Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

البحوث الأساسية في الطب البلازما-نهج إنتاجية من السوائل للخلايا

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

ويرد بروتوكول علاج بلازما مادية باردة الفائق للسوائل والخلايا. أنها تنطوي على إقامة التراكيب الغاز تغذية مختلفة للاشتعال البلازما، قياس أطياف الانبعاث البلازما، والتحليل اللاحق للسوائل والنشاط الخلوي بعد المعالجة بالبلازما.

Abstract

الطب البلازما، وتطبق الغازات المتأينة مع درجات الحرارة قريب من نظم الفقاريات إلى الخلايا والأنسجة. البلازما الباردة تولد رد الفعل الأنواع المعروفة للأكسدة تنظيم العمليات البيولوجية في الصحة والمرض. ما قبل السريرية والسريرية الأدلة يشير إلى الآثار المفيدة للمعالجة بالبلازما في الشفاء من القرحة المزمنة للجلد. المواضيع الناشئة الأخرى، مثل البلازما لعلاج السرطان، تحظى باهتمام متزايد. البحوث الطبية البلازما يتطلب خبرات متعددة التخصصات في الفيزياء والكيمياء والطب الحيوي. هدف واحد لأبحاث البلازما لتمييز الخلايا المعالجة بالبلازما في مجموعة متنوعة من تطبيقات محددة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، عدد الخلايا والجدوى والأكسدة الخلوية، نشاط المتقدرية، سيتوتوكسيسيتي وطريقة موت الخلية، تحليل دورة الخلية، والخلية التعبير علامة السطحية، والإفراج عن سيتوكين. تصف هذه الدراسة بالمعدات الأساسية ومهام سير العمل المطلوبة لمثل هذه البحوث في الطب الأحيائي في البلازما. فهو يصف التشغيل السليم لطائرة بلازما الأرغون الضغط الجوي، على وجه الخصوص رصد لها أطياف الانبعاثات الأساسية وتغذية الغاز الإعدادات تعدل الإخراج الأنواع المتفاعلة. استخدام عالية الدقة xyz-جدول وبرامج الحاسوب، jet هو حلقت في الدقة ميلي ثانية واحدة تجاويف ألواح 96-جيدا في الدقة ميكرومتر لأقصى إمكانية تكرار نتائج. تظهر فحوصات المتلقين للمعلومات لتحليل السائل من جزيئات الأكسدة النشطة، والخلايا الهدف المعالجة بالبلازما. على وجه التحديد، يتم تحليل خلايا سرطان الجلد في تسلسل تتسم بكفاءة لفحوصات متتالية مختلفة ولكن باستخدام نفس الخلايا: قياس النشاط الأيضي وخلية الإجمالي في المنطقة، والتعبير علامة السطحية من كالريتيكولين، جزيء مهم موت الخلية مكسبه للخلايا السرطانية. هذه فحوصات استرداد المعلومات البيولوجية ذات المحتوى الغني عن آثار البلازما من صفيحة واحدة. بالإجمال، تصف هذه الدراسة باتخاذ الخطوات الضرورية وبروتوكولات لإجراء أبحاث طبية البلازما.

Introduction

أنواع رد الفعل المنظمين الأكسدة الهامة في المرض، بما في ذلك الشاذ الجرح الشفاء1 والسرطان. 2 الأهم من ذلك، تشترك هذه الأنواع في علم الأمراض، فضلا عن قرارها العلاجية. 3 , 4 البلازما الباردة المادية هو غاز المتأين الذي يطرد رد الفعل نوعا من أنواع كثيرة. 5 منذ ظهور ما يسمى البلازما الباردة التي تعمل في درجة حرارة الجسم6، البلازما الباردة يمكن تطبيقها على الخلايا والأنسجة دون الضرر الحراري. بإظهار فعالية والاستخدام الأمن لأجهزة البلازما في الملاحظات ما قبل السريرية والسريرية، تلقينا ثلاثة الاعتماد كالأجهزة الطبية في ألمانيا. 7 لا سيما فيما يتعلق بسلامة سمية جينية، لقد بينت دراسات عديدة نظراً لعدم أحداث مطفرة باستخدام الجهاز الأول، وطائرة نفاثة بلازما أرغون ضغط الجوي. 8 , 9 , 10 الجهازين الآخرين هي تصريفات جدار عازل ما يسمى (DBD)، التي تعمل عن طريق مبدأ مختلفة من jet البلازما. على وجه التحديد، تسمح الطائرات للعلاج دون مشرط مثل الأسطح وتجاويف بينما البلازما دبد تتسم بالكفاءة في معالجة مجالات الأنسجة أكبر ولكن بدلاً من شقة. استغلال الأكسدة الخلوية مما يشير إلى11، والهدف من هذا الأسلوب استخدام المولدة بواسطة بلازما الأنواع التفاعلية للتطبيقات الطبية الحيوية. 12 تطبيق واعدة بوجه خاص للعلاج السريري البلازما هو الدعم لالتئام الجروح. 13 , 14 , وعلاوة على ذلك، 15 كان سيظهر البلازما آثار السرطان في نماذج حيوانية. 16 , 17 , 18

قبل التحقق من فعالية وسلامة من تطبيقات البلازما في نماذج حيوانية، أو حتى من البشر، موحدة في المختبر الاحتياجات البحثية القيام بها بأجهزة البلازما. هذه التجارب ضرورية لاستكشاف تطبيقات البلازما وتحدد الآليات في العمل. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة البحوث الأساسية لفهم الأثر المترتب على تكوين الأنواع المتفاعلة والآثار البيولوجية اللاحقة. وتوضح هذه الدراسة كيف يمكن إدماج البلازما في البحوث الطبية الحيوية فهم أفضل والتحكم في إثارة على الخلايا. فهو يصف ضبط تكوين الغاز الأعلاف، ورصد إنتاج الأنواع المتفاعلة، تطبيقات البلازما للسوائل، والخلايا، والأنسجة، ونتائج الكيميائية والبيولوجية الناتجة عن ذلك. وعلاوة على ذلك، تقدم الأمثلة التي يصدر تعليمات بتوحيد العلاج البلازما وفحوصات بيولوجية المصب، مع تركيز على البحوث الطبية البلازما في لوحات 96-جيدا. هذا النهج ومزايا متميزة: أنا) التقليل إلى أدنى حد عدد الخلايا بحاجة كل حالة وكاشف تكاليف ووقت التدريب العملي على كل عينة؛ ثانيا) بدل لمزيد من الدقة في النتائج كما يمكن إعداد العلاجات مكررة أو ثلاث بسهولة؛ وثالثاً) تيسير المعايرة المصب سلس في قارئ لوحة تنسيق 96-جيدا، والتصوير، والتدفق الخلوي التجارب.

Protocol

1-البلازما رصد الأنواع والإعداد العلاج

  1. أنواع البلازما الرصد
    1. استخدام طائرة نفاثة بلازما ضغط الجوي وبحد أقصى 2 ليتر القياسية في الدقيقة التي تغذي تدفق الغاز.
    2. خط عمودي على المحور بلوم، ضع الطائرة أمام جهاز المطياف الضوئي انبعاثات ضوئية، وكرس فوتوميسيون سجل والطول الموجي (200-1,000 nm) باستخدام البرمجيات.
    3. مزيج من 0.5% من النيتروجين أو الأكسجين الجاف أو هوميديفيد غاز تغذية (5%).
    4. كرر مطيافية الانبعاث الضوئي لكل شرط الغاز.
    5. تحليل مع البرامج المناسبة لعرض رسومي للبيانات.
  2. إعداد العلاج البلازما
    1. إصلاح الطائرة النفاثة لجدول xyz يحركها على جهاز الكمبيوتر.
    2. تحديد الموقف الآبار وإنشاء برنامج نصي لكمبيوتر لنقل الطائرة النفاثة منضم إلى الجدول، مع أوقات العلاج المناسب، فوق المركز من كل بئر.
    3. إضافة 104 أي نوع من الثدييات خلايا ملتصقة في 100 ميليلتر من مستنبت الخلية كاملة (RPMI1640 مع FCS 10% والجلوتامين 2% 1% البنسلين/ستربتوميسين) إلى عدة آبار تحت غطاء الاندفاق الصفحي.
    4. تسمح الالتصاق الخلوي تحدث بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون.
    5. علاج الخلايا بالبلازما ل 20 s على ارتفاعات مختلفة (محور ع) فترات 250 ميكرون.
    6. إضافة 25 ميليلتر من يوديد propidium في خلية ثقافة متوسطة لكل بئر.
    7. صورة الخلايا تحت المجهر لتحديد الارتفاع المحددة التي لا تسبب نخر خلية بسبب التغذية الغاز دفع المتوسطة الثقافة أعلى الخلايا جانبا.
      ملاحظة: لأوقات أطول في العلاج، تحديد تبخر السائل في هذا الارتفاع خاصة، في البلازما وإيقاف الوضع، التي تزن اللوحة قبل وبعد المعالجة بالبلازما لتحديد كمية ميكروليتيرس دوبليديستيليد المياه اللازمة لإعادة تأسيس ناضح التوازن في الآبار المعالجة.
    8. إعداد بروتوكول نهائي ل xyz الجدول مع الأوقات معاملة كل منهما (هنا: 20 ق، 40 s، 60 s البلازما ومراقبة الغاز s 60)، وكذلك المواقف، ولديها استعداد الممصات متعددة القنوات والخزانات للتعامل مع السائل من لوحات 96-جيدا في الاختبارات اللاحقة.

2-تحليل المكونات الرئيسية المتفاعلة في السوائل المعالجة بالبلازما

  1. تحليل للمعالجة بالبلازما بيروكسيد الهيدروجين
    1. علاج 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع البلازما في ثلاث نسخ في لوحات مسطحة القاع 96-جيدا.
    2. إعداد مزيج رئيسي عن طريق تحميل 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 10 يو من الفجل البيروكسيديز و 5 ميكرون من بيروكسيد الهيدروجين الكشف عن الكاشف (يكفي لأحد جيدا؛ ورفع مستوى تبعاً لذلك).
    3. إضافة ميليلتر 95 من مزيج الرئيسي لكل بئر.
      ملاحظة: الخطوة السابقة ينبغي إجراء تحت أحد مقاعد نظيفة أو في غرفة منفصلة عن مصدر البلازما كما الأوزون الهواء المحيط يمكن أن تقلل حساسية المقايسة.
    4. في لوح منفصل، إعداد سلسلة تمييع شقين من بيروكسيد الهيدروجين في برنامج تلفزيوني بتركيز أعلى من 100 ميكرومتر في 100 ميليلتر PBS.
    5. إضافة 5 ميليلتر من عينات أو معايير فوق أكسيد الهيدروجين إلى الآبار التي تحتوي على الكشف عن الكاشف.
    6. وتشمل الآبار التي تحتوي على الكشف عن الكاشف للطرح الخلفية بعد القراءة فقط.
    7. احتضان اللوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. ضع اللوحة في القارئ الميكروسكوبية قياس fluorescence في λت 535 نانومتر و λم 590 نانومتر.
      ملاحظة: إذا كان من المتوقع ارتفاع تركيزات بيروكسايد في العينات، تمييع عينة يحتاج إلى زيادة أو قراءات تحتاج إلى القيام به مع أوقات حضانة أقصر لتجنب تشبع المقايسة.
    9. طرح قيم فارغة من جميع العينات وحساب المنحنى القياسي بيروكسايد، وقياس تركيزات بيروكسايد عينة غير معروف من ذلك المنحنى خط الأساس.
  2. تحليل النتريت المعالجة بالبلازما
    1. علاج 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع البلازما في ثلاث نسخ في لوحات 96well فلاتبوتوم.
    2. إعداد مزيج رئيسي من حل الكشف عن النترات بإضافة 1 ميليلتر من كاشف الكمي إلى 99 ميليلتر من دوبليديستيليد المياه (يكفي للمرء جيدا؛ ورفع مستوى تبعاً لذلك).
    3. إضافة 100 ميليلتر الواحدة وكذلك إلى لوحة واضحة، فلاتبوتوم 96well. رفع مستوى حسب الحاجة لعدد الآبار.
    4. إعداد سلسلة تمييع المعايير النتريت في المياه دوبليديستيليد.
    5. إضافة 10 ميليلتر من المعايير أو عينات إلى مزيج الرئيسي في لوحات 96well.
    6. احتضان اللوحة في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. إضافة 5 ميليلتر من نتريت الكمي مطور الحل لكل بئر.
    8. قراءة الأسفار في قارئ ميكروسكوبية λالسابقين 365 نانومتر و λم 450 نانومتر.
    9. طرح قيم فارغة من جميع العينات وحساب المنحنى القياسي والنتريت، وقياس تركيزات النترات عينة غير معروف من ذلك المنحنى خط الأساس.
  3. تحليل للمعالجة بالبلازما فائق أكسيد
    1. جعل مزيج رئيسي من الفسفرة المؤكسدة (1 ملغ/مل) وكاتالاز (20 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 100 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى الآبار لصفيحة 96-جيدا واضحة، مسطحة القاع.
    3. علاج مزيج الرئيسي مع البلازما في ثلاث نسخ كل حالة المعاملة.
    4. قراءة امتصاص في 550 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية؛ هذه البيانات الرسم البياني.
    5. حساب كمية أكسيد فائق التي تم إنشاؤها باستخدام معامل الانقراض المولى السيتوكروم ج، وطول مسار الضوء السائل داخل بئر.

3-الاستجابة البيولوجية للخلايا المعرضة للبلازما

  1. القراءة المتعددة الأبعاد للخلايا المعالجة بالبلازما: النشاط الأيضي
    1. استخدام غطاء الاندفاق الصفحي لكل من الإجراءات التالية.
    2. ويكمل البذور 104 خلايا (الميلانوما موريني B16) في 100 ميليلتر الكامل مستنبت الخلية الواحدة وكذلك في لوحات مسطحة القاع 96-جيدا.
    3. تسمح الالتصاق الخلوي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد الحاضنة مع 5% ثاني أكسيد الكربون.
    4. باستخدام الجدول xyz، معالجة الآبار بالبلازما أو الغاز وحدها وفقا لمخطط معرف مسبقاً، وإضافة الخلايا إلى حاضنة ح 20.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تقلع supernatants بعد 20 ح لتحليل المنتجات خارج الخلية؛ إضافة 100 ميليلتر من متوسطة جديدة بعد ذلك.
    5. لكل بئر، إضافة 25 ميليلتر من مستنبت الخلية التي تحتوي على 500 ميكرون ريسازورين (تركيز نهائي 100 ميكرومتر)؛ إعداد الآبار الثلاثة التي تحتوي على ريسازورين وحدها في خلية ثقافة متوسطة دون خلايا للطرح الخلفية.
    6. احتضانها ح 3 في الحاضنة.
    7. قراءة الأسفار في λت 535 نانومتر و λم 590 نانومتر في قارئ ميكروسكوبية.
    8. طرح fluorescence خلفية من جميع العينات، وتطبيع البيانات إلى قيم عنصر التحكم.
  2. القراءة المتعددة الأبعاد للخلايا المعالجة بالبلازما: صورة التحليل
    1. استخدم لوحة جيدا من 3.1.7 وتجاهل المادة طافية.
    2. إضافة 100 ميليلتر من مستنبت خلايا جديدة تتضمن يوديد propidium ميكروغرام/ملليلتر 1.
    3. وضع لوحة تحت مجهر مع مرحلة يجهز الصورة كل بئر.
      ملاحظة: تفاصيل تصوير تعتمد على مسألة تجريبية؛ هنا، كان يستخدم هدفا X 20 في جهاز تصوير عالية المحتوى لقراءة 3 × 3 حقول النظر في كل بئر في حقل مشرق قناة، قناة التباين المرحلة الرقمية، وقناة (يوديد propidium) الأسفار، واستخدام الضوء الإثارة المناسبة والانبعاثات عوامل التصفية.
    4. استخدام برمجيات التحليل صورة كمية لتحديد إجمالي مساحة سيتوسوليك في المرحلة الرقمية الصور على النقيض من كافة الحقول لعرض تصويرها في كل بئر.
      ملاحظة: تحليل معلمات أخرى إذا رغبت في ذلك، على سبيل المثال، عدد خلايا قابلة للحياة و/أو ميت أو نشاط المتقدرية البقع مخصصة باستخدام. في حالة استخدام البقع الأخرى مما هو موضح في هذا العمل، تأكد من أن البقع fluorescence المستخدمة للفحص المجهري لا تتراكب طيفيا مع فلوروتشروميس المستخدمة في التجارب اللاحقة التدفق الخلوي.
    5. البيانات الرسم البياني، وإذا رغبت في ذلك، اختبار للعلاقة مع القيم التي تم الحصول عليها للنشاط الأيضي.
  3. القراءة المتعددة الأبعاد للخلايا المعالجة بالبلازما: التدفق الخلوي
    1. لهذا التحليل، استخدم لوحة جيدا من الخطوة 3.2.5.
    2. تجاهل المادة طافية ويغسل مرتين مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (0.9 و 0.5 ملم، على التوالي).
      ملاحظة: إصلاح و/أو بيرميبيليزي الخلايا في هذه المرحلة لمزيد قراءات البيولوجية غير المشمولة في هذه المساهمة، مثل تلطيخ تحليل مستضد أو دورة الخلية داخل الخلية.
    3. لكل بئر، إضافة 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم التي تحتوي على 50 نانوغرام/مل كالريتيكولين الماوس المضادة الأجسام المضادة.
    4. احتضان لمدة 15 دقيقة في الحاضنة.
    5. تماما يغسل مرتين مع 200 ميليلتر لتكميل خلية الثقافة المتوسطة وتجاهل السائل في اللوحة.
    6. إضافة 100 ميليلتر من الخلية المفرزة الحل لكل بئر، واحتضان لمدة 20 دقيقة في الحاضنة.
    7. استخدام مجموعة أخرى من الخلايا B16 أونستينيد في تعليق لإعداد بروتوكول اكتساب سيتوميتريك التدفق، النابضة استراتيجية، والمكاسب والفولتية لنظريتهم.
    8. تحميل اللوحة cytometer تدفق مجهزة عينات سيارات لوحات 96-جيدا.
    9. الحصول على حد أدنى من الخلايا 1,000 في الأمام والجانب المبعثرة السكان المرتبطة عادة بخلايا قابلة للحياة.
    10. استخدام برامج مخصصة لتحليل التدفق الخلوي، ملفات.fcs بوابة سكان الفائدة، وتحديد كثافة fluorescence يعني كالريتيكولين.
    11. بيانات الرسم البياني، وإذا رغبت في ذلك، اختبار للعلاقة مع القيم التي تم الحصول عليها لترسب النشاط والتصوير، و/أو الأكسدة الأيضية.

Representative Results

في هذه الدراسة، وصف سير عمل مبسطة للبحوث الطبية في آثار البلازما. النهج المتعدد التخصصات الذي يستخدم هنا يحلل الشخصية الأساسية الانبعاثات الضوئية من jet البلازما، مكونات رد الفعل الرئيسي في السائل، والاستجابات البيولوجية للخلايا تعامل مع البلازما (الشكل 1).

إجراء سير العمل هذا، يلزم عدد من المكونات لإعداد مصدر البلازما (الشكل 2) بشكل صحيح. الغازات المختلفة (هنا أساسا الأرجون والأكسجين، والنيتروجين) تم تزويد ويسيطر عليها عدة وحدات التحكم بالتدفق الجماعي. استخدمت فريق مركزي لضبط رقمياً وحدات التحكم بالتدفق الجماعي لتدفقات الغاز تغذية محددة سلفا. أن تسفر عن التراكيب الغاز تغذية محددة، مختلطة الغازات فعلياً استخدام فريق صمامات التي تجمع بين الغازات من عدة وحدات التحكم بالتدفق الجماعي (الشكل 2أ). تم تبديل مصدر البلازما، والنفايات السائلة البلازما أقيمت أمام الناقل التسلسلي العام--جهاز المطياف الضوئي (الشكل 2ب) مع مجموعة بصرية من 200 نانومتر إلى 1000 نانومتر. لمعالجة السوائل والخلايا، وصفت كفاءة عمل باستخدام لوحات 96-جيدا. أطباق متعددة عقدت في مكان باستخدام إطار بلاستيكية التي تم إصلاحها في الصفيحة القاعدية مع الملاحق مطابقة به ثقوب مطبوع (الشكل 2-ج). وضع برنامج الإعداد الكامل تحت غطاء الاندفاق الصفحي (الشكل 2د). وشملت هذه الإعداد جدولاً xyz الذي أقيم باليد قطعة من الطائرة النفاثة البلازما. يمكن تحديد موقع عناصر التحكم في المحركات خارج مقاعد البدلاء، وإذا كان هذا الأخير قد منافذ الكبل كبيرة بما فيه الكفاية من وإلى xyz-الجدول. الأهم من ذلك، الجدول كان يسيطر على جهاز الكمبيوتر، ويمكن برمجتها تحوم الطائرة النفاثة فوق وسط كل بئر بدقة ميكرومتر للمبلغ المطلوب من الوقت. وعلاوة على ذلك، اختير موضع البدء (كما هو الحال في الإعداد لدينا، A1 جيدا) بحرية (الشكل 2ه). جنبا إلى جنب مع صاحب اللوحة البلاستيكية، وهذا يسمح لعلاج بلازما استنساخه مع أي تغيرات يوما بعد يوم فقط تتعلق بالإعداد للتجارب البيولوجية والسائل.

واستخدمت مطيافية الانبعاث الضوئي (OES) لمتابعة قمم متميزة ترتبط بمكونات البلازما رد الفعل في ظروف مختلفة تغذية الغاز (الشكل 3أ). على سبيل المثال، النظام الإيجابية الثانية من النيتروجين مع قمم من 330 نانومتر إلى 380 نانومتر تمثيل النيتروجين التفاعلي الأنواع، والذروة في 309 شمال البحر الأبيض المتوسط يمثل الهيدروكسيل (السهم في الشكل 3أ). مقارنة بغاز الأرجون وحدها، زاد وجود الأنواع النيتروجين مع مزيج نيتروجين في تغذية الغاز، بينما تضاءل إضافة الأكسجين أو الرطوبة أو تخفيض، على التوالي. على النقيض من ذلك، كان وجود الهيدروكسيل انخفض مع الأكسجين أو النيتروجين لكن زيادة ملحوظة إذا استخدمت الأرجون هوميديفيد كغاز التغذية. للمعالجة بالبلازما للسوائل، تم تحديد التبخر الناجم عن غاز الأرجون وبلازما الأرغون الأول (الشكل 3ب). الأهم من ذلك، كل الشروط لم تسفر عن نتائج مماثلة للبلازما تمارس أيضا آثار على درجة الحرارة. وفقا لنتائج OES جذور الهيدروكسيل، ترسب فوق أكسيد الهيدروجين انخفض مع اختلاط الأكسجين أو النيتروجين إلى حد كبير لكنه زاد مع الغاز تغذية هوميديفيد (الشكل 3ج). وعلاوة على ذلك، إضافة النيتروجين لتغذية الغاز أدى إلى تركيزات النترات أعلى بكثير مقارنة بالسوائل المعالجة ببلازما الأرغون (الشكل 3د). يمكن أيضا استخدام سير العمل هذا للتحقيق في تأثير البلازما على السوائل مع تركيبات مختلفة. على سبيل المثال، يبدو تركيزات بيروكسيد الهيدروجين لتكون مستقلة عن وجود مصل العجل الجنين في برنامج تلفزيوني و RPMI1640 خلية الثقافة المتوسطة (الشكل 3ه). في نفس العينات، تناقص وجود مصل تركيزات النترات في برنامج تلفزيوني وخلية من الثقافة المتوسطة مقارنة بنظرائهن المحتوية على غير مصل (الشكل 3و). وأنتج معظم أكسيد فائق في ظروف غاز الأرجون الجافة مع الأكسجين أو النتروجين إضافات كبيرة تبريد توليد أكسيد فائق، باستثناء بلازما الأرغون هوميديفيد-الأوكسجين (الشكل 3ز).

للمعالجة بالبلازما الخلايا في أطباق متعددة جيدا، كان اللوحة التي تحتوي على خلايا المصنف قبل يوم من الحاضنة وأضيف إلى صاحب البلاستيك. تم تطبيق نمط معاملة مبرمجة وتم تعويض التبخر ووضعت اللوحة العودة إلى الحاضنة حاء 20 علما أن بعد هذه الحضانة، يمكن تم جمعها في لوحة 96-بئر جديد وفارغ supernatants ثقافة الخلية والمخزنة في- 80 درجة مئوية للتقييم للبروتينات للفائدة. بعد ذلك، تمت إضافة ريسازورين إلى الخلايا لكل بئر. فقط تيسرت بفضل الإنزيمات النشطة المدرة نادف دوران الفلورية غير ريسازورين إلى ريسوروفين الفلورية وكان يرتبط بالنشاط الأيضي عموما (الشكل 4أ). كثافات fluorescence شبيهة بالإدراك البصري اللوحة، وأشار إلى الآثار السامة للخلايا للعلاج المطول البلازما (الشكل 4ب). وكانت ظروف الغاز هوميديفيد أكثر ضررا من شروط الغاز الجاف. واستخدمت نفس الخلايا في اللوحة للمزيد من فحوصات المتلقين للمعلومات. وكانت الزنزانات في اللوحة مجهريا التحقيق (الشكل 4ج). باستخدام برامج التصوير، بحثت عدة آبار اللوحة للمقارنة النوعية (الشكل 4د). برنامج يسمح التحديد الكمي لمجموع المساحة المشمولة بالخلايا داخل طريقة العرض للحقول المكتسبة في كل بئر وتم تطبيع البيانات الناتجة للضوابط الخاصة بكل منها (الشكل 4ه). واعتبر انخفاض مساحة الخلية إجمالي في عينات البلازما العلاج، خاصة مع ظروف الغاز تغذية هوميديفيد. بعد التصوير، الخلايا تم غسلها، ملطخة بالأجسام المضادة كالريتيكولين المضادة الماوس، فصل، وتحليلها مع التدفق الخلوي (الشكل 4و). يعني fluorescence كثافة calreticulin تلطيخ في خلايا قابلة للحياة (الشكل 4ز) تم حسابها ومقارنتها بين العينات (الشكل 4ح). المعالجة بالبلازما الناجم عن أوبريجوليشن كالريتيكولين على سطح خلية سرطان الجلد مورين، التي تتطابق مع الوقت معاملة البلازما تطبيقها مع الظروف الجافة تغذية الغاز. هوميديفيد الغاز تغذية الأوضاع، 20 ثانية و 40 s المعاملة الناجمة عن تعرض كالريتيكولين أقوى مقارنة بأكثر فتكاً وقت العلاج s 60. وهذا يوحي كان هناك لائحة غير خطية من التعرض كالريتيكولين فيما يتعلق بمقدار التأكسد وعرض للخلايا.

Figure 1
الشكل 1 : سير العمل للبحوث الطبية البلازما من الفيزياء إلى علم الأحياء- يتم ضبطها الإخراج الأنواع المتفاعلة للطائرة بلازما الأرغون الضغط الجوي بتحوير الغاز الأعلاف. يتم رصد جزيئات المحدد في مرحلة الغاز البلازما باستخدام التحليل الطيفي. يستخدم البلازما لعلاج السوائل والتحقيق ترسب الأكسدة. الخلايا المزروعة في ميكروبلاتيس المعالجة بالبلازما، ويتم إجراء قراءات البيولوجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : برنامج إعداد هيئة بحوث البلازما. (أ) الغازات المختلفة في الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب مدفوعة إلى عدة وحدات التحكم بالتدفق الجماعي التي يتم التحكم فيها عن طريق لوحة وسط. تكوين الغاز تغذية فردية مختلطة بعد ذلك باستخدام فريق صمامات. (ب) يمكن رصد بعض المكونات المتفاعلة من البلازما باستخدام مطيافية الانبعاث الضوئي للتحقيق في الخلافات بين مختلف تغذية الغاز التراكيب. (ج) تستخدم لبحوث البلازما الفائق، ميكروبلاتيس 96-جيدا. لضمان ثابت نقطة انطلاق للمعالجة بالبلازما للبرمجة والآلي، يتم إضافة اللوحة إلى إطار ضمان نفس الموضع المطلق للوحات من يوم إلى يوم. (د) يتم إصلاح jet البلازما للكمبيوتر التي تسيطر عليها xyz-جدول الموجود تحت غطاء الاندفاق الصفحي. جميع المواقع الدقيقة 96 والوقت الذي يسكن البلازما على كل جيدا هو مكتوب إلى ملف برنامج لتوجيه حركة مصدر البلازما. الإسكان الرئيسية جهاز البلازما النفاثة، فضلا عن عناصر التحكم الحركي تقع على مقربة. () الآلي المعالجة بالبلازما لصفيحة 96-جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : جيت البلازما والسائل التحليل. (أ) يظهر الضوئية الانبعاث الطيفي من الغاز تغذية مختلف الظروف. النظام الإيجابية الثانية من النيتروجين (330 نانومتر إلى 380 nm) قد زادت مع مزيج نيتروجين، غائبة في حالة اختلاط الأكسجين، وانخفاض ملحوظ مع الأرجون هوميديفيد (لوحات lefthand). ذروة الهيدروكسيل في 309 نانومتر (السهم) انخفضت في ظروف النيتروجين والأكسجين ولكن زيادة ملحوظة مع الأرجون هوميديفيد مقارنة بغاز الأرجون وحدها. (ب) غاز التعرض للسوائل يؤدي إلى التبخر. كان يحدده مقدار التبخر كل بئر في لوحة 96well على العلاج بغاز الأرجون والبلازما وحدها تزن اللوحة قبل وبعد العلاج باستخدام مقياس جيد. التبخر في عينات بلاسماتريتيد كان أعلى بالمقارنة مع أن في عينات جاستريتيد الأرجون. (ج) توليد من فوق أكسيد الهيدروجين في السوائل بلاسماتريتيد يرتبط إلى حد ما بذروة نانومتر 309 الهيدروكسيل في (ألف). هوميديفيد بلازما الأرغون (5%) زيادة تركيزات بيروكسايد حوالي 4fold. تم رفع النتريت (د) عندما تمت إضافة النيتروجين غاز الأعلاف، وزاد هذا التأثير مع بلازما الأرغون هوميديفيد. إضافة الأوكسجين انخفض جيل والنتريت ولكن ليس إلى حد كبير. (ه، و) ويرد تركيزات الهيدروجين بيروكسيد والنترات في أنواع مختلفة من السوائل، إلا وهي RPMI1640 خلية الثقافة المتوسطة مع (R10F) ودون (R0F) فضلا عن برنامج تلفزيوني مع أو بدون مصل العجل الجنين (FCS). لم تختلف مستويات بيروكسايد بين وسائل الإعلام المختلفة (ه) بينما مستويات النترات وقد تناقص بصورة كبيرة في وجود مصل. (ز) كان أعلى إنتاج أكسيد فائق لغاز الأرجون الجافة تغذية الغاز؛ مزيج من النيتروجين، والأكسجين، أو الأرغون هوميديفيد أعطى أقل فائق أكسيد ترسب في السائل. البيانات المعروضة (غ ب) هي تعني + وزارة شؤون المرأة من تجارب اثنين إلى ثلاثة. التحليل الإحصائي وكان يؤديها (ج، د) استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه مقارنة الوسائل مجموعة كاملة من الظروف الجافة أو الرطبة تغذية الغاز ضد سيطرة كل منهما (* * ف < 0.01؛ * * * ف < 0.001). بالإضافة إلى ذلك، كانت أرغون بلازما الغاز فقط الظروف مقارنة باستخدام متوسط المجموعة بأكملها والاختبار t (# # # ف < 0.001). كذلك أجرى التحليل الإحصائي (F) باستخدام t-اختبارات مقارنة قيم كل معاملة البلازما وحالة متوسطة في العينات مع FCS ودون FCS (* p < 0.05؛ * * ف < 0.01)؛ أيضا، قورنت FCS أو غير FCS التي تحتوي على حلول داخل كل وقت المعاملة البلازما باستخدام الاختبار t (# p < 0.05؛ # # ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : المعالجة بالبلازما وأثرها على الخلايا. خلايا (A) قد تعرضت للبلازما وتمت إضافة ريسازورين بعد 20 ساعة لتقييم النشاط الأيضي. النشاط (ب) انخفض بدرجة كبيرة في عينات بلاسماتريتيد مقارنة بضوابط الغاز. واعتبر انخفاضا ملحوظا مع الترطيب الغاز تغذية حين إضافة الأكسجين أو النيتروجين تؤدي إلى السمية في ظروف غاز الأرجون الجافة والرطبة على حد سواء. وأضاف المتوسطة (ج) يحتوي على يوديد propidium (PI). (د) نظرة عامة يظهر من الآبار التي بليت مع تباين المرحلة الرقمية (برتقالي) يمثل الكسر سيتوسوليك لكل خلية وبي (الأخضر) لتحديد الخلايا الميتة. أدوات التصوير يسمح التحديد الكمي لإجمالي المساحة داخل مجال الرؤية لكل منهما بتغطية جيدة مع الخلايا. خلايا (F) بعد غسلها والمحتضنة مع الأجسام المضادة أو علامات خلية أخرى لوصف الآثار البيولوجية البلازما باستخدام التدفق الخلوي. (ز) استراتيجيات Gating يعملن وإجراء تحليل العلامة والمقارنة بين العينات. تدل البيانات المعروضة (ب، ه، ح) يعني + SEM ممثل واحد من ثلاث تجارب مستقلة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (د). تم إجراء مقارنة إحصائية باستخدام اتجاهين تحليل الفروق (ب، ح) مقارنة، لكل حالة الغاز، كل معاملة البلازما لسيطرتها الغاز كل منهما (* p < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ * * * ف < 0.001). بالإضافة إلى ذلك، تم مقارنة القيم الخاصة بكل شرط من إضافات النيتروجين أو الأكسجين بقيم بلازما غاز الأرجون الجاف والظروف الرطبة على حدة (اتجاهين تحليل الفروق؛ # # # ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

البحوث الأساسية هو أمر أساسي لتطوير فهم فعالية والآليات التي يقوم عليها الطب البلازما في البحوث السريرية والاكلينيكية. ويشجع البحوث الأساسية أيضا التحقيق في طلبات الحصول على العلاجات الجديدة. بينما ثبت أن البلازما التوسط آثارها البيولوجية عن طريق توليد الأكسجين التفاعلية والنيتروجين الأنواع19، إلا أنه لا تزال هناك ثلاثة تحديات رئيسية في الميدان. أولاً، هي الأنواع الهامة؟ وهذا يمكن الإجابة جزئيا بتحوير تكوين غاز التغذية البلازما مع التشخيص البصري وقراءات البيولوجية. 20 ثانية، ما هي الآثار التي يمكن رؤية في أهداف بيولوجية مثل الخلايا؟ وهذا، على الأقل جزئيا، موجهة باستخدام تجارب الثقافة الخلية وعدد من فحوصات. في الخلايا حقيقية النواة، آثار بليوتروبيك بما في ذلك دورة الخلية اعتقال21، المبرمج22،23من نخر، والجلد خلية تنشيط24،،من2526، فضلا عن دعم أو إنقاصها للخلية الحركة أو النشاط الأيضي27،،من2829. والتحدي الثالث، المتعلقة بهذه الآثار بليوتروبيك، هو تحديد الجزيئات الرئيسية التي تحدد الاستجابة الخلوية للتأكسد المستمدة من البلازما لشرح تأثيرات مختلفة غالباً ما ينظر في أنواع مختلفة من الخلايا. يمكن أن يتم ذلك قبل اوميكس تقنيات30،،من3132 و/أو حتى أو downregulation الجينات المستهدفة باستخدام siRNA (الأكسدة) إشارات مثبطات، ومضادات الأكسدة والأنزيمات المضادة للأكسدة، فضلا عن التعديل إخراج الأنواع المتفاعلة في البلازما. 33 , 34 , 35 ومن ثم البروتوكولات المقايسة مبسطة هناك حاجة لاختبار مجموعات عينة أكبر مع عدد كبير من التكرارات.

هذه الدراسة نموذجا لكفاءة عمل تجريبي، من الفيزياء إلى علم الأحياء، للبلازما البحوث الطبية فيما يتعلق بالتحديات المذكورة أعلاه. وقد وصف تفاصيل عن الجوانب الهندسية لمصدر البلازما وتوليد بلازما قبل. 36 , 37 , 38 وكل من هذه الاختبارات تجري في لوحات 96well، والذي يحتوي على عدد من المزايا. على سبيل المثال، عينات مثل supernatants ثقافة خلية يمكن بسهولة حمل من التحليل إلى مجموعة لوحات للتحقيق، على سبيل المثال، تركيزات البروتين عن طريق إنزيم مرتبط الممتز المقايسة. في حالة توفر المعدات العلمية قادرة على قراءة مباشرة من 96-الآبار، هذا نهج يقلل تكاليف كل نموذج وهاندسونتيمي ويزيد من نتائج عن طريق الإرسال المتعدد فحوصات مختلفة من نفس العينة. استخدام القنوات المتعددة الممصات بالإضافة إلى ذلك يزيد من سرعة معالجة العينة. من حيث المبدأ، مقايسة الموصوفة هنا يمكن أيضا يتم استخدام تنسيقات لوحة جيدا مع أكبر أقطار جيدا، على الرغم من أن هذا يتطلب خطوات إضافية بيبيتينج في الأنابيب والسفن لفحوصات المتلقين للمعلومات الأخرى. ومع ذلك، لوحة أصغر أنواع مثل لوحات 384well، ولا تمثل هندسة مناسبة للبحوث الطبية الحيوية البلازما استخدام الطائرات مع تدفقات كبيرة من الغاز تغذية. على وجه التحديد، أنه لا يمكن ضمان أن الآبار واحد فقط ولكن ليس المتاخمة تتأثر أثناء علاج.

تحليل السائل ضروري للتحقيق ترسب الأنواع بالبلازما. في تحليلات الخبراء، يمكن وصف إعداد موازية لفحوصات مختلفة السوائل بلاسماتريتيد فيما يتعلق التأكسد مختلفة في نفس الوقت. يسمح هذا الإرسال المتعدد على تطوير صورة متباينة من الأنواع بلاسماديريفيد. وصف نهج حساس بدرجة كبيرة للتحقيق بيروكسيد الهيدروجين تركيزات39، وغالباً ما ضرورية ولكنها ليست دائماً كافية لشرح آثار البلازما. 40 , 41 , 42 بيولوجيا ذات الصلة يمكن أيضا تقييم الآثار في السوائل مع بالانزيم الجلوتاثيون غير المدرجة هنا. 43 المستحسن تحليل النتريت محددة عبر فحوصات جريس التقليدية بسبب حساسية المقايسة أعلى 10fold (البيانات لا تظهر). أيضا يمكن أن يحقق في السوائل بلاسماتريتيد لتكوين حمض هيبوتشلوروس باستخدام دتنب-المقايسة. حتى الآن، لم تشر النتائج السابقة إلى تشكيل تلك الأنواع مع مصدرنا البلازما. 19 , 39 , تدهور الأنواع 44 بعد الانتهاء من المعالجة بالبلازما، يأخذ مكانة على مر الزمن. النيتريت يتفاعل مع نترات؛ أيضا، يتم استهلاك بيروكسيد مع مرور الوقت. بيد أن هذه العمليات تستغرق عدة ساعات. 35 الاستيعاب ج الفسفرة مستقرة على مدى عدة ساعات، وكذلك. ولذلك، إذا تحدث العمليات داخل 30 دقيقة الأولى بعد العلاج، لا تذكر الاختلاف في تركيزات الأنواع المعمرة الموصوفة هنا. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند التحقيق في أنواع معينة من وسائل الإعلام (مثلاً، "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو) كمكونات يمكن مسح تصل إلى 90% بيروكسيد ضمن ح 1 (البيانات لا تظهر) مما أدى إلى استهانة ترسب بيروكسايد البلازما في السوائل.

ويرد مقايسة متعدد النطاقات التي من التحقيق في النشاط الأيضي على مساحة الخلية (مورفولوجيا) للتعبير علامة سطح الخلية. مزيج من هذه الاختبارات قد تكشف عن نتائج مثيرة للاهتمام. على سبيل المثال، أننا أظهرنا سابقا في وحيدات THP1 أن التهم النشاط وخلية الأيض لا تنخفض بطريقة خطية عقب التعرض للبلازما. بل 45 ، مع زيادة وقت العلاج البلازما، لوحظت الخلايا التي تم زيادة في الحجم وكان كتلة المتقدرية أعلى، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات التمثيل الغذائي على أساس بيرسيل. أساسا، المزيج من مولتيبلاتي القارئ، والفحص المجهري، والتدفق الخلوي مولتيبليكسيس معلومات عن الاستجابات الخلوية بعد المعالجة بالبلازما. في خلايا سرطان الجلد، نحن نركز هنا على الآثار السامة للخلايا والاستمناع وساطة من كالريتيكولين. 46 من حيث المبدأ، يمكن معالجة العديد من المسائل الأخرى مع هذا النهج ربط النشاط الأيضي مع التصوير والتدفق الخلوي النتائج. على سبيل المثال، تمايز الخلايا (مثل الاستقطاب بلعم)، إمكانات غشاء الميتوكوندريا، وتحليل دورة الخلية، حركية الخلية، الميكانيكا الحيوية، أو تشكيل ميكرونوكليوس لتحليل سمية جينية يمكن أيضا التحقيق في الخلايا المعالجة بالبلازما. قياس التدفق متعدد الألوان يسمح لتطبيقات أكثر في السكان خلية مختلفة في نفس الوقت. ويشمل هذا، على سبيل المثال، تحليل حالة الفسفرة إشارات البروتينات مثل عوامل النسخ والتحديد الكمي مرناً وقياس السيتوكينات داخل الخلايا، و/أو تقييم لمجموع ثيولس انخفاض على مستوى خلية واحدة. معلومات إضافية ذات صلة بيولوجيا أن يتوفر لكل عينة الإيدز في زيادة تطوير صورة آثار الأكسدة البلازما فهم أفضل لتطبيقات البلازما الحالية والمستقبلية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تمويل من الوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية منح الأرقام 03Z22DN11 و 03Z22DN12) هو العرفان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11, (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3, (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45, (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82, (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4, (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11, (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18, (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19, (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59, (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29, (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29, (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167, (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7, (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8, (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3, (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40, (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12, (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3, (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112, (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49, (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3, (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38, (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26, (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3, (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13, (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1, (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25, (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47, (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46, (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13, (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49, (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48, (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100, (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6, (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3, (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10, (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13, (1), 54-61 (2007).
البحوث الأساسية في الطب البلازما-نهج إنتاجية من السوائل للخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter