Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Фундаментальные исследования в медицине плазмы - пропускная способность подход от жидкости для клеток

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

Показано протокол лечения физических плазмы высокой пропускной способности жидкости и клетки. Это предполагает создание композиции различных подачи газа для зажигания плазмы, измерения спектров плазмы выбросов и последующего анализа жидкостей и клеточной активности после плазменной обработки.

Abstract

В медицине плазмы ионизированные газы с температурой близка к системы позвоночных применяются для клеток и тканей. Холодной плазмы генерации реактивной видов известных редокс регулировать биологические процессы в здоровье и болезни. Доклинических и клинических доказательств указывает на благотворное влияние плазмы лечения в лечении хронической язвы кожи. Другие новые темы, такие как лечение рака плазмы, получают все большее внимание. Медицинские исследования плазмы требует междисциплинарного опыта в физике, химии и биологии. Одной из целей исследования плазмы является характеризуют клетки плазмы лечение в различных конкретных приложений. Это включает, например, клеток и жизнеспособности, сотовой окисления, митохондриальной активности, цитотоксичность и режим смерти клетки, анализ клеточного цикла, клеточной поверхности маркер выражения и релиз цитокинов. Это исследование описывает основное оборудование и процессы, необходимые для таких исследований в биомедицине плазмы. Она описывает надлежащего функционирования атмосферное давление аргон плазменной струи, специально мониторинг ее основных выбросов спектры и подачи газа параметров для модуляции реактивных видов производства. С помощью высокоточных xyz таблицы и компьютерного программного обеспечения, струи завис в миллисекунду точность над полости 96-луночных пластин в микрометр точности для максимальной воспроизводимость. Показано ниже по течению анализов для анализа жидкой редокс активных молекул, и целевые клетки плазмы лечение. В частности, анализируются клетки меланомы в эффективной последовательности различных последовательных анализов, но с использованием тех же ячейках: измерение метаболической активности, ячейке области и поверхности маркер выражения calreticulin, молекулы, важных для иммуногенность клеток смерть раковых клеток. Эти анализы получить содержани-богатые люди биологическая информация о воздействии плазмы из одной пластине. Вообще это исследование описывает основные шаги и протоколы для медицинских исследований плазмы.

Introduction

Реактивных видов являются важными редокс регуляторы в болезни, включая аномальные ранозаживляющее1 и рак. 2 главное, эти виды участвуют в патологии, а также его терапевтические резолюции. 3 , 4 физические плазмы это ионизированный газ, который выгоняет реактивных видов многих видов. 5 с появлением так называемой холодной плазмы, которые действуют на тело температура6, холодной плазмы может применяться для клеток и тканей без тепловых повреждений. Демонстрируя эффективность и безопасное применение плазменных устройств в доклинических и клинических наблюдений, три получили аккредитацию медицинских приборов в Германии. 7 особенно в том, что касается безопасности генотоксичность, некоторые исследования показали отсутствие мутагенными свойствами событий, используя первое устройство, атмосферное давление струи плазмы аргона. 8 , 9 , 10 другие два устройства являются так называемые диэлектрического барьера сбросов (ДБД), которые действуют через другой принцип чем плазменной струи. Специально Джетс позволяют скальпель как обработки поверхностей и полостей тогда как DBD плазм являются эффективными в лечении большего, но довольно плоский ткани областях. Использование клеточных окислительно сигналы11, техника направлена использовать сгенерированный плазмы реактивных видов для биомедицинских приложений. 12 особенно перспективно применение клинических плазменной терапии является поддержка заживления ран. 13 , 14 , 15 Кроме того, плазма было показано, что противораковые эффекты в животных моделях. 16 , 17 , 18

Перед проверкой эффективность и безопасность применения плазмы в животных моделях, или даже людей, стандартизированы в vitro исследования необходимо проводить с плазменных устройств. Эти эксперименты имеют важное значение для изучения плазмы приложения и определить механизмы на работе. Кроме того базовые исследования необходимо понимать влияние состава реактивных видов и последующие биологические эффекты. Это исследование показывает, как плазмы могут быть интегрированы в биомедицинские исследования, чтобы лучше понять и контролировать его воздействия на клетки. Он описывает, тюнинг корма газовый состав, мониторинг реактивных видов производства, применения плазмы жидкостей, клетки, ткани и полученные результаты химических и биологических. Кроме того приводятся примеры которого инструктировать по стандартизации плазменной обработки и ниже по течению биологических анализов, с акцентом на медицинские исследования плазмы в 96-луночных пластины. Этот подход имеет свои преимущества: i) минимизации числа клеток, необходимое условие, реагент расходы и практический время за образец; II) пособие большей точности результатов, как двойные или тройные лечения можно настроить с легкостью; и iii) содействия бесшовных течению опробование в 96-луночных формат пластины читателя, визуализации и потока цитометрии экспериментов.

Protocol

1. плазмы видов мониторинга и лечения установки

  1. Плазмы видов мониторинга
    1. Использование плазменной струи атмосферное давление и максимум два стандартных литров в минуту, канал потока газа.
    2. Перпендикулярно к оси шлейфа, положение струи перед спектрофотометр оптического излучения, и записи фотоэмиссионный и волны (200-1000 Нм) с помощью посвятил программного обеспечения.
    3. Перемешайте 0,5% азота и кислорода к сухой или увлажненный подачи газа (5%).
    4. Повторите для каждого газа условия Оптическая эмиссионная спектроскопия.
    5. Анализ программного обеспечения для графического отображения данных.
  2. Плазменная обработка установки
    1. Исправьте струи в Компьютерные xyz-таблицу.
    2. Определить положение скважин и создания сценария компьютер для перемещения струи, присоединился к таблице, с надлежащего лечения раз выше в центре каждой скважины.
    3. Добавить 104 любого типа адэрентных клеток млекопитающих в 100 мкл полного клетки культуры среднего (RPMI1640 с 10% FCS, глютамин 2% и 1% пенициллина/стрептомицина) в нескольких скважин под капотом ламинарного потока.
    4. Разрешать клеточной адгезии к происходят в одночасье при 37 ° C в атмосфере увлажненный с 5% углекислого газа.
    5. Лечить клетки с плазмой для 20 s на разных высотах (ось z) интервалами 250 мкм.
    6. Добавьте 25 мкл пропидий йодидом в среде культуры клеток в каждой скважины.
    7. Изображение клетки под микроскопом для определения конкретной высоты, не вызывают некроз клеток из-за канала газ толкает питательной среды на верхней стороне клетки.
      Примечание: Для длительного лечения раз, идентифицировать жидкие испарения в этой конкретной высоты, в плазме и выключать режим, путем взвешивания пластины до и после лечения плазмы, чтобы определить количество микролитров doubledistilled воды необходимо восстановить осмотического гомеостаза в обрабатываемой скважины.
    8. Подготовить заключительный протокол для xyz таблицы с соответствующим лечения раз (здесь: 20 сек, 40 s, 60 s плазмы и 60 s газового контроля) и хорошо позиции, и готовы многоканальные пипетки и резервуаров для жидкого обработки 96-луночных пластин в последующих анализов.

2. анализ основных реактивных компонентов в плазме лечение жидкости

  1. Анализ обработанных плазмы пероксида водорода
    1. Лечить 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS) с плазмой в трех экземплярах с плоским дном 96-луночных пластины.
    2. Подготовка мастер смесь путем загрузки 100 мкл PBS с 10 U пероксидаза и 5 мкм реагента обнаружения перекиси водорода (достаточно для одного хорошо; масштабирование соответственно).
    3. Мкл 95 мастер смеси для каждой скважины.
      Примечание: Предыдущий шаг следует выполнять под чистой скамейке или в комнате отдельно от плазменного источника как окружающего воздуха озона может уменьшить чувствительность assay.
    4. В отдельную тарелку Подготовьте серию два раза разрежения перекиси водорода в PBS с верхней концентрации 100 мкм в 100 мкл PBS.
    5. Мкл 5 образцов или перекисью водорода стандартов для скважин, содержащие обнаружения реагента.
    6. Включать скважин, содержащие реагент обнаружения только для вычитание фона после считывания.
    7. Инкубируйте пластину в темноте за 15 мин при комнатной температуре.
    8. Место пластину в Считыватель микропланшетов измерения флуоресценции в λex 535 Нм и λет 590 нм.
      Примечание: Если ожидается, что высокие концентрации перекиси в образцах, разбавления образца должна быть увеличена или чтения должны быть сделано с короче время инкубации, чтобы избежать насыщения assay.
    9. Вычитание пустых значений из всех образцов, вычислить перекиси калибровочной кривой и количественно неизвестный образец перекиси концентрации от этой базовой кривой.
  2. Анализ нитрит плазмы лечение
    1. Лечить 100 мкл PBS с плазмой в трех экземплярах обладает 96well пластины.
    2. Подготовка мастер смесь раствора нитрита обнаружения, добавив 1 мкл Реагента количественная оценка 99 мкл doubledistilled воды (достаточно для одного хорошо; масштабирование соответственно).
    3. Добавьте 100 мкл на хорошо ясно, обладает 96well плиту. Масштабирование для числа скважин.
    4. Подготовьте серию разрежения нитрита стандартов в doubledistilled воде.
    5. Добавьте 10 мкл стандартов или образцов в мастер смесь в 96well пластины.
    6. Инкубируйте пластину в темноте за 10 мин при комнатной температуре.
    7. Добавьте 5 мкл раствора нитрита количественной разработчик в каждой скважине.
    8. Читать флуоресценции в Считыватель микропланшетов λex 365 Нм и λет 450 Нм.
    9. Вычитание пустых значений из всех образцов, вычислить нитрита калибровочной кривой и количественного определения концентрации нитрита неизвестный образец из этой базовой кривой.
  3. Анализ плазмы лечение супероксид
    1. Сделать мастер смесь окисленных Тситохром (1 мг/мл) и каталазы (20 мкг/мл) в PBS.
    2. Добавьте 100 мкл мастер смеси к добрам плиты 96-ну ясно, с плоским дном.
    3. Лечить мастер смесь с плазмой в трех экземплярах на лечение условие.
    4. Читайте поглощения на 550 Нм, используя Считыватель микропланшетов; граф данных.
    5. Рассчитайте количество супероксида с помощью коэффициент молярной вымирания цитохрома C и длина пути света жидкости в скважину.

3 биологической реакции клеток подвергается плазмы

  1. Многомерные считывания клеток плазмы лечение: метаболической активности
    1. Использование Ламинарный шкаф для всех следующих процедур.
    2. Семян 104 клетки (мышиных меланомы В16) в 100 мкл полностью дополняют клетки культуры среднего за хорошо в 96-луночных пластины с плоским дном.
    3. Разрешать клеточной адгезии на ночь при 37 ° C в увлажненные атмосфере инкубатора с 5% углекислого газа.
    4. Используя таблицу xyz, лечить скважин с плазмы или газ только по заранее схеме и добавьте клетки обратно в инкубатор для 20 h.
      Примечание: При желании снять supernatants после 20 h анализировать внеклеточных продуктов; потом добавьте 100 мкл свежей среды.
    5. Для каждой скважины добавьте 25 мкл среды культуры клеток, содержащих 500 мкм резазурина (конечная концентрация 100 мкм); подготовка трех скважин, содержащие резазурина только в среде культуры клеток без клетки для вычитание фона.
    6. Инкубируйте 3 h в инкубаторе.
    7. Читать флуоресценции в λex 535 Нм иет 590 нм λ в Считыватель микропланшетов.
    8. Вычитание фона флуоресценции от всех образцов и нормализации данных для значений элементов управления.
  2. Многомерные считывания клеток плазмы лечение: анализ изображений
    1. Использование хорошо пластина из 3.1.7 и удалить супернатант.
    2. 100 мкл свежие клетки питательной среды, содержащие 1 мкг/мл пропидий йодидом.
    3. Положите пластину под микроскопом с моторизованного столика для изображения каждой скважины.
      Примечание: Изображения детали зависят от экспериментальных вопрос; Здесь 20 X цель был использован в высоким содержанием тепловизионных устройств для чтения полей зрения 3 x 3 в каждую лунку в светлые области канала, цифровой фазе контраст канал и флуоресценции (пропидий йодидом) канал, используя соответствующие возбуждения свет и выбросов фильтры.
    4. Программное обеспечение для анализа использования количественных изображения для определения общей цитозольной области цифровой фазе контрастность изображения всех полей зрения отображаемого в каждой скважине.
      Примечание: Проанализируйте дальнейшие параметры по желанию, например, количество жизнеспособных и/или мертвые клетки или митохондриальной активности с использованием выделенных пятна. При использовании других пятен, чем описано в этой работе, убедитесь, что пятна флуоресценции для микроскопии спектрально не пересекаются с флуорохромов, используется в последующих поток цитометрии экспериментов.
    5. Граф данных и при желании, тест для корреляции с значения, полученные для метаболической активности.
  3. Многомерные считывания клеток плазмы лечение: проточная цитометрия
    1. Для этого анализа используйте хорошо пластину из шага 3.2.5.
    2. Отменить супернатант и мыть дважды с 200 мкл PBS, содержащих кальций и магний (0,9 мм и 0,5 мм, соответственно).
      Примечание: Исправить или разрушения клеток для дальнейшего биологических показаний, не охваченные в этот вклад, как окрашивание внутриклеточных антиген или клеточного цикла анализа на данном этапе.
    3. Для каждой скважины добавьте 50 мкл PBS с кальция и магния, содержащих 50 нг/мл calreticulin анти мыши моноклональные антитела.
    4. Инкубируйте 15 мин в инкубаторе.
    5. Мыть дважды с 200 мкл полностью дополняют клетки культуры среднего и отбросить жидкости в пластине.
    6. 100 мкл клеток отряд решения для каждой скважины и проинкубируйте втечение 20 мин в инкубаторе.
    7. Используйте другой набор неокрашенных B16 клеток в суспензии для настройки потока гранулярных приобретение протокол, стробирование стратегии и прибыли и напряжений фотоприемников.
    8. Загрузите пластину в проточный цитометр оснащены Автоматический пробоотборник для 96-луночных планшетов.
    9. Приобрести не менее 1000 ячеек в вперед и стороны точечной населения обычно ассоциируется с жизнеспособных клеток.
    10. Использование программного обеспечения, предназначенные для анализа проточной цитометрии, .fcs файлы для ворот населения интерес и определить интенсивность средняя флуоресценции calreticulin.
    11. Граф данных и при желании, тест для корреляции с значения, полученные для метаболической активности, изображений и/или окислителя осаждения.

Representative Results

В этом исследовании Оптимизированный рабочий процесс был описан для медицинских исследований в отношении последствий плазмы. Многодисциплинарный подход, используемых здесь анализирует основные оптические выбросов профиль плазменной струи, основных реактивных компонентов в жидкости, и биологической реакции клеток лечение с плазмой (рис. 1).

Для проведения этого процесса, ряд компонентов необходимо правильно настроить источник плазмы (рис. 2). Различные газы (здесь главным образом аргона, кислорода и азота) были переданы и контролируется несколькими регуляторами массового расхода. Центральная панель был использован для цифровой регулировки массы потока контроллеров, чтобы заранее корма газовых потоков. Приносить конкретные подачи газа композиции, газы были физически смешанного использования группы клапанов, которые объединены газов из нескольких контроллеров потока массы (рисA). Источник плазмы был включен, и плазмы сточных вод была создана перед USB-спектрофотометр (рис. 2B) с оптического диапазона 200 Нм до 1000 Нм. Для лечения жидкости и клетки эффективный рабочий процесс был описан с помощью 96-луночных пластины. Несколько хорошо блюда были проведены на месте с помощью пластиковая рама, который был установлен на основной плите с вставками, соответствует его отпечаток отверстия (рис. 2C). Вся установка была помещена под Ламинарный шкаф (Рисунок 2D). Эта установка включена xyz таблицы, для которой был установлен ручной кусок плазменной струи. Элементы управления двигателем могут быть расположены за пределами скамейке, если последний имеет достаточно большой кабель портов от и к таблице xyz. Важно отметить, что таблица была контролируемой компьютером и может быть запрограммирован для наведите центр каждой скважины с микронной точностью струи для нужное количество времени. Кроме того в исходное положение (как в нашей установки, хорошо A1) был выбран свободно (2 рисунокE). Вместе с владельцем пластиковой пластиной это позволило воспроизводимый плазменной обработки с любыми вариациями изо дня в день, исключительно связанные с установки жидкого и биологических экспериментов.

Оптическая эмиссионная спектроскопия (ОЕЛП) был использован для следовать отдельных пиков, связан с реактивной плазмы компоненты в условиях различных подачи газа (рис. 3А). Например, второй положительный системе азота с вершины от 330 Нм до 380 Нм представляет химически активные разновидности азота и пик на 309 Нм представлены гидроксильными радикалами (стрелка на рисунке 3A). Прирост по сравнению с только газ аргон, присутствие азота смесь азота в подачи газа, в то время как добавление кислорода или влажность уменьшается или сократить его, соответственно. Напротив присутствие гидроксильных радикалов был снизилась с кислорода или азота, но заметно увеличена, если увлажненные аргон был использован в качестве подачи газа. Для плазменной обработки жидкостей, испарения, вызванных газ аргон и плазмы аргона был определен первый (рис. 3B). Важно отметить, что оба условия не дали аналогичные результаты потому что плазмы также оказывает влияние на температуру. С учетом OES результаты гидроксильных радикалов перекись водорода осаждения значительно сократилось с примесью кислорода или азота но увеличилось с увлажненной подачи газа (рис. 3C). Кроме того добавление азота подачи газа привело к значительно выше концентрации нитритов, по сравнению с Аргон плазмы лечение жидкости (рис. 3D). Этот рабочий процесс может также использоваться для исследовать влияние плазмы на жидкости с разными составами. Например концентрации пероксида водорода, как представляется, быть независимыми от присутствия плода телячьей сыворотки в среде культуры клеток PBS и RPMI1640 (рис. 3E). В том же образцах присутствие сыворотки снижение концентрации нитритов в PBS и клеточной культуры среднего по сравнению с их коллегами-содержащих-сыворотка (рис. 3F). Большинство супероксид производился в условиях сухой Аргон газ с кислородом и/или азота примесями, значительно закалки супероксид поколение, за исключением увлажненные аргон кислородной плазмы (рис. 3G).

Для плазменной обработки клеток в нескольких хорошо блюда пластины, содержащие клетки посеян накануне был удален из инкубатора и добавляется пластиковый держатель. Был применен шаблон запланированных лечения, испарения получила компенсацию, и пластину был помещен обратно в инкубатор для 20 х. Обратите внимание, что после инкубации, supernatants культуры клеток может были собраны в новую, пустую тарелку 96-луночных и хранятся на- 80 ° C для оценки протеинов интереса. Далее резазурина был добавлен к клеткам каждой скважины. Оборот не флуоресцентные резазурина для люминесцентных resorufin только при содействии активность NADPH-генерации ферментов и был связан с общей метаболической активности (рис. 4A). Интенсивностью флюоресценции были похожи на визуальное восприятие пластину и указал цитотоксических эффектов длительной плазменной обработки (рис. 4B). Увлажненные газа условия являются более вредными, чем сухой газ условий. Же клетки в плите были использованы для дальнейшего течению анализов. Клетки в плите были микроскопически расследование (рис. 4C). С помощью изображений программное обеспечение, были рассмотрены несколько скважин пластины для качественного сравнения (рис. 4D). Программное обеспечение позволило количественная оценка общей площади охватываемых ячеек в пределах полей зрения, приобретенных в каждой скважине и полученные данные были нормализованы в соответствующие элементы управления (Рисунок 4E). Снижение общей ячейки области был замечен в образцах плазмы лечения, особенно с условиями увлажненные подачи газа. После съемки, клетки были промывают, окрашенных с анти мыши calreticulin антител, отдельностоящий и проанализированы с проточной цитометрии (Рисунок 4F). Означать флуоресценции интенсивностей calreticulin окрашивание в жизнеспособных клеток (рис. 4G) были рассчитаны и сравнении между выборками (рис. 4H). Плазменная обработка индуцированной upregulation calreticulin на мышиных меланома клеток поверхности, которая соответствует время лечения плазмы, применяется с корма газодинамических условий. Для увлажняется условия подачи газа, 20 s и 40 s лечения индуцированных сильнее calreticulin воздействия по сравнению с более смертоносными 60 s время лечения. Это предполагает, что существует нелинейная регулирование воздействия calreticulin отношении количество оксидантов, введены в клетки.

Figure 1
Рисунок 1 : Рабочий процесс медицинских исследований плазмы от физики в биологии. Реактивных видов выход струи плазмы аргона атмосферного давления настраивается путем регулирования подачи газа. Отдельных молекул в газовой фазе плазмы контролируются с помощью спектроскопии. Плазма используется для лечения жидкостей и исследовать окислителя осаждения. Клетки культивировали в планшет плазмы лечение, и биологические надписи выполняются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Установка скамейке исследования плазмы. (A) различных газов в нержавеющей стали трубы вбиваемыми несколькими регуляторами массового расхода, которые контролируются через центральную панель. Отдельные корма газовый состав смешивается, затем с помощью панели клапанов. (B) некоторые реактивных компонентов плазмы может контролироваться с помощью оптической эмиссионной спектроскопии исследовать различия между различными композициями подачи газа. (C) для исследования плазмы высокой пропускной способности, используются 96-луночных планшетов. Чтобы константа, отправной точкой для программируемых и автоматизированных Плазменная обработка, пластину добавляется к рамке, гарантирующих же абсолютное положение пластины изо дня в день. (D) плазменной струи крепится к компьютерным управлением xyz таблицы, расположенной под Ламинарный шкаф. Все 96 точные местоположения и времени плазмы на каждый хорошо записывается в файл программы для руководства движения плазмы источника. Главный корпус аппарат плазменной струи, а также управления двигателем расположены в непосредственной близости. (E) автоматической плазменной обработки 96-луночных плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Плазменной струи и жидкости анализа. (A) показано Оптическая эмиссионная спектроскопия условий различных подачи газа. Второй позитивный система азота (330 Нм до 380 Нм) был увеличен с примесью азота, отсутствует в случае примеси кислорода и заметно сократилось с увлажненной аргон (левой панели). Пик гидроксильных радикалов в 309 Нм (стрелка) снизился в условиях азота и кислорода, но заметно увеличилась с увлажненной аргон, по сравнению с аргоном только. (B) газ, воздействие жидкости приводит к испарения. Количество испарения за хорошо в 96well плите после лечения с плазмы и Аргон газ только определяется весом пластины до и после лечения с использованием штраф масштаба. Испарение в plasmatreated образцах выше по сравнению с в gastreated образцах аргона. (C) поколение перекиси водорода в plasmatreated жидкости, связаны в определенной степени с 309 Нм пик гидроксильных радикалов в (A). Увлажненные плазмы аргона (5%) увеличилась перекиси концентрации около 4fold. (D) нитрита возведен когда азота был добавлен для подачи газа, и этот эффект был увеличен с увлажненной аргон плазмы. Добавление кислорода снизилась поколения нитрит, но не значительно. (E, F) Водорода пероксида и нитритов концентрации показано в различных видов жидкостей, а именно RPMI1640 клеток питательной среды с (R10F) и без (R0F) а также PBS с и без плода телячьей сыворотки (FCS). Перекись уровни не отличается между различными средствами массовой информации (E) тогда как нитрит уровнях были значительно снизилась в присутствии сыворотки. (G) супероксид производства был высоким для сухой аргоном подачи газа; примесь азота, кислорода, или увлажненные аргона дал ниже супероксид осаждения в жидкости. Данные (B-G) являются mean + SEM двух-трех экспериментов. Статистический анализ выполненных (C, D) используют односторонний дисперсионный анализ сравнения средства всей группы условий сухой или влажный подачи газа против соответствующего элемента управления (** p < 0.01; *** p < 0,001). Кроме того, Аргон газ только плазмы условия были по сравнению с использованием всей группы среднее и t тест (### p < 0,001). Далее статистический анализ (F) была выполнена с использованием t тесты, сравнения значений каждого плазменной обработки и среднего состояния в образцах с FCS и без FCS (* p < 0,05; ** p < 0.01); Кроме того, FCS или содержащие решения-FCS сравнивали сроки лечения каждого плазмы, используя t теста (# p < 0,05; ## p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Лечение плазмы и ее влияние на клетки. (A) клетки подвергаются плазмы и резазурина был добавлен после 20 h для оценки метаболической активности. (B) деятельность значительно уменьшилось в plasmatreated образцах, по сравнению с газ-контроля. Заметное снижение был замечен с увлажнением подачи газа, тогда как добавление кислорода или азота приводит к токсичности в обоих условиях сухой и влажный Аргон газ. (C) среде, содержащей пропидий йодидом (PI) был добавлен. (D) Обзор показано скважин пластины с цифровой фазового контраста (оранжевый), представляющие цитозольной фракции каждой ячейки и PI (зеленый) для идентификации мертвых клеток. Imaging инструменты позволили количественной оценки общей области в поле зрения каждого хорошо покрыта клеток. (F) клетки были впоследствии промывают и инкубировали с антителами или другие ячейки маркеры для характеристики биологических плазменные эффекты с помощью проточной цитометрии. (G) Gating стратегии были использованы и маркер анализа была выполнена и сравнении между выборками. Данные (B, E, H) обозначают mean + SEM одного представителя от трех независимых экспериментов. Шкалы бар = 200 мкм (D). Статистическое сравнение проводилось с использованием двусторонний анализ разницы (B, H), сравнение, для каждого газа условия, каждый плазменной обработки для его управления соответствующих газов (* p < 0,05; ** p < 0.01; *** p < 0,001). Кроме того, значения для каждого условия азота и кислорода примесей были по сравнению с значения плазмы газ аргон для сухих и влажных условиях отдельно (двусторонний анализ разницы; ### p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Фундаментальные исследования имеет основополагающее значение для понимания эффективности и механизмы, лежащие в основе плазмы медицины в доклинических и клинических исследований. Фундаментальные исследования также способствует расследование новых приложений для лечения. Хотя хорошо известно, что плазм посредником их биологические эффекты через поколение активных форм кислорода и азота видов19, есть еще три основные задачи в поле. Во-первых какие виды важны? Это может частично ответил, модулируя корма газовый состав плазмы с оптической диагностики и биологических отсчетов. 20 во-вторых, какие последствия можно увидеть в биологических объектов, например клетки? Это по крайней мере частично, рассматриваются с помощью экспериментов культуры клеток и количество анализов. В эукариотических клетках эффекты плейотропный включая клеточный цикл арест21, апоптоз22, некроз23и кожи клетки стимуляции24,25,26, а также поддержки или уменьшить ячейки подвижность или метаболической активности27,,2829. Третья проблема, связанные с этими Плейотропный эффект, является определить ключевые молекулы, которые определяют клеточный ответ оксидантов плазмы производные объяснить различные эффекты, часто встречается в различных типов клеток. Это может быть сделано омику методы30,,3132 и/или вверх или Даунрегуляция целевых генов, с помощью малых интерферирующих РНК (редокс) сигнализации ингибиторы, антиоксидантов и антиоксидантных ферментов, а также модуляции Plasma реактивных видов производства. 33 , 34 , 35 таким образом, обтекаемый пробирного протоколы необходимы для проверки больших комплектов образцов с большим числом итераций.

Это исследование является примером эффективного экспериментального рабочего процесса, от физики, биологии, плазмы медицинских исследований в отношении вышеуказанных проблем. Подробная информация о инженерные аспекты источник плазмы и плазмы поколения было описано ранее. 36 , 37 , 38 все эти анализы выполняются в 96well пластины, которые имеет ряд преимуществ. Например образцы таких supernatants культуры клеток можно легко переносить из пробирного в коллекции пластины для расследования, например, концентрации белка через фермента---assay иммуносорбента. Если доступен научного оборудования, способного чтения непосредственно из скважин-96, такой подход минимизирует расходы на образцы и handsontime и увеличивает результаты, мультиплексирование различных анализов из той же пробы. Использование многоканальные пипетки дополнительно ускоряет обработку образца. В принципе пробирного, описанные здесь может также осуществляться с использованием форматов также пластины с больших диаметров хорошо, хотя это потребует дополнительных шагов дозирования в другие трубы и судов для вниз по течению анализов. Меньшие пластины типов, таких как 384well пластин, однако, не представляют геометрии для биомедицинских плазмы исследований с использованием самолетов с большой подачи газа потоков. В частности не может быть гарантировано, что только один, но не рядом скважин страдают во время лечения.

Анализ жидкости имеет важное значение для расследования видов осаждения в плазме. В экспертных анализов параллельной установки различных анализов можно характеризовать plasmatreated жидкости в отношении различных окислителей в то же время. Этот мультиплексирования позволяет разрабатывать дифференцированные картину plasmaderived видов. Описанный подход весьма чувствителен к расследованию концентрации пероксида водорода39, который часто является необходимым, но не всегда достаточно, чтобы объяснить плазменные эффекты. 40 , 41 , 42 биологически соответствующих эффектов может также оцениваться в жидкости с глутатион assay, здесь не включены. 43 конкретные нитрита assay настоятельно рекомендуется над обычными Griess-анализов из-за 10fold выше анализа чувствительности (данные не показаны). Plasmatreated жидкости также могут расследоваться для формирования хлорноватистая кислота с помощью DTNB-Assay. Тем не менее результаты предыдущего не указывают формирования этого вида с нашими источник плазмы. 19 , 39 , 44 после завершения лечения плазмы, видов ухудшения проходит со временем. Нитриты реагирует нитрата; Кроме того пероксид потребляется с течением времени. Однако эти процессы занять несколько часов. 35 c тситохрома поглощения является стабильным в течение нескольких часов также. Поэтому если после лечения в течение первых 30 мин происходят процессы, изменения концентраций долгоживущих видов, описанные здесь являются незначительными. Однако необходимо проявлять осторожность, когда расследование некоторых видов средств массовой информации (например, Дульбекко изменение средних орла) как ингредиенты можно очистить вверх до 90% перекись водорода в течение 1 ч (данные не показаны) ведет к недооценке плазмы пероксида осаждения в жидкости.

Мультиплекс пробирного представлен которых колеблется от расследования метаболической активности клеток площади (морфология) клеток поверхности маркер выражения. Сочетание этих анализов может выявить интересные результаты. Например мы ранее показали в THP1 моноцитов, что метаболической активности и клеток обвинения не уменьшается в линейной моде, после воздействия плазмы. А 45 , с увеличением времени лечения плазмы, клетки были замечены, были увеличены в размерах и был выше митохондриальной массы, привело к повышению метаболических ставок на percell основе. По существу комбинация многодисковое читатель, микроскопии и проточной цитометрии мультиплексов информацию о клеточных реакций после плазменной обработки. В клетки меланомы мы здесь сосредоточена на цитотоксических эффектов и их иммуногенности опосредовано calreticulin. 46 в принципе, многие другие вопросы могут быть решены с этим подходом, связывание метаболической активности с цитометрии результаты томографии и потока. К примеру дифференцировки клеток (например , поляризация макрофагов), митохондриальных мембранного потенциала, анализ клеточного цикла, подвижности клеток, биомеханики или микроядро формирование для анализа генотоксичности также могут быть исследованы в лечить плазмы клетки. Многоцветная проточной цитометрии позволяет ещё больше приложений в различных клеточных популяций в то же время. Это включает, например, дан анализ состояния фосфорилирование сигнализации белки такие факторы транскрипции, мРНК количественной оценки, измерения внутриклеточных цитокинов, и/или оценки общего снижения тиолы на уровне одной ячейки. Биологически соответствующую дополнительную информацию, которая доступна для каждого образца СПИДа в дальнейшем развитии картина плазмы редокс эффекты лучше понять плазмы текущих и будущих приложений.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Финансирование от немецкого федерального министерства образования и научных исследований (BMBF предоставлять номера 03Z22DN11 и 03Z22DN12) с благодарностью.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11, (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3, (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45, (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82, (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4, (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11, (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18, (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19, (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59, (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29, (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29, (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167, (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7, (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8, (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3, (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40, (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12, (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3, (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112, (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49, (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3, (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38, (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26, (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3, (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13, (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1, (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25, (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47, (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46, (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13, (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49, (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48, (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100, (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6, (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3, (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10, (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13, (1), 54-61 (2007).
Фундаментальные исследования в медицине плазмы - пропускная способность подход от жидкости для клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter