Summary
Viene mostrato un tipo di terapia fisica del plasma freddo ad alta velocità dei liquidi e delle cellule. Esso implica l'impostazione di composizioni di diversi gas di alimentazione per l'accensione del plasma, misura di spettri di emissione del plasma e la successiva analisi dei liquidi e l'attività cellulare dopo trattamento al plasma.
Abstract
Nella medicina del plasma, gas ionizzati con temperature prossime a quella dei vertebrati sistemi vengono applicate a cellule e tessuti. Plasmi freddi generano specie reattive noto a redox regolano processi biologici nella salute e nella malattia. Prove precliniche e cliniche indicano gli effetti benefici del trattamento al plasma nella guarigione dell'ulcera cronica della pelle. Altri argomenti emergenti, come trattamento del cancro del plasma, sono ricevendo crescente attenzione. Ricerca medica al plasma richiede competenze interdisciplinari in fisica, la chimica e la biomedicina. Uno degli obiettivi di ricerca del plasma è di caratterizzare le cellule del plasma-trattate in una varietà di applicazioni specifiche. Questo include, per esempio, conteggio delle cellule e vitalità, ossidazione cellulare, attività mitocondriale, citotossicità e modalità della morte delle cellule, analisi del ciclo cellulare, cellula dell'espressione dei marker di superficie e rilascio di citochine. Questo studio descrive l'equipaggiamento essenziale e i flussi di lavoro richiesti per tale ricerca in biomedicina del plasma. Viene descritto il funzionamento di un getto di plasma dell'argon di pressione atmosferica, specificamente monitoraggio sua base spettri di emissione e le impostazioni di gas per modulare la produzione di specie reattive del feed. Utilizzando un alta precisione xyz-tabella e software per computer, il getto è aleggiato in precisione millisecondo la cavità delle piastre da 96 pozzetti in precisione micrometrica per la massima riproducibilità. Le analisi a valle per l'analisi di liquido di molecole redox-attivo vengono visualizzate, e cellule bersaglio sono trattate al plasma. In particolare, le cellule del melanoma sono analizzate in una sequenza efficiente di diversi saggi consecutivi ma utilizzando le stesse cellule: misura dell'attività metabolica, zona totale delle cellule e l'espressione di superficie dell'indicatore di calreticulina, una molecola importante per la immunogeno apoptosi delle cellule tumorali. Queste analisi recupero ricchi di contenuti informazioni biologiche circa gli effetti del plasma da una singola piastra. Complessivamente, questo studio descrive i passi essenziali e i protocolli per la ricerca medica del plasma.
Introduction
Specie reattive sono regolatori redox importante nella malattia, tra cui anormale cicatrizzazione1 e cancro. 2 cosa importante, queste specie sono coinvolti nella patologia così come la sua risoluzione terapeutica. 3 , 4 plasma freddo di fisico è un gas ionizzato che espelle le specie reattive di molti generi. 5 dopo l'avvento dei cosiddetti plasmi freddi che operano a corpo temperatura6, plasmi freddi possono essere applicati alle cellule ed ai tessuti senza danno termico. Dimostrando l'efficacia e l'applicazione sicura di dispositivi del plasma nelle osservazioni pre-cliniche e cliniche, tre hanno ricevuto il riconoscimento come dispositivi medici in Germania. 7 soprattutto per quanto riguarda sicurezza genotossico, diversi studi hanno dimostrato l'assenza di eventi mutageni utilizzando il primo dispositivo, un getto di plasma dell'argon di pressione atmosferica. 8 , 9 , 10 altri due dispositivi sono gli scarichi di cosiddetto barriera dielettrica (DBD), che operano tramite un principio diverso rispetto a getto di plasma. In particolare, getti consentono bisturi-come trattamento delle superfici e cavità considerando che plasmi DBD sono efficaci nel trattamento di aree di tessuto più grande ma piuttosto piatta. Sfruttando redox cellulare segnalazione11, lo scopo della tecnica è di utilizzare plasma generato specie reattive per applicazioni biomediche. 12 un'applicazione particolarmente promettente della terapia clinica del plasma è il supporto di guarigione della ferita. 13 , 14 , 15 inoltre, al plasma è stato indicato per avere effetti anticancro nei modelli animali. 16 , 17 , 18
Prima di convalidare l'efficacia e la sicurezza delle applicazioni del plasma in modelli animali, o anche gli esseri umani, standardizzato in vitro ricerca deve essere effettuato con i dispositivi del plasma. Questi esperimenti sono essenziali per esplorare le applicazioni del plasma e delineare i meccanismi all'opera. Inoltre, ricerca di base è necessaria per comprendere l'impatto della composizione delle specie reattive e successivi effetti biologici. Questo studio dimostra come al plasma può essere integrato in ricerca biomedica per capire meglio e controllarne gli effetti sulle cellule. Esso descrive la messa a punto della composizione del gas dell'alimentazione, monitoraggio della produzione di specie reattive, applicazioni di plasma liquidi, cellule, tessuti e il risultante dei risultati chimici e biologici. Inoltre, vengono forniti esempi che istruire sulla standardizzazione di trattamento al plasma e saggi biologici a valle, con un'enfasi sulla ricerca medica al plasma fatto in piastre da 96 pozzetti. Questo approccio presenta vantaggi distinti: io) minimizzazione del numero di cellule necessarie per condizione, costi di reagente e hands-on tempo per campione; II) l'assegno di una maggiore accuratezza dei risultati come duplicare o trattamenti in triplice copia può essere impostato con facilità; e iii) agevolazione dell'analizzante a valle senza giunte nel lettore di piastra 96 pozzetti formato, imaging ed esperimenti di citometria a flusso.
Protocol
1. plasma specie monitoraggio e trattamento Setup
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Specie di plasma monitoraggio
- Utilizzare un getto di plasma di pressione atmosferica e il flusso del gas di alimentazione di un massimo di due standard litri al minuto.
- Perpendicolare all'asse del pennacchio, posizionare il getto davanti uno spettrofotometro ad emissione ottica e fotoemissione record e lunghezza d'onda (200-1.000 nm) utilizzando un software dedicato.
- Mescolare 0,5% di azoto o ossigeno al gas di alimentazione (5%) o secco o umidificato.
- Ripetere la spettroscopia ad emissione ottica per ogni condizione di gas.
- Analizzare con il software appropriato per la visualizzazione grafica dei dati.
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Installazione di trattamento al plasma
- Difficoltà il getto a una tabella di xyz-driven computer.
- Identificare la posizione dei pozzetti e generare uno script di computer per spostare il getto si unì alla tabella, con i tempi di trattamento adatto, sopra il centro di ciascun pozzetto.
- Aggiungere 104 di qualsiasi tipo di cellule di mammifero aderente in 100 µ l di terreno di coltura cellulare completo (RPMI1640 con 10% FCS, glutamina 2% e 1% di penicillina/streptomicina) in parecchi pozzi sotto cappa a flusso laminare.
- Consentire l'adesione cellulare si verifica durante la notte a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica.
- Trattare le cellule con il plasma per 20 s a diverse altezze (asse z) a 250 µm intervalli.
- Aggiungere 25 µ l di ioduro di propidio in mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzetto.
- Immagine le cellule al microscopio per determinare l'altezza di specifico che non induce necrosi delle cellule dovuto il feed gas spingendo il terreno di coltura in cima le cellule da parte.
Nota: Per tempi più lunghi di trattamento, identificare evaporazione del liquido a questa altezza particolare, nel plasma e disattivare modalità, dal piatto di pesata prima e dopo il trattamento al plasma per identificare la quantità di microlitri di acqua doubledistilled necessaria per ristabilire omeostasi osmotica nei pozzetti trattati. - Preparare un protocollo finale per la xyz-tabella con tempi rispettivi di trattamento (qui: 20 s, 40 s, 60 s plasma e controllo di gas 60 s) e bene posizioni, e hanno pronte pipette multicanale e serbatoi per liquidi movimentazione di piastre da 96 pozzetti nelle analisi successive.
2. analisi delle componenti principali reattivi liquidi trattati con Plasma
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Analisi dei trattati del Plasma di perossido di idrogeno
- Trattare 100 µ l di tampone fosfato salino (PBS) con plasma in triplice copia in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto.
- Preparare un mix master caricando 100 µ l di PBS con 10 U di perossidasi di rafano e 5 µM di reagente di rivelazione di perossido di idrogeno (sufficiente per uno bene; scalare di conseguenza).
- Aggiungere 95 µ l di master mix in ciascun pozzetto.
Nota: Il passaggio precedente dovrebbe essere eseguito sotto un banco pulito o in una stanza separata da quella della sorgente al plasma come ozono dell'aria ambiente può diminuire la sensibilità del dosaggio. - In un piatto a parte, preparare una serie di diluizioni di perossido di idrogeno in PBS con una concentrazione superiore di 100 µM a 100 µ l PBS.
- Aggiungere 5 µ l di campioni o perossido di idrogeno standard per pozzetti contenenti il reagente di rivelazione.
- Sono pozzetti contenenti il reagente di rivelazione solo per sottrazione di sfondo dopo la lettura.
- Incubare la piastra al buio per 15 min a temperatura ambiente.
- Posizionare la piastra nel lettore di micropiastre misurare fluorescenza a λex 535 nm e λem 590 nm.
Nota: Se i campioni sono attesi per alte concentrazioni di perossido, la diluizione del campione deve essere aumentato o letture devono essere eseguite con tempi di incubazione più brevi per evitare la saturazione del dosaggio. - Sottrarre i valori vuoti da tutti i campioni, calcolare la curva standard perossido e quantificare le concentrazioni di perossido di campione sconosciuto da quella curva della linea di base.
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Analisi di nitrito del Plasma-trattati
- Trattare 100 µ l di PBS con plasma in triplice copia in presterilizzate 96well piastre.
- Preparare un mix master di soluzione di nitrito rilevamento aggiungendo 1 µ l di reagente di quantificazione a 99 µ l di doubledistilled acqua (sufficiente per uno bene; scalare di conseguenza).
- Aggiungere 100 µ l per pozzetto su una lastra di chiaro, presterilizzate 96well. La scalabilità necessaria affinché il numero di pozzetti.
- Preparare una serie di diluizioni di standard di nitrito in acqua doubledistilled.
- Aggiungere 10 µ l di standard o di campioni per il mix master in piastre 96well.
- Incubare la piastra al buio per 10 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5 µ l di soluzione di nitrito quantificazione developer in ciascun pozzetto.
- Leggere in un lettore di micropiastre a λex 365 nm e λem 450 nm di fluorescenza.
- Sottrarre i valori vuoti da tutti i campioni, calcolare la curva standard di nitrito e quantificare le concentrazioni di nitriti campione sconosciuto da quella curva della linea di base.
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Analisi di Plasma-trattati superossido
- Fare un mix master del citocromo ossidato (1 mg/mL) e la catalasi (20 µ g/mL) in PBS.
- Aggiungere 100 µ l di master mix dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti chiara, fondo piatto.
- Trattare il mix master con il plasma in triplice copia a condizione di trattamento.
- Leggere l'assorbanza a 550 nm utilizzando un lettore di micropiastre; i dati del grafico.
- Calcolare la quantità di superossido generato utilizzando il coefficiente di estinzione molare del citocromo C e la lunghezza del percorso della luce di liquido all'interno di un pozzo.
3. la risposta biologica delle cellule esposte a Plasma
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Lettura multidimensionale delle cellule trattate al Plasma: attività metabolica
- Utilizzare una cappa a flusso laminare per tutte le procedure seguenti.
- Cellule di4 seme 10 (melanoma B16 murina) in 100 µ l completamente integrato terreno di coltura delle cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto.
- Consentire l'adesione cellulare durante la notte a 37 ° C in atmosfera umidificata dell'incubatrice con 5% di anidride carbonica.
- Utilizzando la tabella di xyz, trattare i pozzetti con plasma o gas solo secondo uno schema predefinito e aggiungere le cellule nuovamente dentro l'incubatrice per 20 h.
Nota: Se si desidera togliere surnatanti dopo 20 h per analizzare prodotti extracellulari; Aggiungere 100 µ l di terreno nuovo in seguito. - In ciascun pozzetto, aggiungere 25 µ l di terreno di coltura cellulare contenente 500 µM resazurin (concentrazione finale 100 µM); preparare tre pozzetti contenenti resazurin solo nel mezzo di coltura cellulare senza cellule per sottrazione di sfondo.
- Incubare per 3 h nell'incubatrice.
- Leggere fluorescenza a λex 535 nm e λem 590 nm in un lettore di micropiastre.
- Sottrarre la fluorescenza di fondo da tutti i campioni e normalizzare i dati ai valori di controllo.
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Lettura multidimensionale delle cellule trattate al Plasma: analisi dell'immagine
- Utilizzare la piastra ben da 3.1.7 ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura fresco cella contenente 1 µ g/mL di ioduro di propidio.
- Mettere la piastra sotto un microscopio con un tavolino motorizzato a ciascun pozzetto di immagine.
Nota: Imaging dettagli dipendono la questione sperimentale; qui, un obiettivo X 20 è stato utilizzato in un dispositivo di imaging ad alto contenuto di leggere 3 x 3 campi di vista in ogni pozzetto in un campo luminoso canale, canale di contrasto di fase digitale e fluorescenza (ioduro di propidio) canale, che utilizza luce adeguata eccitazione ed emissione filtri. - Utilizzare software di analisi immagine quantitativa per determinare l'area totale citosolico in immagini di contrasto di fase digitale di tutti i campi di vista imaged in ciascun pozzetto.
Nota: Analizzare ulteriori parametri se lo si desidera, ad esempio, il numero di cellule vitali e/o morte o attività mitocondriale usando le macchie dedicate. Se utilizza altre macchie rispetto a quelli descritti in questo lavoro, assicurarsi che le macchie di fluorescenza utilizzate per la microscopia non si sovrappongono spettralmente con fluorocromi utilizzati negli esperimenti di citometria a flusso successivo. - I dati del grafico e se lo si desidera, test per la correlazione con i valori ottenuti per attività metabolica.
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Lettura multidimensionale delle cellule trattate al Plasma: citometria a flusso
- Per questa analisi, utilizzare la piastra ben dal punto 3.2.5.
- Scartare il surnatante e lavare due volte con 200 µ l di PBS contenente calcio e magnesio (0,9 mM e 0.5 mM, rispettivamente).
Nota: Difficoltà e/o permeabilize le cellule in questa fase per ulteriore biologiche letture non coperti in questo contributo, come la colorazione di analisi intracellulare dell'antigene o ciclo cellulare. - In ciascun pozzetto, aggiungere 50 µ l di PBS con calcio e magnesio che contiene gli anticorpi monoclonali anti-topo calreticulina 50 ng/mL.
- Incubare per 15 minuti nell'incubatore.
- Lavare due volte con 200 µ l di completamente integrato medium della coltura cellulare ed eliminare il liquido in lastra.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di distacco delle cellule in ogni pozzetto e incubare per 20 minuti nell'incubatore.
- Usare un altro insieme delle cellule B16 non macchiate in sospensione per configurare il protocollo di acquisizione cytometric di flusso, gating strategia e guadagni e tensioni di fotorivelatori.
- Caricare la piastra in un citometro a flusso dotato di un campionatore automatico per piastre da 96 pozzetti.
- Acquisire un minimo di 1.000 cellule in avanti e la popolazione di dispersione laterale solitamente associata con cellule vitali.
- Utilizzare software dedicato per l'analisi di citometria a flusso, i file. FCS a cancello la popolazione di interesse e determinare l'intensità media di fluorescenza di calreticulina.
- Dati del grafico e se lo si desidera, test per la correlazione con i valori ottenuti per deposizione metabolico attività, formazione immagine e/o ossidante.
Representative Results
In questo studio, un flusso di lavoro ottimizzato è stato descritto per la ricerca medica sugli effetti del plasma. L'approccio multidisciplinare utilizzato qui analizza il profilo di base emissione ottica del getto di plasma, i principali componenti reattivi nel liquido, e le risposte biologiche delle cellule trattati con il plasma (Figura 1).
Per condurre questo flusso di lavoro, un numero di componenti erano necessarie per impostare correttamente l'origine del plasma (Figura 2). I vari gas (qui principalmente argon, ossigeno e azoto) sono stati forniti a e controllata da diversi mass flow controller. Un pannello centrale è stato usato per regolare digitalmente il mass flow controller ai flussi di gas di alimentazione predeterminato. Per produrre composizioni di gas di alimentazione specifica, i gas sono stati fisicamente misto utilizzando un pannello di valvole che combinati gas da diversi mass flow controller (Figura 2A). La sorgente del plasma era accesa, e l'emissario del plasma è stato istituito davanti un USB-spettrofotometro (Figura 2B) con una gamma di 200 ottica nm a 1.000 nm. Per il trattamento di liquidi e di cellule, un efficiente flusso di lavoro è stata descritta utilizzando piastre da 96 pozzetti. Multi-pozzetto piatti erano tenuti in posizione utilizzando una struttura di plastica che è stata fissata sulla piastra di base con inserimenti abbinati ai suoi fori impressi (Figura 2C). L'intera impostazione è stato disposto sotto una cappa a flusso laminare (Figura 2D). Il programma di installazione incluso una xyz-tabella a cui è stato montato il pezzo tenuto in mano del getto plasma. Gli elementi di controllo del motore possono trovarsi di fuori la panca, se quest'ultimo dispone di porte cavi sufficientemente grande da e per la tabella di xyz. D'importanza, il tavolo era controllato dal computer e può essere programmato per sorvolare il getto al centro di ciascun pozzetto con precisione micrometrica per la quantità di tempo desiderata. Inoltre, la posizione iniziale (come nel nostro setup, pozzetto A1) è stato scelto liberamente (Figura 2E). Insieme al titolare del piatto di plastica, questo ha permesso per un trattamento al plasma riproducibile con le eventuali variazioni quotidiane legate esclusivamente all'installazione degli esperimenti liquidi e biologici.
Spettroscopia ad emissione ottica (OES) è stata usata per seguire i picchi distinti collegati a componenti reattivi del plasma in condizioni differenti gas di alimentazione (Figura 3A). Ad esempio, il secondo sistema positivo di azoto con picchi da 330 nm a 380 nm rappresentate specie reattive dell'azoto e il picco a 309 nm rappresentato i radicali ossidrili (freccia in Figura 3A). Rispetto al gas argon da solo, la presenza di azoto specie aumentato con una miscela di azoto nel gas di alimentazione, mentre l'aggiunta di ossigeno o umidità diminuito o ridotto, rispettivamente. Al contrario, la presenza di radicali ossidrili era diminuita con ossigeno o azoto ma contrassegnato aumentata se umidificata argon è stato usato come gas di alimentazione. Per il trattamento al plasma dei liquidi, è stata determinata l'evaporazione causata dal gas argon e del plasma dell'argon primo (Figura 3B). Cosa importante, entrambe le condizioni non hanno dato risultati simili perché plasma esercita anche effetti sulla temperatura. In linea con i risultati OES di radicali ossidrili, perossido di idrogeno deposizione significativamente diminuito con la mescolanza di ossigeno o di azoto ma aumentato con umidificata gas di alimentazione (Figura 3C). Inoltre, l'aggiunta di azoto per il gas di alimentazione condotto a concentrazioni di nitriti significativamente più alte rispetto ai liquidi trattati del plasma dell'argon (Figura 3D). Questo flusso di lavoro potrebbe essere impiegato anche per studiare l'impatto del plasma su liquidi con differenti composizioni. Ad esempio, le concentrazioni di perossido di idrogeno sembravano essere indipendente dalla presenza di siero fetale di vitello in PBS e RPMI1640 terreno di coltura delle cellule (Figura 3E). Negli stessi campioni, la presenza di siero ha fatto diminuire le concentrazioni di nitriti in terreno di coltura delle cellule e PBS rispetto alle loro controparti contenente non-siero (Figura 3F). La maggior parte superossido è stato prodotto nelle condizioni di gas argon asciutto con mescolanze di ossigeno e/o azoto significativamente tempra generazione del superossido, fatta eccezione per il plasma di argon-ossigeno umidificato (Figura 3G).
Per il trattamento del plasma delle cellule in piatti multi pozzetto, la piastra che contiene cellule seminate il giorno prima è stato rimosso dall'incubatrice e aggiunto per il supporto di plastica. È stato applicato un modello di trattamento programmato, evaporazione è stato compensato e la piastra è stata posta nuovamente dentro l'incubatrice per 20 h. nota che dopo questa incubazione, surnatanti di cella potrebbero sono stati raccolti in una piastra a 96 pozzetti nuova e vuota e conservati a- 80 ° C per la valutazione delle proteine di interesse. Successivamente, resazurin è stato aggiunto alle cellule di ciascun pozzetto. Fatturato di resazurin non fluorescente a fluorescente Resorufina solo è stata facilitata dagli enzimi attivi di generazione di NADPH ed è stata correlata con attività metabolica generale (Figura 4A). Intensità di fluorescenza erano simili alla percezione visiva della piastra e indicato effetti citotossici del trattamento prolungato del plasma (Figura 4B). Umidificata gas condizioni erano più dannose di quelle condizioni di gas secco. Le stesse cellule della piastra sono state utilizzate per ulteriori saggi a valle. Cellule della piastra erano microscopicamente studiato (Figura 4C). Utilizzando il software di imaging, diversi pozzetti della piastra sono stati esaminati per confronto qualitativo (Figura 4D). Software ha permesso la quantificazione della superficie totale coperta da celle all'interno di campi di vista acquisite in ciascun pozzetto e i dati risultanti sono stati normalizzati ai rispettivi controlli (Figura 4E). Una diminuzione dell'area totale delle cellule è stato visto negli esempi di trattamento al plasma, soprattutto con le condizioni del gas di alimentazione umidificata. Dopo formazione immagine, le cellule sono state lavate, macchiate con gli anticorpi anti-topo calreticulina, staccate e analizzate con citometria a flusso (Figura 4F). Significa fluorescenza intensità di calreticulina macchiatura in cellule vitali (Figura 4G) sono state calcolate e confrontate tra i campioni (Figura 4H). Trattamento al plasma indotto un upregulation di calreticulina sulla superficie delle cellule di melanoma murino, che ha corrisposto per la durata del trattamento al plasma applicata con condizioni di asciutto gas di alimentazione. Per umidificare condizioni di alimentazione gas, 20 s e 40 s di trattamento ha indotto una forte esposizione calreticulina rispetto ai più letale 60 tempo di trattamento di s. Questo suggerisce che c'era un regolamento non-lineare di calreticulina esposizione per quanto riguarda la quantità di ossidanti presentare alle cellule.
Figura 1 : Flusso di lavoro di ricerca medica del plasma dalla fisica alla biologia. L'output di specie reattive del getto di plasma di argon pressione atmosferica è sintonizzato modulando il gas di alimentazione. Molecole selezionate in fase gas plasma vengono monitorati usando la spettroscopia. Il plasma è usato per trattare liquidi e indagare la deposizione dell'ossidante. Cellule coltivate in piastre microtiter sono trattate al plasma e biologiche letture vengono eseguite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Installazione del banco al plasma ricerca. (A) diversi gas in acciaio inox tubi vengono avvitate in diversi controllori di flusso di massa che sono controllati tramite un pannello centrale. La composizione del gas di alimentazione individuale è mescolata da allora in poi usando un pannello di valvole. (B) alcuni componenti reattivi del plasma possono essere monitorati mediante spettroscopia ad emissione ottica per studiare le differenze tra varie composizioni di gas dell'alimentazione. (C) per la ricerca del plasma ad alta velocità, vengono utilizzati 96 pozzetti. Per garantire un costante punto di partenza per il trattamento al plasma automatico e programmabile, la piastra viene aggiunto a un fotogramma garantendo la stessa posizione assoluta delle piastre di giorno in giorno. (D) il getto di plasma è fissato una xyz-tabella controllati dal computer che si trova sotto una cappa a flusso laminare. Tutte le 96 località esatta e il tempo di permanenza del plasma sopra ogni bene è scritto in un file di programma per guidare il movimento della sorgente al plasma. L'alloggiamento principale dell'apparato getto plasma così come i comandi del motore si trovano nelle immediate vicinanze. (E) automatizzato di trattamento al plasma di una piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Getto di plasma e liquido analisi. (A) spettroscopia ad emissione ottica delle condizioni differenti gas di alimentazione viene mostrata. Il secondo sistema positivo di azoto (330 nm a 380 nm) è stata aumentata con la mescolanza di azoto, assente nel caso di mescolanza di ossigeno e contrassegnato ha ridotto con argon umidificata (lefthand pannelli). Il picco di radicali ossidrili a 309 nm (freccia) è diminuito in condizioni di azoto e ossigeno, ma contrassegnato aumentato con argon umidificata rispetto al gas argon da solo. Gas (B) l'esposizione dei liquidi porta a evaporazione. La quantità di evaporazione per pozzetto in un piatto 96well sul trattamento con gas argon e al plasma da solo è stata determinata il piatto di pesata prima e dopo il trattamento usando una scala fine. Evaporazione in campioni di plasmatreated era più alto rispetto a quello nei campioni di gastreated di argon. (C) generazione di perossido di idrogeno nei liquidi plasmatreated correlato in una certa misura con la 309 nm picco di radicali ossidrili in (A). Umidificata (5%) argon plasma aumentato le concentrazioni di perossido circa 4fold. Nitrito (D) è stato elevato quando azoto è stato aggiunto il gas di alimentazione, e questo effetto è stato aumentato con plasma di argon umidificata. L'aggiunta di ossigeno è diminuito generazione nitrito ma non significativamente. (E, F) Le concentrazioni di nitriti e perossido di idrogeno è mostrato in diversi tipi di liquidi, vale a dire RPMI1640 mezzo di coltura cellulare con (R10F) e senza (R0F) così come PBS con e senza siero fetale di vitello (FCS). I livelli del perossido non hanno differito fra diversi media (E) considerando che i livelli di nitrito sono stati diminuiti significativamente in presenza di siero. (G) produzione del superossido è stata più alta per gas argon asciutto di alimentazione dei gas; mescolanza di azoto, ossigeno o argon umidificata ha dato inferiore deposizione di superossido nel liquido. I dati indicati (B-G) sono la media + SEM di due o tre esperimenti. L'analisi statistica è stata eseguita (C, D) utilizzando analisi unidirezionale della varianza confrontando mezzi di tutto il gruppo di condizioni asciutte o umide gas di alimentazione contro il rispettivo controllo (* * p < 0.01; * * * p < 0,001). Inoltre, le condizioni di gas solo al plasma di argon sono state confrontate usando media di tutto il gruppo e il t-test (# # # p < 0,001). Ulteriori analisi statistiche (F) è stata eseguita utilizzando il t-test confrontando i valori di ogni trattamento al plasma e medie condizioni nei campioni con FCS e senza FCS (* p < 0.05; * * p < 0.01); Inoltre, FCS o soluzioni contenenti non-FCS sono stati confrontati all'interno di ogni tempo di trattamento al plasma utilizzando il t-test (# p < 0.05; # # p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Trattamento al plasma e il suo impatto sulle cellule. (A) cellule sono state esposte al plasma e resazurin è stato aggiunto dopo 20 h per valutare l'attività metabolica. Attività (B) è stata diminuita significativamente nei campioni di plasmatreated rispetto ai controlli di gas. Una profonda diminuzione è stata veduta con umidificazione dei gas dell'alimentazione mentre aggiunta di ossigeno e/o azoto conduce alla tossicità in condizioni sia di gas argon secche ed umide. (C) Medium contenente ioduro di propidio (PI) è stato aggiunto. (D) una panoramica è mostrato dei pozzetti della piastra con contrasto di fase digitale (arancia) che rappresenta la frazione citosolica di ogni cella e PI (verde) per identificare le cellule morte. Strumenti di imaging ha permesso la quantificazione della superficie totale entro il campo di vista di ciascuno ben coperto con le cellule. (F) cellule erano successivamente lavate ed incubate con anticorpi o altri indicatori delle cellule per caratterizzare gli effetti biologici del plasma mediante citometria a flusso. (G) sono state impiegate Gating strategie e analisi dell'indicatore è stato effettuato e rispetto tra i campioni. I dati indicati (B, E, H) indicano la media + SEM di un rappresentante di tre esperimenti indipendenti. Barra della scala = 200 µm (D). Confronto statistico è stato effettuato usando bidirezionale analisi degli scostamenti (B, H) confrontando, per ogni condizione di gas, ogni trattamento al plasma al relativo controllo rispettivi gas (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0,001). Inoltre, i valori per ogni condizione di mescolanze di azoto e/o ossigeno sono stati confrontati con i valori del plasma di gas argon per a secco e umido condizioni separatamente (bidirezionale analisi degli scostamenti; # # # p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Ricerca di base è fondamentale per lo sviluppo di una comprensione dei meccanismi alla base della medicina del plasma nella ricerca preclinica e clinica e l'efficacia di. Ricerca fondamentale, inoltre, promuove la ricerca di nuove applicazioni per i trattamenti. Mentre è assodato che plasmi mediano i loro effetti biologici mediante generazione di reattive dell'ossigeno ed azoto specie19, ci sono ancora tre sfide principali per il campo. In primo luogo, quali specie sono importanti? Questo può essere parzialmente risposto modulando la composizione del gas di alimentazione dei plasmi con diagnostica ottica e biologiche letture. 20 in secondo luogo, gli effetti che può essere visto in bersagli biologici quali le cellule? Questo è, almeno in parte, affrontato mediante esperimenti della coltura cellulare ed un numero di saggi. Nelle cellule eucariotiche, effetti sono pleiotropici compreso ciclo cellulare arresto21, apoptosi22, necrosi23e pelle cella stimolazione24,25,26, nonché un supporto o diminuiscono della cella motilità o attività metabolica27,28,29. La terza sfida, relative a questi effetti pleiotropici, è quello di identificare molecole chiave che determinano la risposta cellulare agli ossidanti derivati dal plasma per spiegare i diversi effetti spesso visti in diversi tipi cellulari. Questo può essere fatto da omics tecniche30,31,32 e/o a o downregulation dei geni bersaglio utilizzando siRNA (redox) segnalazione inibitori, gli antiossidanti e gli enzimi antiossidanti, come pure modulazione della produzione di specie reattive del plasma. 33 , 34 , 35 quindi, protocolli di analisi semplificata sono necessari per testare più grande campione set con un gran numero di iterazioni.
Questo studio esemplifica un efficiente flusso di lavoro sperimentale, dalla fisica alla biologia, ricerca medica al plasma per quanto riguarda le sfide di cui sopra. Dettagli sugli aspetti ingegneria della sorgente al plasma e generazione del plasma sono state descritte prima. 36 , 37 , 38 tutte queste analisi sono eseguite in piastre di 96well, che ha un certo numero di vantaggi. Per esempio, campioni come surnatanti della cultura delle cellule possono essere facilmente trasportati da saggio a piastre di raccolta ad indagare, ad esempio, le concentrazioni di proteina tramite collegati-analisi dell'immunosorbente enzima. Se attrezzature scientifiche in grado di leggere direttamente da 96 pozzetti sono disponibile, tale approccio riduce al minimo il costo di ogni campione e handsontime e massimizza i risultati di analisi differenti dallo stesso campione di multiplexing. L'utilizzo di multicanale pipette inoltre accelera il trattamento dei campioni. In linea di principio, il dosaggio descritto qui può anche essere eseguito su utilizzando la piastra ben formati con diametri ben più grandi, anche se questo richiede ulteriori passaggi di pipettaggio in altri tubi e vasi per saggi a valle. Tipi di piastre più piccoli quali le piastre 384well, tuttavia, non presentano la geometria adatta alla ricerca biomedica al plasma utilizzando getti con flussi di gas di alimentazione grande. In particolare, non può essere garantito che solo singoli ma non adiacente pozzi sono interessati durante il trattamento.
Analisi dei liquidi è essenziale per studiare la deposizione di specie dal plasma. Nelle analisi di esperti, un'installazione parallela di analisi differenti possa caratterizzare plasmatreated liquidi per quanto riguarda gli ossidanti diversi allo stesso tempo. Questo funzionamento in multiplex permette lo sviluppo di un quadro differenziato delle specie plasmaderived. L'approccio descritto è altamente sensibile per indagare le concentrazioni di perossido di idrogeno39, che è spesso necessario ma non è sempre sufficiente a spiegare gli effetti del plasma. 40 , 41 , 42 effetti biologicamente rilevanti possono essere valutati anche in liquidi con un saggio di glutatione non incluso in questa sezione. 43 il dosaggio specifico nitrito è fortemente raccomandato sopra Griess-saggi convenzionali a causa di 10fold più alta sensibilità (dati non mostrati). Plasmatreated liquidi possono essere studiate anche per la formazione di acido ipocloroso mediante il DTNB-saggio. Ancora, i risultati precedenti non hanno indicato la formazione di quella specie con la nostra fonte di plasma. 19 , 39 , 44 al termine del trattamento al plasma, deterioramento specie si svolge nel corso del tempo. Nitrito reagisce al nitrato; Inoltre, il perossido è consumato nel corso del tempo. Tuttavia, questi processi richiedere diverse ore. 35 la citocromo c assorbimento è stabile sopra parecchie ore pure. Pertanto, se i processi si verificano entro i primi 30 min dopo il trattamento, variazione delle concentrazioni delle specie longeva descritta qui sono trascurabili. Tuttavia, si deve prestare attenzione quando ad investigare certi tipi di mezzi (ad es., per volta Eagle Medium di Dulbecco) ingredienti possono pulire fino al 90% perossido entro 1 h (dati non mostrati) che conduce ad una sottovalutazione del perossido deposizione al plasma in liquidi.
Un'analisi multiplex è presentata che spazia da indagare attività metabolica sulla superficie cellulare (morfologia) di espressione di superficie dell'indicatore delle cellule. Una combinazione di questi test può rivelare interessanti risultati. Ad esempio, precedentemente abbiamo indicato in THP1 monociti che conteggi delle cellule e di attività metabolici non diminuiscono in modo lineare dopo l'esposizione al plasma. 45 piuttosto, con l'aumento del tempo di trattamento al plasma, le cellule sono state osservate che sono state aumentate di dimensioni e aveva una massa mitocondriale superiore, portando così a tasso metabolico più elevato su base percell. Essenzialmente, la combinazione di lettore multidisco, microscopia e citometria multiplex informazioni su risposte cellulari dopo il trattamento al plasma. In cellule del melanoma, qui ci concentriamo su effetti citotossici e loro immunogenicità mediata da calreticulina. 46 in linea di principio, molte altre domande possono essere affrontate con questo approccio che colleghi le attività metabolica con risultati di citometria a flusso e imaging. Ad esempio, differenziazione cellulare (ad es. polarizzazione dei macrofagi), potenziale di membrana mitocondriale, analisi del ciclo cellulare, della motilità cellulare, biomeccanica o formazione di micronuclei per analisi di genotossicità possa anche essere studiati in cellule trattate al plasma. Citometria a flusso multicolor consente ancora di più applicazioni in diverse popolazioni cellulari allo stesso tempo. Questo include, ad esempio, l'analisi dello stato di fosforilazione di proteine come fattori di trascrizione, quantificazione di mRNA, misurazione delle citochine intracellulari, e/o valutazione dei tioli totali ridotti a livello di singola cellula di segnalazione. Ulteriori informazioni biologicamente rilevanti disponibili per ciascun campione aiuta a sviluppare ulteriormente l'immagine di effetti di redox del plasma per comprendere meglio le applicazioni attuali e future del plasma.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Finanziamenti dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF concedere 03Z22DN12 e numeri 03Z22DN11) si ringraziano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| accutase | BioLegend | 423201 | |
| amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
| argon gas | Air Liquide | N50 | |
| B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
| catalase | Sigma | C30 | |
| cell culture incubator | Binder | CB210 | |
| cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
| cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
| data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
| fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
| fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
| flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
| flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
| Glutamine | Sigma | G7513 | |
| imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
| laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
| mass flow controller | MKS | G-series | |
| Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
| microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
| optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
| penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
| pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
| plate reader | Tecan | M200pro | |
| propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
| resazurin | VWR | B21187.06 | |
| RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
| xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |
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