri
Acknowledgments
LCA bir NDSEG Bursu, NSF GRFP ve McGovern Enstitüsü dostları fon kabul eder. EP Harry ve Eunice Nohara UROP Fonu, MIT sınıf 1995 UROP Fonu ve MIT UROP Fonu fon kabul eder. ESB NIH 2R44NS070453-03A1, Hadi Harvey ödül ve New York kök hücre Vakfı-Robertson Ödülü fon kabul eder. RD NIH EY017292 fon kabul eder. Michael Williams takım düzenlemek ve filme önce malzemeleri toplamak için yardımcı oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1,000 °F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
