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Cancer Research

应用肺转移法研究骨肉瘤转移性肺定植的实用思考

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56332

Summary

本文的目的是为肺转移试验 (美洲狮) 的协议提供详细的描述。该模型允许研究人员使用 widefield 荧光或共聚焦激光扫描显微镜研究肺组织中的转移性骨肉瘤 (OS) 细胞生长。

Abstract

肺转移试验 (彪马) 是一种体外肺外植体和封闭细胞培养系统, 允许研究人员通过荧光显微镜研究骨肉瘤 (OS) 的肺定植生物学. 本文详细描述了该协议, 并讨论了使用 widefield 或共聚焦荧光显微镜平台获取转移生长图像数据的示例。美洲狮模型的灵活性使研究人员不仅可以研究在肺部微环境中的 OS 细胞的生长, 而且还可以评估随着时间推移抗转移治疗的效果。共焦显微镜允许前所未有的高分辨率成像的 OS 细胞相互作用的肺实质。此外, 当美洲狮模型与荧光染料或荧光蛋白基因记者相结合时, 研究人员可以对转移的 OS 细胞的肺微环境、细胞和亚型结构、基因功能和启动子活动进行分析。美洲狮模型提供了一个新的工具, 骨肉瘤研究人员发现新的转移生物学和评估活动的新型抗转移, 靶向治疗。

Introduction

改善儿童转移性骨肉瘤 (OS) 患者的预后仍然是一个关键的未满足的临床需要1。这突出了发展新的分子靶向治疗的重要性。常规化疗靶向肿瘤细胞增殖没有证明是有效的治疗转移性疾病, 因此, 新的战略必须针对转移过程本身2。本文讨论了一种相对较新型的体外肺转移模型、门多萨和同事 3开发的肺转移试验 (彪马) 的实际应用, 为发现新的操作系统中肺转移进展的分子驱动程序4,5。然而, 在继续之前, 应该谨慎地简单地接触几种目前的转移模型, 以及美洲狮模型如何比传统的体外检测提供了一些优势。

大多数用于研究转移的实验模型包括体外体内系统, 它概括了转移级联的特定步骤或几个步骤。这些步骤包括: 1) 肿瘤细胞从原发肿瘤转移到附近的血管 (血液或淋巴) 和转运内的中转, 3) 在第二部位的拘捕, 4) 在次生部位的渗出和存活, 5) 形成淋巴结和 6) 成长为血管化转移 (图 1)。体外模型的转移可以包括2维 (2D) 迁移和3维 (3D) 胶入侵检测, 并在其他地方详细审查6。对于体内模型, 两种常用的模型系统包括: 1)自发性转移模型是将肿瘤细胞原位注射到特定组织类型中, 形成局部肿瘤, 自发地脱落转移细胞。到遥远的地点;2)实验性转移模型是将肿瘤细胞注入靶器官上游血管的地方。例如, 肿瘤细胞的尾静脉注射导致发展肺转移瘤5,7,8。其他实验性转移模型包括将肿瘤细胞注入脾脏或肠系膜静脉, 导致肝转移的发展9,10。韦尔奇11详细讨论了这些体内模型的实际注意事项。另一个用于研究小儿肉瘤转移的体内模型是肾肾包膜下肿瘤植入模型, 它导致局部肿瘤形成和自发转移到肺部12, 13.更技术上苛刻的技术, 如活体 videomicroscopy 可以直接可视化, 实时, 转移癌细胞与转移部位 (即肺或肝脏) 的微血管的相互作用, 如麦克唐纳14和 Entenberg15, 或胚膜中的癌细胞渗出, 如 Kim 16所述。

美洲狮模型是一个前体,肺组织外植体, 封闭培养系统, 其中荧光肿瘤细胞的生长可以通过荧光显微镜在一个月内纵向观察 (见图 2A)。该模型概括肺定植的初始阶段 (步骤3至 5) 在转移级联。美洲狮模型优于传统的体外模型的一些主要优势是: 1) 它提供了一个机会, 纵向测量转移癌细胞生长在3D 微环境中, 保留许多特点的肺部微环境在体内 3;2) 美洲狮允许研究人员评估在3D 肺微环境下, 候选基因或药物治疗的击倒是否具有抗转移活性;3) 美洲狮模型具有多种类型的荧光显微平台 (图 2B) 的灵活性, 如 widefield 荧光显微镜或激光扫描共焦显微术, 其中的示例显示在图 2C & D中,分别.本文将讨论如何使用美洲狮模型获得的纵向成像数据的转移生长的增强绿色荧光蛋白 (eGFP) 表达, 人高和低转移性骨肉瘤细胞 (MNNG 和居屋细胞, 分别) 使用低放大 widefield 荧光。用共聚焦激光扫描显微镜对美洲狮模型中的线粒体进行标记的荧光染料的成像实例, 并对其进行了研究。

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Protocol

获得影像数据的所有动物协议均经国家卫生研究院国家癌症研究所动物护理和使用委员会批准。在文章视频中讨论和描述的所有动物协议都已被英属哥伦比亚大学动物保育委员会批准。

1. 注射用肿瘤细胞和美洲狮模型材料的制备

注意: 对于1鼠标, 解决方案和单元格的数量将足够。如果在研究中使用更多的小鼠, 就需要扩大。对于媒体食谱, 请参阅表 1表 2

  1. 在 37 oC 水浴中, 在15毫升锥形管中预热5毫升的 a 介质。
  2. 使用实验室微波熔融1.2% 低熔点琼脂糖溶液 (在无菌水中)。
  3. 将5毫升的熔融琼脂糖转化为15毫升锥形管, 并在 37 oC 水浴中保持温暖。确保融化的琼脂糖是在 37 oC 和液体之前, 肺喷洒步骤。
  4. 预冷30毫升细胞培养级 PBS 补充与1X 笔/链球菌在一个冰桶。
  5. 在6井板的一个井中, 预浸泡1.5 毫升 B 介质中的明胶海绵。海绵将是肺切片的支撑锚。
  6. 确保操作系统单元格在过程的当天大约70-90% 汇合。不要使用过度汇合的细胞, 或者如果媒体是橙色到黄色, 因为细胞通常被强调并且在这一点上降低了生存能力。对于骨肉瘤细胞系, MNNG 和居屋, 5 x 105在一卷 100 ul 将被用来注入到尾部静脉的1鼠标。因此, 如果更多的老鼠被用于研究, 那么高档。
  7. 用0.25% 胰蛋白酶-EDTA (3 毫升的 T75 烧瓶或2毫升的10厘米培养皿) 收割肿瘤细胞。当细胞开始从盘子中抬起时, 用完全的培养基中和胰蛋白酶-EDTA。旋转细胞和冲洗一次与细胞培养级 PBS。并用重悬颗粒在5毫升的 PBS。
  8. 按标准方法执行单元格计数。最好是做更多的细胞悬浮比实际需要的, 因为细胞悬浮脱落往往发生在针的绘制和失败的注射尝试。
  9. 对细胞悬浮的样品进行台盼蓝排斥试验, 以评估细胞的生存能力。仅当单元格显示90% 的生存能力或更高时才进行。
  10. 在 100 ul 的卷中注入 5 x 105单元格。要准备超过2X 的这一量, 1 x 106细胞应该被旋转下来, 并悬浮在0.2 毫升的 HBSS 中。
  11. 在准备注射的小鼠时, 将细胞悬浮在冰桶中。

2. 尾静脉注射和肺喷洒

注意: 本节中的解决方案和单元格的数量将足够1鼠标。如果在研究中使用更多的小鼠, 就需要扩大。有关以下步骤中使用的设备、材料和外科工具的列表, 请参阅表 3表 4

  1. 温暖一只雌性老鼠 (年龄6-8 星期) 在热化灯之下为5分钟为了使他们的尾巴静脉更加明显地明显。对于小鼠 K7M2 或 K12 细胞, 使用 Balb/c 鼠;对于人类 MG63.3、MG63、MNNG 和居屋细胞, 使用严重的联合免疫缺陷小鼠。
  2. 通过轻轻摇动管子, 确保细胞悬浮均匀。小心地将细胞悬浮在没有针头的1毫升注射器中。用27口径针把注射器盖上。确保针锥与针上的音量标记在同一侧。
  3. 将鼠标放在抑制剂中, 用酒精擦拭拭尾。
  4. 进行尾静脉注射, 并注射 100 ul 的细胞悬浮。注射后5分钟, 将鼠标放置在 CO2室中, 并开始安乐死标准操作程序 (如您的机构动物护理委员会的大纲)。颈椎脱位不应作为安乐死的手段, 因为手术会损害气管。
  5. 一旦老鼠被安乐死, 开始准备的层流罩为喷洒的小鼠肺与琼脂糖/A 介质溶液。在层流罩内, 设置一个工作区与您的消毒垫。在这个垫子上, 你将放置你的消毒仪器, iv 导管, iv 延伸集, 和重力灌注装置 (参见补充图 1)。
  6. 把鼠标放在背 recumbancy。用无菌小剪刀, 仔细解剖出胸骨, 露出胸腔。注意不要刺穿肺部, 因为琼脂糖/A 介质溶液将被用来 insufflate 肺。
  7. 解剖胸骨时, 解剖过胸口两侧的气管。通过解剖周围的软组织来暴露气管。
  8. 用20口径静脉注射导管 Cannulate 气管。用无菌线缝合在空心气管周围的外科结。
  9. 将 IV 延伸集从插管气管连接到重力灌注装置的10毫升注射器。
  10. 将预热后的 37 oC 琼脂糖 (5 毫升) 和 a 介质 (5 毫升) 组合成1:1 混合物。将液体琼脂糖/A 介质溶液倒入重力灌注装置的10毫升注射器中。在喷洒肺前用琼脂糖/a 介质溶液, 确保延长集的整个长度已被琼脂糖/a 介质, 从而否定无意喷洒肺标本与空气。
  11. 填充肺琼脂糖/A 介质溶液, 直到肺完全 insufflated。
  12. 一旦肺完全 insufflated, 取出套管并牢固地栓在手术结上, 防止 agarase/A 介质溶液通过气管渗漏。
  13. 从胸腔切开 (气管、心脏和肺部)。注意不要刺穿或损坏肺部的表面。
  14. 将采摘 (在没有特定方向) 在预冷30毫升的 PBS 补充与1X 笔/链球菌, 并允许琼脂糖/A 介质固化20分钟。
  15. 使用细剪刀和镊子, 切割小块的肺 (3 毫米 x 1.5 毫米), 如图 1A所示。更小的肺切片可以很容易地成像使用2.5X 目标。每个实验条件下可以切割多个切片, 每个组通常为4-10 切片。
    注: 对于每个实验组, 将肺切片放入一个单独的井 (6 井板) 中, 其中含有 2 x 2 厘米的明胶海绵, 预浸泡在 B 介质中。每个井的介质数量应该是1.5 毫升。每2-3 天更换一次媒体。对于药物研究, 改变媒介/药物的频率是用户确定的。

3. 肺切片的 Widefield 荧光成像及分析

注: 对于 widefield 荧光成像, 更小的切片被切割 (3 毫米 x 1.5 毫米 x 1 毫米), 以适合肺部分成1图像使用2.5X 的目标。

widefield 荧光显微镜上的图像采集:

  1. 肺部切片通常在注射后0、3、7和14天进行成像。在生物橱柜的无菌环境中, 小心地将肺切片从明胶海绵转移到无菌的35毫米玻璃底圆碟。注意从肺部切片中抹去多余的液体, 因为多余的液体会作为镜子, 反射来自肿瘤细胞的荧光光。
  2. 图 1A中描述的类似方式排列肺切片。每一列将代表不同的实验条件。小心不要用镊子把肺部弄脏。在处理另一实验组的肺切片前, 用70% 乙醇冲洗并干燥。
  3. 优化成像参数 (即增益, 偏移, 曝光时间, binning), 提供最佳对比的荧光肿瘤细胞和背景肺组织在控制 (车辆未经治疗) 组。使用控制组中的相同参数对实验组进行图像处理。另存为 tiff 图像格式。
  4. 对于刻度引用, 请在同一目标上以千分尺的数字图像。
  5. 随着时间的推移, 肺部自动荧光的变化, 成像参数必须调整到控制肺部每一个成像会话。一个会话的成像参数不一定是后续映像会话的最佳选择。

图像分析:
注意: 下面的图像处理步骤是使用 ImageJ 1.51h 软件包17完成的。

  1. 在 ImageJ 中打开图像文件 (图 3A)。
  2. 减去背景: 过程 > 减去背景 > 滚动球半径 (从50像素开始), 取消选中 "浅色背景" (图 3B)。
  3. 将图像转换为8位格式: 图像 > 类型 > 8 位 (图 3C)。
  4. 将单位设置为像素: 图像 > 在长度单位中输入 "像素", 在 "像素宽度"、"像素高度"、"体素深度" 中输入1。选中 "全局" 框可应用于后续图像。
  5. 使用多边形选择工具, 勾勒出整个肺切片的形状, 并确定总肺切片的面积 (像素2)。这个值将用于计算肺的肿瘤负担百分比。
  6. 阈值图像: 图像 > 调整 > 阈值 > 突出显示 "默认" 和 "B & W" > 使用滑块阈值的图像, 使大多数肿瘤细胞被准确地强调。按下 "应用" 将导致黑色和白色的图像, 其中肺全是黑色的, 荧光损伤是白色的 (图 3D)。第二次按下 "应用" 将反转所有荧光结构现在为黑色形状的图像 (图 3E)。
  7. 病变数量和形状的量化:
    分析 > 设置测量 > 检查 "区域"。取消选中所有其他框。
    分析粒子 > 大小 (像素2): 0-无穷大表示 ImageJ 将枚举的形状范围。经验主义地确定最小的病变, 被认为是一个单一的肿瘤细胞在0天的车辆图像。使用此单个肿瘤细胞的面积作为数据集中剩余图像的下限。对于本文所介绍的工作, 11 像素2设置为下限。对于视频示例中显示的工作, 24 像素2设置为下限。将 "循环" 范围保留为0-1。"显示" 可以设置为 "无"。或者, 如果选择了 "显示" 和 "轮廓", 则会生成所有轮廓形状的绘图。检查 "显示结果" 以单独的测量窗口弹出。如果选中 "添加到管理器" 复选框, 则会将所有量化的形状保存到 ROI 管理器中, 这可以保存以供将来参考。按 OK 后, 将弹出一个 "结果" 窗口, 其中包含所有枚举的形状和区域度量 (图 3F)。
  8. 将数据从 "结果" 窗口复制并粘贴到电子表格中。使用 Excel 中的 sum 数学函数对该特定肺切片的转移病灶的所有区域求和。目的: 评价肺切片肺肿瘤负荷的百分比, 将转移性病变面积与肺切片总面积的总和分开。此参数也称为区域分数 (a), 由安德伍德18进一步描述。
    肺肿瘤负担 = 转移病灶面积总和/肺切片总面积
  9. 计算对照组和其余组肺部分的肺肿瘤负担。绘制每组 0, 3, 7 和14天的平均肺肿瘤负担。代表 widefield 荧光图片的高和低转移人 OS 细胞生长在美洲狮模型在渐进时间点显示 (图 4A)。显示的折线图显示的褶皱变化 (规范化到0天) 在转移肿瘤负担的百分比随着时间的推移, 表明 (图 4B)。

4. 美洲狮模型的共焦荧光成像

注意: 对于共焦成像, 组织处理类似于前一节, 除了更大的肺切片被切割 (完整的横断面, 1-2 毫米厚), 以允许更多的 ROIs 被成像。

DAR4M 肺实质标签:

  1. 浸泡肺部切片在10μμM 的 DAR4M (在 HBSS) 45 分钟37摄氏度。DAR4M 在肺细胞内标记活性氮种类。
  2. 45分钟的孵化后, 用新鲜的 HBSS 冲洗肺部切片。
  3. 将肺切片放置在35毫米的玻璃杯底圆碟上, 并在共焦显微镜上进行图像处理。
  4. 图 5中显示的示例图像的图像参数列在表 5中。
  5. 为感兴趣的区域获取 Z 堆栈。使用建议的 Z 切片厚度进行采样。影片 1补充影片 1中提供了一个显示 DAR4M-labeled 肺组织中绿色荧光 OS 单元格的3D 堆栈的代表性影片。

对于图 5中显示的共焦图像示例, 成像会话是终端。如果需要纵向成像, 则建议使用2光子或多光子设备的共聚焦 LSM 显微镜进行成像, 因为活组织的光损伤少了 19, 20.
在美洲狮模型中表达 MG63 细胞的 RFP:

  1. 在步骤1和2中使用 MG63 细胞表达美图-RFP 结构, 执行美洲狮协议作为大纲。
  2. 将肺切片放置在35毫米的玻璃杯底圆碟上, 并在共焦显微镜上进行图像处理。
  3. 图 6中显示的示例图像的图像参数列在表 6中。影片 2补充影片 2中提供了一个具有红色荧光线粒体的绿色荧光 OS 单元格的3D 堆栈的代表性影片。

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Representative Results

低放大 widefield 荧光显微术

对于美洲狮肺切片的 widefield 荧光显微镜, 有代表性的图像和量化数据显示在图 2C中,图 4AB。转移倾向为高和低转移的细胞线在视觉上是明显的在进步时间点。MNNG 细胞可以有效地对肺组织进行殖民, 而居屋细胞根本不能生长。从图像分析中, 可以获得量化数据以评估时间的增长, 如图 4B图所示。为了在一个图像中捕获整个肺切片, 在低放大倍数 (2.5X) 的情况下进行采集是可取的。这种方法允许批量成像大量的美洲狮切片。

高放大共焦荧光显微术

对于美洲狮肺切片的共焦显微术, 有代表性的图像显示在图 5中。在图 5A中可以看到单独的 eGFP 表达 MG63 细胞与肺实质有关, 这是由图 5B中的 DAR4M 荧光染料标记的。合并后的图像显示在图 5C中, 并且容器中荧光肿瘤细胞的放大图像显示在 图 5D中。图 5C和5D 的3D 电影分别显示在影片 1补充影片 1中。在图 6中显示了像线粒体这样的亚细胞结构的共焦成像。胞浆 eGFP 表达式允许在图 6A中显示肿瘤细胞, 而标记为 RFP 的线粒体在图 6B中。在图 6C中会看到合并的图像。3D 电影图 6C显示在电影 2补充电影 2。成像亚细胞结构, 如线粒体可以结合其他荧光标签, 以研究细胞生物学在转移的 OS 单元。添加更多标签时, 请确保激光线和发射过滤器与感兴趣的特定荧光/荧光蛋白兼容。避免成像显影/荧光蛋白的激发和发射光谱紧密重叠。

Figure 1
图 1: 演示转移级联的图示。转移级联可以分解为几个速率限制步骤.(1) 转移性肿瘤细胞离开原发肿瘤部位, 侵入局部软组织;(2) 肿瘤细胞 intravasating 入血液/淋巴管, 并在循环内转运;(3) 在次生部位进行肿瘤细胞骤停;(4) 肿瘤细胞从微血管中渗出, 并在次生部位存活;(5) 成长为淋巴结;(6) 生长成带血管的显性转移瘤。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 使用 widefield 荧光和共聚焦荧光显微镜平台对美洲狮肺切片进行成像.(a) 美洲狮切片的例子显示在玻璃底部的35毫米菜。(B) 共焦显微镜设备。(C) 使用 eGFP 表达式 OS 单元格的彪马切片的低放大图像示例。比例条 = 0.5 毫米 (D) 美洲狮切片分区域的共焦图像示例。比例条 = 100 微米。(*)肺实质被标记红色由 DAR4M (参见插入) 和 (∇) 指向 eGFP 表达 MG63 细胞。比例条 = 30 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.使用 ImageJ 处理美洲狮切片的低放大图像.(A) 原始的美洲狮形象。(B) 背景的减法。(C) 转换为8位图像。(D) 对图像进行阈值化, 以突出荧光肿瘤细胞。(E) 图像反转。(F) 离散形状的计数和形状区域的量化。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.低放大序列图像显示, 随着时间的推移, 美洲狮模型中高和低转移人 OS 细胞的生长.(A) 在注射后0、3、7和14天显示高度转移 MNNG 细胞和低转移性居屋细胞的序列图像。MNNG 细胞能够在肺部微环境中生长得更好, 与居屋细胞形成对比。比例条 = 1 毫米 (B) 随着时间推移, MNNG 和居屋细胞转移的肿瘤负担百分比的变化显示为折线图。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: DAR4M-labeled 美洲狮肺切片的共焦显微术.用 DAR4M 标记的美洲狮肺组织中 eGFP 表达 MG63 细胞的代表共焦图像。(A) 显示 eGFP 表达 MG63 细胞的绿色通道 (∇)。(B) 显示 DAR4M 染料对肺实质细胞活性氮种类有约束力的红色通道。染料突出了肺实质 (#) 和类似血管的结构 (*)。美洲狮肺部分的边缘被表示 ()。(C) 合并的绿色和红色图像。比例条 = 100 微米。(D) 图像的虚线白色盒 (从 C) 显示一个肿瘤细胞在血管。比例条 = 50 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 美洲狮模型中骨肉瘤细胞线粒体的共聚焦显微术.eGFP 表达 MG63 细胞中线粒体的一个代表性的共焦图像。(A) 显示 eGFP 表达 MG63 细胞的绿色通道 (∇)。(B) 显示对线粒体进行本地化的 RFP (*) 的红色通道。(C) 合并的绿色和红色图像。比例条 = 10 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

文化媒体 食谱
完整的媒体 (500mL) •440毫升 DMEM
•50毫升
•5毫升10X 笔/链球菌溶液 (10000 u/毫升)
•5毫升 l-谷氨酰胺 (200 毫米)
多媒体 (250mL) •177.58 毫升无菌水
•50 mL 10X M-199 介质
•15毫升7.5% 碳酸氢钠溶液
•2.25 毫升50毫米 hydrocortizone
•125毫升 0.4mg/毫升视黄醇乙酸 (在无菌水中)
•5毫升10X 笔/链球菌溶液 (10000 u/毫升)
•50毫升10毫克/毫升牛胰岛素
B-媒体 (500ml) •427.6 毫升无菌水
•50 mL 10X M-199 介质
•15毫升7.5% 碳酸氢钠溶液
•2.25 毫升50毫米 hydrocortizone
•125毫升 0.4mg/毫升视黄醇乙酸 (在无菌水中)
•5毫升10X 笔/链球菌溶液 (10000 u/毫升)
•50毫升10毫克/毫升牛胰岛素

表1。完整媒体、媒体、B 媒体的食谱。美洲狮检测的细胞培养和培养基食谱列出。

细胞培养试剂 描述 目录号 公司
MNNG-居屋 高度转移的 OS 细胞线 CRL-1547 atcc
居屋 不良转移的 OS 细胞线 CRL-1543 atcc
MG63。3 高度转移的 OS 细胞线 N/A 艾美. 勒布朗实验室
MG63 不良转移的 OS 细胞线 CRL-1427 atcc
10X M199 媒体 介质和 B 介质的基本介质 11825015 Thermofisher
蒸馏水 (灭菌) 媒体 & 的组成部分 15230-147 Thermofisher
B-媒体
7.5% 碳酸氢钠溶液 媒体 & 的组成部分 25080094 Thermofisher
B-媒体
Hydrocortizone 媒体 & 的组成部分 H6909 西格玛-Alrich
B-媒体
醋酸视黄醇-水可溶性 媒体 & B 媒体的组成部分 R0635-5MG 西格玛-Alrich
青霉素/链霉素10X 浓缩 (10000 U/毫升) 溶液 媒体 & 的组成部分 15140122 Thermofisher
B 媒体, 完整的媒体
牛胰岛素溶液 (10 毫克/毫升) 媒体 & 的组成部分 I0516-5ML 西格玛-Alrich
B-媒体
DMEM, 高葡萄糖 完整介质的基本介质 11965092 Thermofisher
l-谷氨酰胺 (200 毫米) 完整介质组件 25030081 Thermofisher
胎牛血清 完整介质组件 16000044 Thermofisher
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 用于细胞培养 14190144 Thermofisher
汉克的缓冲盐溶液, 没有钙, 没有镁, 没有苯酚红色 用于注射前并用重悬细胞颗粒 14175095 Thermofisher
胰蛋白酶-EDTA (0.25%), 苯酚红色 用于细胞培养 25200114 Thermofisher
DAR4M 用于标记肺实质 ALX-620-069-M001 恩佐

表2。介质、B 介质和完整介质的细胞培养试剂。用于媒体食谱、试剂和缓冲区的组件列出了目录号和公司名称。

材料 描述 目录号 公司
蔡司710共聚焦 LSM 直立 LSM 共焦显微镜 N/A 卡尔·蔡
蔡司780共聚焦 LSM 倒置 LSM 共焦显微镜 N/A 卡尔·蔡
小鼠 点头.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, 女性, 年龄6-8 周 N/A 查尔斯河
明胶海绵 用于肺组织切片的支持 59-9863 哈佛仪器
SeaPlaque 琼脂糖 在肺喷洒中使用 50100 龙沙
1毫升注射器与27口径针 用于尾静脉注射 Fisherscientific
14-826-87
10毫升注射器 用于肺的喷洒 309604 bd
20口径导管 在肺喷洒中使用 SR-OX2032CA 泰尔茂
雅培 IV 引伸套 (30 ", 无菌) 在肺喷洒中使用 8342 Medisca
酒精拭子 注射前擦拭尾静脉 326895 bd
无菌手术手套 小鼠肺 Asceptic 递 随大小而变化 Fisherscientific
30 cm 标尺 用于肺的喷洒 主食
标尺支撑架 用于肺的喷洒 HS29022A Pipette.com
35毫米玻璃底培养皿 用于肺切片成像 81158 Ibidi
防水防潮屏障吸水 Underpads 用于排在生物罩中的无菌工作区 56617-014 vwr
线平可吸收缝线 用来栓住空心气管 N/A 布朗

表3。美洲狮的材料。美洲狮协议所需的材料列有目录号和公司名称。

材料 描述 目录号 公司
显微解剖剪刀 3.5 "直锐/锐 用于切割肺切片 RS-5910 Roboz
4英寸 (10 厘米) 长锯齿直额外细腻0.5mm 尖 用于操作/持有肺部分 RS-5132 Roboz
4英寸 (10 厘米) 长锯齿状轻微曲线0.8mm 尖 用于操作/持有肺部分 RS5135 Roboz
拇指敷料钳;锯齿;微妙;4.5 "长度;1.3 mm 尖端宽度 一般解剖 RS-8120 Roboz
拇指敷料钳 4.5 "锯齿状2.2 毫米尖端宽度 一般解剖 RS-8100 Roboz
超细显微解剖剪刀 3.5 "直锐/锐, 20mm 刀片 一般解剖 RS-5880 Roboz
纳普剪刀;直;尖锐钝;27mm. 刀片长度;4 "整体长度 一般解剖 RS-5960 Roboz

表4。美洲狮手术器械。协议中使用的各种不锈钢仪器都列出了目录号和公司名称。

参数 488激光 561激光
目的 蔡司 w n-Achroplan 10 x/0.3 W (DIC) M27
电源 2% 2%
像素驻留 1.61 1.61
平均 0 0
缩放 1 1
主增益 820 814
数字增益 1 0.51
数字偏移 -4。5 -9.24
针孔 51 57
可调谐滤波器 496-553 570-618

表5。DAR4M-labeled 美洲狮部分共焦成像参数.表中提供了用于在当前纸张中获取共焦图像的特定图像参数。

参数 488激光 561激光
目的 计划-复消色差 63 x/1.40 油 DIC M27
电源 2% 2%
像素驻留 0。6 0。6
平均 2 (线) 2 (线)
缩放 2。3 2。3
主增益 449 390
数字增益 1 1.23
数字偏移 0 0
针孔 136 136
可调谐滤波器 493-550 566-703

表6。美洲狮部分线粒体 MG63 细胞共焦成像参数.表中提供了用于在当前纸张中获取共焦图像的特定图像参数。

补充图 1: 重力灌注仪。重力灌注仪用于 insufflate 肺与液体琼脂糖/a 介质溶液在 20 cm H20 静水压压力。琼脂糖/A 介质溶液被倒入10毫升注射器, 这是由 IV 延伸集附加到空心气管 (未显示)。请单击此处下载此图.

Movie 1
影片 1: 在 DAR4M-labeled 美洲狮肺切片中 eGFP 表达 OS 细胞的3D 共焦 z 堆栈图像的旋转.DAR4M (红通道) 用于突出肺实质和 eGFP 表达 MG63 细胞也可以看到 (绿色通道)。比例条 = 100 微米。请单击此处下载此移动.

Movie 2
影片 2: 在彪马模型中 eGFP 表达 OS 单元格的 RFP 标记的线粒体的3D 共聚焦 z 堆栈图像的旋转.在美洲狮模型中, eGFP 表达 MG63 细胞 (绿色通道) 时, 用 RFP (红色通道) 标记了亚细胞细胞器, 如线粒体。比例条 = 10 微米。请单击此处下载此移动.

Movie 1
补充影片 1: 放大3D 影片的转移 OS 细胞在一个容器中的肺.eGFP 表达的 MG63 细胞在肺微环境中的血管中显示。比例条 = 30 微米。请单击此处下载此移动.

Movie 2
补充影片 2: 放大3D 的线粒体在肺部转移的 OS 细胞的电影.用 RFP 标记的线粒体在肺微环境中的 MG63 细胞中显示。比例条 = 5 微米。请单击此处下载此移动.

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Discussion

以下技术文章描述了美洲狮模型在研究 OS 中肺定植的一些实用方面。在《议定书》中, 研究人员应格外注意的一些关键步骤包括以下几个方面:

a) 气管插管。气管在解剖周围的肌肉和结缔组织时容易受损。此外, 导管针可以很容易地通过气管。在插入套管时要密切注意针的斜角如何进入气管。

b) 刺穿或损害肺部的表面。肺可以很容易刺穿或损坏的解剖剪刀, 而删除胸骨和暴露胸腔。解剖取出胸腔的拔牙时要小心。穿刺或损害肺部的表面会导致液体琼脂糖/A 介质泄漏, 肺部会被充气。

c) 在成像时删除肺部部分的多余介质.在显微镜下观察到肺部部分周围的过量液体介质会引起 "镜面" 效应。过量的液体可以反射来自肿瘤细胞的荧光光, 从而夸大图像中的荧光区域。去除多余的介质流体将会阻止图像中的此伪影。或者, 图像工件可以在图像的后期处理过程中被删除。

d) 光损伤的生物组织。当使用1光子显微镜的水银灯泡或激光器时, 一定要限制暴露在光线下的时间。光源的强度/功率百分比也可以降低。过度暴露于光源可能导致光损伤肺组织。配备发光二极管 (LED) 或2光子/多光子显微镜的显微镜是理想的, 因为它们在纵向成像研究中产生的光损伤较少。

美洲狮模型可以适应和修改, 以研究许多方面的肺部殖民化过程。此体方法的另一个变体由 van Bijgaart 和同事21描述。在研究基因击倒或抗转移药物活性对肺肿瘤细胞生长的影响时, 建议从 5 x 105到 3 x 105中插入的单元格数, 因为可以屏蔽干预效果在大细胞 innoculum 的指数生长过程中。一些研究已经使用美洲狮模型研究肺转移进展的驱动程序4,5,8,22,23,24。各种荧光指示器染料或荧光报告基因可以用来标记肿瘤细胞, 以确定肺微环境中细胞生理学或基因表达8的变化。

美洲狮模型的一个局限性包括有限数量的兼容细胞系。与此检测兼容的已建立单元格线由门多萨和同事3列出。对于高、低转移性骨肉瘤细胞系, 无性相关细胞系的跟随对在美洲狮模型中生长并维持其转移倾向: 人 MG63.3 & MG63 细胞、MNNG & 143B、居屋细胞、小鼠 K7M2 和 K12细胞.研究人员必须通过经验主义的判断他们的细胞系是否能在 B 型介质中保持存活。另一个需要考虑的限制是肺组织可以保持体外的有限的时间长度。肺组织可以保留它的细胞成分30天, 在那以后, 并且肺的细胞组分开始死。因此, 研究肿瘤细胞与肺基质细胞之间的相互作用不应超过30天。

美洲狮模型提供了一种前所未有的方法来研究转移的 OS 细胞如何殖民肺组织。美洲狮模型最引人注目的方面来自以下事实: 几个低转移的 OS 细胞线 (居屋, MG63, K12), 其在体内表型在其他地方的特点25, 不能生长在美洲狮模型。相比之下, 无性相关的高度转移性 OS 细胞 (MNNG、MG63.3、K7M2) 更倾向于将肺组织体内25和美洲狮模型殖民。这表明, 尽管缺乏血液流动, 但在体内, 防止低转移的 OS 细胞株的肺微环境的细胞和细胞外成分在生长的过程中仍然保持在美洲狮模型中。换言之, 美洲狮模型的肺微环境仍然施加 "选择压力", 防止低转移的 OS 细胞在肺中生长。事实上, 研究高转移性的 OS 细胞生长在美洲狮是有用的, 以确定新的分子驱动因素转移的表型4,5。此外, 在高度转移的细胞中, 对上述靶点的遗传降调可以减少美洲狮模型和体内5的转移能力。对于候选的抗转移药物研究, 美洲狮模型可以用来确定哪些浓度范围可以减少肺组织中的转移性生长, 进而可以验证在体内

该模型的未来应用应利用过量的商业可用的荧光染料和报告基因, 以深入研究的基础生物学的 OS 转移进展。例如, 2 '、7 '-dichlorofluorescin 双乙酸或 dihydroethidium 等荧光染料可以用来评估美洲狮模型中肿瘤细胞的氧化还原状态。荧光报告基因可以用来研究细胞生物学或评估启动者活动, 以确定哪些信号通路在高度转移的 OS 细胞在殖民过程中激活。这种方法可以用来可视化药物治疗是否有活动的肿瘤细胞在肺部生长。荧光显微镜平台, 产生较少的光损伤组织, 如 LED 设备显微镜或2光子/多光子共聚焦显微镜, 可用于研究如何转移的 OS 细胞迁移和侵入整个肺组织。此外, 肿瘤细胞与肺基质细胞之间的黏附相互作用可以通过荧光报告基因进行监测。

总结一下, 本文讨论了美洲狮模型的实用方面, 首先由门多萨和同事3开发。以低放大、widefield 荧光显微镜和高分辨率共焦显微镜为例, 评估高、低转移人 OS 细胞的生长情况。已经说明了议定书的几个关键步骤。此外, 还讨论了美洲狮模型的优点和局限性。本文提出了美洲狮模型在研究肺定植过程中的应用, 希望该模型能在骨肉瘤研究界得到更广泛的应用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢 Arnulfo 门多萨博士, 他提供了美洲狮技术的训练。 此外, 我们还要承认 Drs. 卡拉姆·昌德·沃赫拉肯纳, 苏珊. 加菲尔德 (NIH) 和 Sam 加亚尔多·阿帕里西奥 (BC 癌症机构) 在本研究过程中提供他们的显微镜使用。这项研究是支持 (部分) 由国家卫生研究院的内部研究计划, 癌症研究中心, 儿科肿瘤科。M.M.L. 得到美国国立卫生研究院 (15335 奖) 的支持, 目前在转移研究中得到了琼帕克奖学金的支持。P.H.S. 得到不列颠哥伦比亚省癌症基金会的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS ATCC CRL-1547 highly metastatic OS cell line
HOS ATCC CRL-1543 poorly metastatic OS cell line
MG63.3 Amy LeBlanc Laboratory (NCI) N/A highly metastatic OS cell line
MG63 ATCC CRL-1427 poorly metastatic OS cell line
10X M199 media Thermofisher 11825015 Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized) Thermofisher 15230-147 Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution Thermofisher 25080094 Component of A-media & B-media
Hydrocortizone Sigma-Alrich H6909 Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable Sigma-Alrich R0635-5MG Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution Thermofisher 15140122 Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml) Sigma-Alrich I0516-5ML Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose Thermofisher 11965092 Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM) Thermofisher 25030081 Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum Thermofisher 16000044 Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Thermofisher 14190144 Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermofisher 14175095 Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermofisher 25200114 Used in cell culture.
DAR4M Enzo ALX-620-069-M001 Used to label lung parenchyma.
Name Company Catalog Number Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM Zeiss N/A Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM Zeiss N/A Inverted LSM confocal microscope
SCID mice Charles River N/A NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam Harvard Apparatus 59-9863 Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose Lonza 50100 Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle Fisherscientific 14-826-87 Used for tail vein injection.
10 ml syringe BD 309604 Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter Terumo SR-OX2032CA Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile) Medisca 8342 Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs BD 326895 For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves Fisherscientific Varies with size Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler Staples Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler Pipette.com HS29022A Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish Ibidi 81158 Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56617-014 Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture Braun N/A Used to tie off cannulated trachea.
Name Company Catalog Number Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp Roboz RS-5910 For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip Roboz RS-5132 For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip Roboz RS5135 For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width Roboz RS-8120 For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz RS-8100 For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade Roboz RS-5880 For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length Roboz RS-5960 For general dissection.

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References

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癌症研究 问题 133 骨肉瘤 肉瘤 转移 显微学
应用肺转移法研究骨肉瘤转移性肺定植的实用思考
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Lizardo, M. M., Sorensen, P. H.More

Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. J. Vis. Exp. (133), e56332, doi:10.3791/56332 (2018).

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