Summary
Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.
Abstract
De pulmonaire metastase assay (PuMA) is een ex vivo Long explant en gesloten celcultuur waarmee onderzoekers om te bestuderen van de biologie van longkanker kolonisatie in Osteosarcoom (OS) door fluorescentie microscopie. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het protocol, en voorbeelden van het verkrijgen van afbeeldingsgegevens op metastatische groei met widefield of confocal fluorescentie microscopie platformen. De flexibiliteit van het model van de PuMA toelaat onderzoekers bestuderen van niet alleen de groei van OS cellen in de longen-communicatie, maar ook voor het beoordelen van de effecten van anti-metastatische therapeutics na verloop van tijd. Confocale microscopie zorgt voor ongekende, high-resolution beeldvorming van OS cel interacties met de Long parenchym. Bovendien, wanneer de PuMA model wordt gecombineerd met fluorescente kleurstoffen of TL proteïne genetische verslaggevers, onderzoekers kunnen bestuderen de Long-communicatie, cellulaire en subcellular structuren, genfunctie en promotor activiteit in uitgezaaide cellen van het OS. De PuMA-model biedt een nieuw hulpmiddel voor Osteosarcoom onderzoekers om te ontdekken van nieuwe metastase biologie en de activiteiten beoordelen van nieuwe anti-gemetastaseerd, gerichte therapieën.
Introduction
Verbeterde resultaten voor pediatrische patiënten met metastatische Osteosarcoom (OS) blijft een kritische unmet klinische behoefte 1. Dit onderstreept het belang van de ontwikkeling van nieuwe moleculair-gerichte therapieën. Conventionele chemotherapeutica dat doel tumor celproliferatie hebben niet bewezen effectief bij de behandeling van uitgezaaide ziekte, en zo nieuwe strategieën moeten richten op het metastatische proces zelf 2. Het huidige artikel behandelt de praktische aspecten van een relatief nieuw soort ex vivo Long metastase model, de pulmonaire metastase assay (PuMA) ontwikkeld door Mendoza en collega's3, waarmee een nuttig instrument in het ontdekken van nieuwe moleculaire bestuurders in Long metastase progressie in OS 4,5. Voordat u verdergaat, echter, zou het verstandig zijn kort ingaan op de verschillende huidige modellen van metastase, en hoe de PuMA model biedt diverse voordelen ten opzichte van conventionele in vitro testen.
Meest experimentele modellen gebruikt bij het bestuderen van metastase bestaan uit in vitro en in vivo systemen die een specifieke handeling of verschillende stappen van de metastatische cascade recapituleren. Deze stappen omvatten: 1) de tumorcellen migreren uit de buurt van de primaire tumor, 2) intravasation in nabijgelegen vaartuigen (bloed- of lymfestelsel) en doorvoer in omloop, 3) arresteren op het secundaire site, de 4) extravasation en de overleving op de secundaire site, 5) vorming micrometastasen, en 6) groei in gevacuoliseerd metastasen (Figuur 1). In vitro modellen van metastase 2-dimensionale (2D) migratie kunnen opnemen en 3-dimensionale (3D) Matrigel invasie testen die zijn herzien in detail elders 6. Voor in vivo modellen, de twee meest gebruikte modelsystemen omvatten: 1) de spontane metastase model is waarbij een tumorcellen orthotopically geïnjecteerd in een specifieke weefseltype te vormen van een lokale tumor die spontaan uitgezaaide cellen werpt naar verre locaties; 2) het experimentele metastase model is waar tumorcellen worden ingespoten in het bloedvat stroomopwaarts van de doel-orgel. Bijvoorbeeld, een staart veneuze injectie van tumor cellen leidt tot de ontwikkeling Long metastasen5,7,8. Andere experimentele metastase modellen zijn injectie van tumorcellen in de milt of lymfklieren ader wat in de ontwikkeling van lever metastasen9,10 resulteert. Praktische overwegingen van deze in vivo modellen worden in detail besproken door Welch 11. Een andere in vivo model gebruikt bij het bestuderen van metastase in pediatrische sarcomen is het renale nier subcapsular tumor implantatie model, wat in de vorming van lokale tumor en spontane metastase voor de longen 12,13 resulteert. Een meer technisch veeleisende techniek zoals intravital videomicroscopy kan direct visualiseren, in real-time, interacties tussen metastatische kankercellen en de microvasculature van een metastatische site (dwz. longen of lever) zoals beschreven door MacDonald14 en Entenberg15, of kanker cel extravasation in het chorion membraan zoals beschreven door Kim, 16.
De PuMA-model is een ex vivo, Long weefsel explant, gesloten cultuur systeem waar de groei van fluorescerende tumorcellen lengterichting waarneembaar via fluorescentie microscopie gedurende een periode van een maand (Zie figuur 2A). Dit model recapituleert de aanvankelijke stadia van longkanker kolonisatie (stappen 3 tot en met 5) in de gemetastaseerde cascade. Enkele belangrijke voordelen van de PuMA model ten opzichte van conventionele in vitro modellen zijn: 1) het biedt een kans om de lengterichting meten metastatische kanker-celgroei in een 3D communicatie die heeft veel kenmerken van de Long communicatie behouden vivo 3; 2) puMA kan de onderzoeker om te beoordelen of het knockdown van een kandidaat-gen of drug behandeling anti-metastatische activiteit in het kader van een 3D Long communicatie heeft; 3) de PuMA model is flexibel met vele soorten fluorescentie microscopie platforms (figuur 2B) zoals widefield fluorescentie microscopie of laser-scanning confocal microscopie, worden voorbeelden van elk weergegeven in figuur 2C & O, respectievelijk. Dit artikel zal bespreken hoe de PuMA model kunt verkrijgen van longitudinale imaging gegevens over de metastatische groei van verbeterde groen fluorescent proteïne (eGFP)-uiten, menselijke hoge en lage metastatische Osteosarcoom cellen (cellen met MNNG en HOS, respectievelijk) met behulp van lage-vergroting widefield fluorescentie. Voorbeelden van imaging een fluorescente kleurstof waarmee de Long parenchym de labels, en een rood-fluorescerende eiwit genetische verslaggever waarmee labels mitochondriën in OS cellen in het model van de PuMA met behulp van confocale laser scanning microscopie worden ook besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen waaruit imaging gegevens werden verkregen werden uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care en gebruik van het Comité van het National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alle dierlijke protocollen besproken en afgebeeld in het artikel video zijn door de University of British Columbia dierlijke zorg Comité goedgekeurd.
1. voorbereiding van tumorcellen injectie en materialen voor het model van PuMA
Opmerking: Het bedrag van oplossingen en cellen worden genoeg voor 1 muis. Schaal omhoog als dit nodig is als er meer muizen worden gebruikt in de studie. Voor media recepten, verwijzen naar de tabel 1 en tabel 2.
- Vooraf warm 5 mL voor A-Media in een conische tube van 15 mL in een waterbad 37 oC.
- Smelt de 1,2% lage smeltende agarose oplossing (in steriel water) met behulp van de lab-magnetron.
- Pipetteer 5 mL van de gesmolten agarose in een conische tube van 15 mL, en houd warm in een waterbad 37 oC. Zorg ervoor de gesmolten agarose op 37 oC en vloeibaar voorafgaand aan de Long toediening stap.
- Vooraf chill 30 mL van celkweek rang PBS aangevuld met 1 X pen/strep in een ijsemmer.
- In een put van een 6-well plaat, week vooraf een spons van de gelatine in 1,5 mL voor B-media. De spons zullen het anker van de steun voor de Long-segmenten.
- Controleer de OS cellen ongeveer 70-90% confluente op de dag van de procedure. Gebruik geen cellen die overmatige heuvels of als de media oranje is naar geel omdat de cellen meestal onderstreept zijn en levensvatbaarheid op dit punt zijn afgenomen. Voor de Osteosarcoom cellijnen, MNNG en HOS, zal 5 x 10,5 in een volume van 100 μl worden gebruikt om te injecteren in de ader van de staart van 1 muis. Upscale dienovereenkomstig indien meer muizen worden gebruikt voor de studie.
- Het oogsten van de tumorcellen met behulp van 0,25% trypsine-EDTA (3 mL voor een T75 kolf of 2 mL in een 10 cm cultuur schotel). Wanneer cellen beginnen te heffen uit de plaat, neutraliseren de trypsine-EDTA met volledige media. Spin down cellen en spoel eenmaal met celkweek rang PBS. Resuspendeer de pellet in 5 mL PBS.
- Het uitvoeren van een telling van de cel door standaardmethoden. Het is het beste te maken van meer celsuspensie dan eigenlijk nodig is aangezien het verlies van celsuspensie vaak optreedt tijdens naald draw-up en mislukte pogingen van de injectie.
- Een Trypan-blauw uitsluiting Assay uit te voeren op een steekproef van de celsuspensie te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen. Ga verder alleen als de cel Toon levensvatbaarheid van 90% of hoger.
- 5 x 105 cellen in een volume van 100 μl injecteren. Ter voorbereiding van een overmaat van 2 X van dit bedrag, 1 x 106 cellen moeten worden gesponnen beneden en geresuspendeerde in 0,2 mL HBSS.
- Plaats celsuspensie in een ijsemmer bij de voorbereiding van de muizen voor injectie.
2. de staart van veneuze injectie en longkanker toediening
Opmerking: Het bedrag van oplossingen en cellen in deze sectie worden genoeg voor 1 muis. Schaal omhoog als dit nodig is als er meer muizen worden gebruikt in de studie. Voor een lijst van de apparatuur, de materialen en de chirurgische instrumenten gebruikt in de volgende stappen, verwijzen naar de tabel 3 en tabel 4.
- Warm een vrouwelijke muis (leeftijd 6-8 weken) onder een lamp verwarming voor 5 min zodat hun staart ader duidelijker herkenbaar. Gebruik voor lymfkliertest K7M2 of K12 cellen, Balb/c muizen; gebruik voor menselijke MG63.3, MG63, MNNG en HOS cellen, strenge gecombineerde immunodeficiency muizen.
- Zorg ervoor dat de celsuspensie is uniform door zachtjes schudden van de buis. Zorgvuldig opstellen van de celsuspensie in de 1 mL spuit zonder de naald. GLB de spuit met een 27 meter naald. Zorg ervoor dat de naald schuine kant aan dezelfde kant als de volume-markeringen op de naald.
- Plaatst u de muisaanwijzer in de afdekking en wisser de staart met een alcohol doekje.
- Ga verder met het uitvoeren van een staart veneuze injectie en injecteren de 100 μl van de celsuspensie. 5 minuten na de injectie, plaatst u de muisaanwijzer in een zaal van CO2 en beginnen de euthanasie standaard gebruiksprocedure (als omtrek door uw Commissie institutionele dierenverzorgers). Cervicale dislocatie moet niet worden gebruikt als een middel van euthanasie, omdat de procedure aan de luchtpijp schade zal.
- Zodra de muis is euthanized, beginnen de voorbereiding van de laminaire flow kap voor toediening van de longen van de muis met de agarose/A-media oplossing. Binnen de laminaire flow kap, opgezet een werkgebied met uw steriele zeem. Op dit pad plaatst u uw gesteriliseerde instrumenten, IV-katheter IV verlengset en zwaartekracht perfusie apparaat (Zie aanvullende figuur 1).
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in de dorsale recumbancy. Met een steriele kleine schaar, zorgvuldig uit het borstbeen naar de borstholte bloot te ontleden. Zorg niet doorprikken van de Long, aangezien een agarose/A-media oplossing zal worden gebruikt om te insufflate van de Long.
- Wanneer de ontrafeling van het borstbeen, ontleden voorbij de thoracale inlaat aan beide zijden de luchtpijp. Bloot in de luchtpijp door het ontleden weg de omliggende weke delen.
- Cannulate van de luchtpijp met een 20 gauge IV-katheter. Losjes legt een chirurgische knoop met steriel catgut hechtdraad rond de gecanuleerde luchtpijp.
- Bevestig een IV extensieset uit de catheterized luchtpijp aan de 10 mL spuit van de zwaartekracht perfusie apparatuur.
- Combineer de voorverwarmde 37 oC agarose (5 mL) en A-media (5 mL) in een 1:1-mengsel. Giet het vloeibare agarose/A-media oplossing in de 10 mL spuit van de zwaartekracht perfusie apparaat. Voorafgaand aan de toediening van de longen met agarose/A-media oplossing, zorgen dat de gehele lengte van de extensieset heeft zijn gevuld met agarose/A-media, waardoor de ontkenning van onbedoelde toediening van monsters van de longen met lucht.
- Vul de Long de agarose/A-media oplossing totdat de Long is volledig insufflated.
- Zodra de Long is volledig insufflated, verwijder de canule en stevig uit de chirurgische knoop om te voorkomen lekkage van de agarase/A-media oplossing via de luchtpijp binden.
- Gaan ontleden uit de plukken (luchtpijp, hart en longen) van de borstholte. Zorg om geen lekke band of het oppervlak van de longen beschadigen.
- Plaats de plukken (in geen bepaalde richting) in het vooraf gekoeld 30 mL PBS aangevuld met 1 X pen/strep, en laat de agarose/A-media te stollen voor 20 min.
- Met behulp van fijn schaar en pincet, snijden van kleine stukjes van de longen (3 x 1.5 mm), zoals aangegeven in figuur 1A. Kleinere segmenten van de longen kunnen gemakkelijk worden beeld met behulp van een 2,5 X doelstelling. Meerdere segmenten kunnen worden gesneden per experimentele voorwaarde, meestal 4-10 plakjes per groep.
Opmerking: Voor elke experimentele groep, plaatst u de segmenten van de Long in een aparte put (6-well-plate) met een 2 x 2 cm gelatine spons vooraf gedrenkt in B-media. De hoeveelheid media per putje wordt 1,5 mL. De media elke 2-3 dagen wijzigen. Voor studies van de drug is de frequentie van het veranderen van de media/drug gebruiker bepaald.
3. Widefield fluorescentie beeldvorming van longkanker segmenten en analyse
Opmerking: Widefield fluorescentie imaging, kleinere segmenten zijn verminderd (3 x 1,5 x 1 mm) om te passen van het gedeelte van de Long in 1 beeld met behulp van een 2,5 X doelstelling.
Beeldacquisitie op een widefield fluorescentie Microscoop:
- Long segmenten zijn typisch beeld op 0, 3, 7 en 14 dagen na injectie. In de steriele omgeving van het biologische kabinet, zorgvuldig overbrengen de Long segmenten van de gelatine sponzen op een steriele 35 mm glas-bodem ronde schotel. Take care schar uit het overtollige vocht uit het lung-segment, zoals het overtollige vocht zal als een spiegel fungeren en TL-licht afkomstig van de tumorcellen weerspiegelen.
- Schik de plakjes van de longen op een vergelijkbare manier afgebeeld in figuur 1A. Elke kolom zou vertegenwoordigen een andere experimentele voorwaarde. Zorg niet cross-besmetten de longen met de pincet. Spoel met 70% ethanol en droog zijn voor de behandeling van longkanker segmenten uit een andere experimentele groep.
- Optimaliseren van de imaging parameters (dwz. winst, offset, blootstelling tijd, weggooien) die zorgt voor het beste contrast tussen de fluorescerende tumorcellen en achtergrond longweefsel in het besturingselement (voertuig onbehandeld) groep. Gebruik dezelfde parameters uit de controlegroep om het imago van de experimentele groepen. Opslaan als TIFF-beeldformaat.
- Neem een digitaal beeld van een micrometer op hetzelfde doel voor een verwijzing naar een schaal.
- Aangezien Long auto-fluorescentie na verloop van tijd verandert, moeten de imaging parameters worden aangepast aan de longen controle elke imaging sessie. De imaging parameters voor één sessie per se mogelijk niet optimaal voor latere imaging sessies.
Beeldanalyse:
Opmerking: De volgende beeld processing stappen zijn gedaan met ImageJ 1,51 h software pakket 17.
- Open een afbeeldingsbestand in ImageJ (figuur 3A).
- Aftrekken van de achtergrond: proces > aftrekken achtergrond > Rolling ball straal (begin met 50 pixels), uncheck "Background Light" (figuur 3B).
- Afbeelding omzetten in 8-bits indeling: afbeelding > Type > 8 - bits (Figuur 3 c).
- Eenheden instellen op pixels: afbeelding > Enter "Pixels" eenheid van lengte, Voer 1 in "pixelbreedte", "Pixel hoogte", "Voxel diepte". Selectievakje "Global" toe te passen op latere beelden.
- Met behulp van het gereedschap Veelhoek, de vorm van de gehele Long-segment en bepalen het gebied (pixel2) van het totale Long-segment. Deze waarde zal worden gebruikt voor de berekening van het percentage tumor last van de longen.
- Drempel afbeelding: afbeelding > aanpassen > drempel > markeren "Default" en "B & W" > gebruik de schuifregelaar drempel de afbeelding zodanig dat de meerderheid van de tumorcellen zijn nauwkeurig aangaf. Druk op "Apply" zal resulteren in een zwart-wit beeld waar de Long is alles zwart en de fluorescerende laesies zijn wit (figuur 3D). Druk op "Apply" een tweede keer zal het omkeren van de afbeelding waar alle fluorescerende structuren nu zwarte vormen (figuur 3E zijn).
- Kwantificering van het aantal en vorm van letsels:
Analyseren > instellen van metingen > controleren "Ruimte". Schakel alle andere selectievakjes.
Analyseren van deeltjes > grootte (pixel2): 0-infinity vertegenwoordigt het vormenbereik dat ImageJ zal opsommen. Empirisch bepalen de kleinste laesie, die wordt geacht een cel één tumor in dag 0 voertuig beelden. Gebruik het gebied van deze cel één tumor als de ondergrens voor de resterende afbeeldingen in de gegevensset. Voor het werk in deze paper gepresenteerd, is 11 pixel2 ingesteld als de ondergrens. Voor het werk gepresenteerd in de video met een voorbeeld, is 24 pixel2 ingesteld als de ondergrens. Laat "Cirkelvormigheid" bereik 0-1. "Toon" kunnen worden ingesteld op "Nothing". U kunt ook als "Show" en "Overzichten" is geselecteerd, wordt een tekening van alle overzicht vormen gegenereerd. Controleren "Display resultaten" voor een afzonderlijk venster van metingen opduiken. Eventueel zal met "Add to manager" doos gecontroleerd alle vormen gekwantificeerd aan een ROI-manager, die kan worden opgeslagen voor toekomstig gebruik opslaan. Na het indrukken van OK, verschijnt een venster "Resultaten" met alle opgesomde vormen en gebied metingen (figuur 3F). - Kopieer en plak de gegevens uit het venster "Resultaten" in een werkblad. De wiskundige som-functie in Microsoft Excel gebruikt voor het optellen van alle gebieden van de metastatische laesies voor dat bepaalde Long-segment. Om te beoordelen de percentage Long tumor last van longkanker segment, de som van de gebieden van metastatische letsels door de totale oppervlakte van het Long-segment te verdelen. Deze parameter is ook bekend als gebied breuk (eenA) die wordt beschreven door Underwood 18.
Long tumor last = som van metastatische laesie gebieden/totaal gebied van longkanker segment - Bereken de Long tumor last voor de rest van de Long-secties in de controlegroep en de resterende groepen. Plot de gemiddelde longen tumor lasten per groep 0, 3, 7 en 14 dagen. Vertegenwoordiger widefield fluorescerende foto's van hoge en lage metastatische menselijke OS cellen groeien in het model van de PuMA op progressieve tijdstippen worden weergegeven (figuur 4A). Een lijngrafiek met de vouw-verandering (op dag 0 genormaliseerd) in percentage uitgezaaide tumor last na verloop van tijd wordt weergegeven (figuur 4B).
4. confocal fluorescentie beeldvorming van het Model van PuMA
Opmerking: Voor confocal imaging, weefsel verwerking is vergelijkbaar met die in de vorige sectie behalve dat grotere Long plakjes worden gesneden (volledige dwarse secties, 1-2 mm dik) zodat meer ROIs naar zijn beeld.
Etikettering van longkanker parenchym met DAR4M:
- Onderdompelen van longkanker sneetjes in 10 μμM DAR4M (in HBSS) gedurende 45 minuten bij 37 ° C. DAR4M etiketten reactieve stikstof soorten binnen de cellen van de longen.
- Na 45 min van incubatie, spoel de segmenten van de longen met frisse HBSS.
- Plaats het Long-segment in een 35 mm glas-bodem ronde schotel, en de afbeelding op de confocal microscoop.
- De imaging parameters voor de voorbeeldafbeeldingen afgebeeld in Figuur 5 staan in tabel 5.
- Verwerven van een Z-stapel voor een gebied van belang. Gebruik de voorgestelde Z segment dikte voor Nyquist bemonstering. Een representatieve film een 3D stapel groene fluorescerende cellen van de OS in het DAR4M-label longweefsel tonen vindt u in de film 1 en aanvullende film 1.
Voor de confocal voorbeeldafbeeldingen afgebeeld in Figuur 5wordt was de imaging sessie terminal. Als longitudinale imaging vereist is, het gebruik van een 2-foton of multi foton uitgeruste confocal LSM Microscoop voor imaging wordt geadviseerd aangezien er minder photodamage voor levende weefsels19,20.
Imaging mito-RFP waarin MG63 cellen in de PuMA-model:
- De PuMA-protocol als overzicht in stap 1 en 2 met cuvetten van MG63 uiting geven aan de constructie van de mito-RFP uitvoeren
- Plaats het Long-segment in een 35 mm glas-bodem ronde schotel, en de afbeelding op de confocal microscoop.
- De imaging parameters voor de beelden van de voorbeeld in Figuur 6 afgebeelde staan in tabel 6. Een representatieve film een 3D stapel groene fluorescerende cellen van het OS met rood fluorescerende mitochondriën wordt geleverd in Movie 2 en aanvullende Movie 2tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Low-vergroting widefield fluorescentie microscopie
Voor widefield fluorescentie microscopie van PuMA Long segmenten, worden representatieve beelden en kwantificering gegevens weergegeven in figuur 2C, en figuur 4A en B. De metastatische neigingen voor hoge en lage metastatische cellijnen zijn visueel herkenbaar over progressieve tijdstippen. MNNG cellen kunnen efficiënt het longweefsel koloniseren overwegende dat HOS cellen helemaal niet groeien. Beeldanalyse, kan kwantitatieve gegevens worden verkregen om te beoordelen van groei na verloop van tijd, zoals wordt weergegeven in de grafiek van figuur 4B. Overname bij lage vergroting (2.5 X) heeft de voorkeur om te vangen van het segment van de gehele Long in één beeld. Deze methode kunnen batch beeldvorming van een groot aantal segmenten van PuMA.
High-vergroting confocal fluorescentie microscopie
Confocale microscopie van PuMA Long segmenten, worden representatieve beelden weergegeven in Figuur 5. Afzonderlijke eGFP-uiten MG63 cellen kunnen worden gezien in figuur 5A ten opzichte van de Long parenchym, die is aangegeven door de DAR4M fluorescerende kleurstof in figuur 5B. Een samengevoegde afbeelding wordt weergegeven in figuur 5C, en een ingezoomd afbeelding van een cel fluorescerende tumor in een vaartuig wordt getoond in figuur 5D. 3D films van figuur 5C en 5 D worden getoond in de film 1 en aanvullende film 1, respectievelijk. Confocale imaging van subcellular structuren zoals de mitochondriën staan in Figuur 6. Cytosolische eGFP-expressie toelaat de omtrek tumorcellen in figuur 6Aen de mitochondriën aangeduid met RFP worden getoond in figuur 6B. Een samengevoegde afbeelding is te zien in Figuur 6 c. 3D films van Figuur 6 c worden getoond in Movie 2 en aanvullende Movie 2. Imaging subcellular structuren zoals de mitochondriën kan worden gecombineerd met andere fluorescerende etiketten organel biologie in metastatische OS cellen te bestuderen. Bij het toevoegen van meer labels, ervoor zorgen dat de laserlijnen en emissie filters verenigbaar met de bijzondere fluorophore/fluorescent proteïne van belang zijn. Vermijd imaging fluorophores/TL eiwitten waarvan excitatie en emissie spectra nauw overlappen.
Figuur 1 : Schematische weergave van de metastatische cascade. De metastatische cascade kan worden onderverdeeld in verschillende, snelheidslimieten stappen. (1) uitgezaaide tumor cellen verlaten van de site van de primaire tumor en binnenvalt in de lokale parenchym; (2) tumor cellen intravasating in bloed/lymfestelsel vaartuigen en doorvoer in het verkeer worden gebracht; (3) tumor cel arrestatie op de secundaire site; (4) tumor cel extravasation uit van de microvasculature en de overleving in de secundaire site; (5) groei in micrometastasen; (6) groei in gevacuoliseerd openlijke gemetastaseerde tumoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Imaging PuMA Long segmenten met behulp van fluorescentie widefield en confocal fluorescentie microscopie platforms. (A) voorbeeld PuMA segmenten staan in een glazen-bodem 35 mm schotel. (B) de confocal microscoop apparatuur. (C) voorbeeld laag-vergroting afbeelding van een segment van de PuMA met eGFP-expressie OS cellen. Scalebar = 0.5 mm. (D) voorbeeld confocal afbeelding van een subregionaal van een PuMA-segment. Scalebar = 100 μm. (*) Long parenchym is het label van rood van DAR4M (zie inzet) en (∇) wijs eGFP-uiten MG63 cellen. Scalebar = 30 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Verwerking van een lage-vergroting beeld van een segment van de PuMA met ImageJ. (A) PuMA origineel. (B) aftrekken van de achtergrond. (C) naar een 8-bits afbeelding wordt geconverteerd. (D) de afbeelding drempelmethode fluorescerende tumorcellen markeren. (E) inversie van afbeelding. (F) opsomming van discrete vormen en kwantificering van de gebieden van de vorm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Low-vergroting seriële afbeeldingen tonen de groei van hoog en laag metastatische menselijke OS cellen in het model van de PuMA mettertijd. (A) seriële beelden van zeer metastatische MNNG cellen en lage metastatische HOS cellen op 0, 3, 7 en 14 dagen na injectie te zien zijn. MNNG cellen kunnen beter in de communicatie van de Long in tegenstelling tot de HOS cellen groeien. Scalebar = 1 mm. (B) Fold-verandering in percentage uitgezaaide tumor lasten voor MNNG en HOS cellen na verloop van tijd worden weergegeven als lijndiagrammen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Confocale microscopie van een DAR4M-geëtiketteerden PuMA Long segment. Een representatieve confocal beeld van eGFP-uiten MG63 cellen in PuMA longweefsel aangeduid met DAR4M. (A) de groene kanaal tonen eGFP-uiten MG63 cellen (∇). (B) de rode kanaal tonen de DAR4M kleurstof binden aan reactieve stikstof soort(en) in Long parenchym cellen. De kleurstof hoogtepunten de Long parenchym (#), en structuren die lijkt op een bloedvat (*). De rand van de PuMA Long sectie is aangeduid (↓). (C) samengevoegde groene en rode afbeelding. Scalebar = 100 μm. (D) een ingezoomde afbeelding van de onderbroken witte doos (vanaf C) toont een cel tumor in een vat. Scalebar = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Confocale microscopie van mitochondriën in Osteosarcoom cellen in het model van de PuMA. Een representatieve confocal beeld van mitochondriën in eGFP-uiten MG63 cellen. (A) de groene kanaal tonen eGFP-uiten MG63 cellen (∇). (B) de rode kanaal tonen de RFP gelokaliseerd op mitochondriën (*). (C) samengevoegde groene en rode afbeelding. Scalebar = 10 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Voedingsbodems | Recept |
| Volledige Media (500mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X Pen/strep oplossing (10000U/mL) | |
| •5 mL L-Glutamine (200 mM) | |
| A-Media (250mL) | •177.58 mL steriel water |
| •50 mL 10 X M-199 media | |
| •15 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing | |
| •2.25 mL 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetaat (in steriel water) | |
| •5 mL 10 X Pen/strep oplossing (10000U/mL) | |
| •50 mL van 10mg/ml boviene insuline | |
| B-media (500ml) | •427.6 mL steriel water |
| •50 mL 10 X M-199 media | |
| •15 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing | |
| •2.25 mL 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetaat (in steriel water) | |
| •5 mL 10 X Pen/strep oplossing (10000U/mL) | |
| •50 mL van 10mg/ml boviene insuline |
Tabel 1. Recepten voor volledige Media, A-media, B-media. Recepten voor celkweek en media voor de PuMA assay staan.
| Cel cultuur reagentia | Beschrijving | Catalogus No. | Bedrijf |
| MNNG-HOS | zeer metastatische OS cellijn | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | slecht metastatische OS cellijn | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | zeer metastatische OS cellijn | N/B | Amy LeBlanc laboratorium (NCI) |
| MG63 | slecht metastatische OS cellijn | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 media | Base media voor A-media en B-media | 11825015 | Thermofisher |
| Gedestilleerd Water (gesteriliseerd) | Onderdeel van A-media & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-media | |||
| 7,5% natriumbicarbonaat oplossing | Onderdeel van A-media & | 25080094 | Thermofisher |
| B-media | |||
| Hydrocortizone | Onderdeel van A-media & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-media | |||
| Retinol acetaat-water slecht | Component A-media & B-media | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Penicilline/streptomycine 10 X geconcentreerd (10000 U/ml) oplossing | Onderdeel van A-media & | 15140122 | Thermofisher |
| B-media, volledige media | |||
| Boviene insuline oplossing (10mg/ml) | Onderdeel van A-media & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-media | |||
| DMEM, hoge glucose | Base media van volledige Media | 11965092 | Thermofisher |
| L-Glutamine (200 mM) | Onderdeel van de volledige Media | 25030081 | Thermofisher |
| Foetale runderserum | Onderdeel van de volledige Media | 16000044 | Thermofisher |
| De Dulbecco met fosfaat gebufferde zoutoplossing | Gebruikt in celkweek | 14190144 | Thermofisher |
| Henks gebufferd zouten oplossing, geen calcium, geen magnesium, geen fenol-rood | Gewend resuspendeer cel pellet vóór injectie | 14175095 | Thermofisher |
| Trypsine-EDTA (0,25%), fenol rood | Gebruikt in celkweek | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Gebruikt voor het label Long parenchym | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabel 2. Cel cultuur reagentia voor A-media, B-media, en media te voltooien. Onderdelen voor media recepten, reagentia, buffers en staan met Catalogus nummer en bedrijf naam.
| Materialen | Beschrijving | Catalogus No. | Bedrijf |
| Zeiss 710 Confocal LSM | Rechtop LSM confocal microscoop | N/B | Zeiss |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Omgekeerde LSM confocal microscoop | N/B | Zeiss |
| SCID muizen | KNIPOOG. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, vrouw, leeftijd 6-8 weken | N/B | Charles River |
| GelFoam | Gebruikt als een ondersteuning voor longkanker weefselsecties | 59-9863 | Harvard toestellen |
| SeaPlaque Agarose | Gebruikt tijdens de toediening van de longen | 50100 | Lonza |
| 1 ml spuit met 27 gauge naald | Gebruikt voor staart-veneuze injectie | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml spuit | Gebruikt voor de toediening van de longen | 309604 | BD |
| 20 gauge katheter | Gebruikt tijdens de toediening van de longen | SR-OX2032CA | Terumo |
| Abbott IV extensie ingesteld (30-inch, steriel) | Gebruikt tijdens de toediening van de longen | 8342 | Medisca |
| Alcohol swabs | Voor het afvegen van staart ader vóór injectie | 326895 | BD |
| Steriele chirurgische handschoenen | Asceptic overhandigen van muis longen | Afhankelijk van de grootte | Fisherscientific |
| 30 cm liniaal | Gebruikt voor de toediening van de longen | Nietjes | |
| Ondersteuning stand voor liniaal | Gebruikt voor de toediening van de longen | HS29022A | Pipette.com |
| 35 mm glassbottom cultuur schotel | Gebruikt tijdens de beeldvorming van longkanker segmenten | 81158 | Ibidi |
| Absorberend Underpads met waterdichte Vochtwerende laag | Gebruikt voor het uitlijnen van de steriele werkgebied in de biologische kap | 56617-014 | VWR |
| Catgut Plain absorbeerbare Sutuur (geologie) | Gebruikt om te binden uit gecanuleerde luchtpijp | N/B | Braun |
Tabel 3. Materialen voor PuMA. Materialen vereist zijn voor het protocol van PuMA staan met Catalogus nummer en bedrijf naam.
| Materialen | Beschrijving | Catalogus No. | Bedrijf |
| 3,5-inch rechte Sharp/Sharp ontrafeling van micro scharen | Voor snijden Long secties | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) lang gekarteld direct Extra gevoelige 0.5mm Tip | Voor manipuleren/bedrijf Long secties | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) lang getande lichte buiging 0.8mm Tip | Voor manipuleren/bedrijf Long secties | RS5135 | Roboz |
| Duim omhoog het kleden van Forceps; Gekarteld; Delicate; 4,5" lengte; 1.3 mm Tip breedte | Voor algemene dissectie | RS-8120 | Roboz |
| Duim omhoog het kleden van Forceps 4.5" gekarteld 2.2 mm Tip breedte | Voor algemene dissectie | RS-8100 | Roboz |
| Extra fijn Micro ontrafeling schaar 3.5" rechte Sharp/Sharp, 20mm mes | Voor algemene dissectie | RS-5880 | Roboz |
| Knapp schaar; Rechte; Sharp-Blunt; 27mm lemmetlengte; 4" totale lengte | Voor algemene dissectie | RS-5960 | Roboz |
Tabel 4. Chirurgische instrumenten voor PuMA. Verschillende RVS instrumenten gebruikt in het protocol staan met Catalogus nummer en bedrijf naam.
| Parameters | 488 laser | 561 laser | |
| doelstelling | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| macht | 2% | 2% | |
| Pixel dwell | 1.61 | 1.61 | |
| Gemiddelde | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Master winst | 820 | 814 | |
| Digitale winst | 1 | 0.51 | |
| Digitaal offset | -4.5 | -9.24 | |
| Pinhole | 51 | 57 | |
| Afstembare Filter | 496-553 | 570-618 | |
Tabel 5. Parameters voor confocal beeldvorming van DAR4M-label PuMA secties. Specifieke afbeelding gehanteerde parameters voor de verkregen van de confocal afbeeldingen in het huidige document vindt u in de tabel.
| Parameters | 488 laser | 561 laser | |
| doelstelling | Plan-Apochromat 63 x / 1.40 olie DIC M27 | ||
| macht | 2% | 2% | |
| Pixel dwell | 0.6 | 0.6 | |
| Gemiddelde | 2 (lijn) | 2 (lijn) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Master winst | 449 | 390 | |
| Digitale winst | 1 | 1.23 | |
| Digitaal offset | 0 | 0 | |
| Pinhole | 136 | 136 | |
| Afstembare Filter | 493-550 | 566-703 | |
Tabel 6. Parameters voor confocal beeldvorming van mitochondriën MG63 cellen in de secties van de PuMA. Specifieke afbeelding gehanteerde parameters voor de verkregen van de confocal afbeeldingen in het huidige document vindt u in de tabel.
Aanvullende figuur 1: Gravity perfusie apparaat. De zwaartekracht perfusie-apparaat wordt gebruikt om de insufflate van de Long met een vloeibare agarose/A-media oplossing op 20 cm van H20 hydrostatische druk. De agarose/A-media oplossing wordt gegoten in de 10 mL spuit, is bevestigd door een IV extensieset aan op de gecanuleerde luchtpijp (niet afgebeeld). Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Film 1: rotatie van het beeld van een 3D confocal z-stack van eGFP-uiten OS cellen in een DAR4M-geëtiketteerden PuMA Long segment. DAR4M (rode kanaal) wordt gebruikt om te wijzen op longkanker parenchym en uiten van eGFP MG63 cellen kunnen ook worden gezien (groene kanaal). Scalebar = 100 μm. Klik hier om te downloaden van deze beweging.
Movie 2: rotatie van het beeld van een 3D confocal z-stack van RFP-geëtiketteerden mitochondriën in eGFP-uiten OS cellen in het model van de PuMA. Subcellular organellen, zoals mitochondriën worden gelabeld met RFP (rode kanaal) in eGFP-uiten MG63 cellen (groene kanaal) van de PuMA-model weergegeven. Scalebar = 10 μm. Klik hier om te downloaden van deze beweging.
Aanvullende film 1: ingezoomde 3D film van een metastatische OS cel in een schip in de Long. Een uiting van eGFP MG63 cel wordt weergegeven in het vaartuig in de Long-communicatie. Scalebar = 30 μM. Klik hier om te downloaden van deze beweging.
Aanvullende Movie 2: ingezoomde 3D film van mitochondriën in een gemetastaseerd OS-cel in de Long. Mitochondriën aangeduid met RFP staan in MG63 cellen in de longen communicatie. Scalebar = 5 μM. Klik hier om te downloaden van deze beweging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het volgende technische artikel beschrijft enkele praktische aspecten van het model van de PuMA in het bestuderen van de Long kolonisatie in OS. Sommige kritische stappen in het protocol waar onderzoekers extra zorg moeten omvatten het volgende:
a) cannulation van de luchtpijp. De luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens het ontleden van de omliggende spier- en bindweefsel. De naald van de katheter kan bovendien eenvoudig worden geduwd door de luchtpijp. Aandacht besteden aan hoe de schuine kant van de naald de luchtpijp treedt bij het invoegen van de canule.
b) prikken of beschadiging van het oppervlak van de longen. De longen kan gemakkelijk worden doorboord of beschadigd met het ontleden van schaar terwijl het verwijderen van het borstbeen en het ontmaskeren van de borstholte. Wees voorzichtig met het ontleden van het plukken van de borstholte. Prikken of beschadiging van het oppervlak van de longen zal leiden tot de vloeibare agarose/A-media uit te lekken en de longen zal worden gedefleerd aan de hand.
c) het verwijderen van overtollige media uit Long secties terwijl imaging. Overtollige vloeibare media rond het gedeelte van de longen kan leiden tot een "spiegel" effect wanneer bekeken onder de Microscoop. De overtollige vloeistof kan reflecteren tl-licht uit de tumorcellen daardoor overdrijven de fluorescentie-gebied in de afbeelding. Verwijdering van overtollige media vloeistof zal dit artefact in de afbeelding voorkomen. Anderzijds kan het artefact afbeelding worden verwijderd tijdens de nabewerking van de beelden.
d) Photodamage voor de levende weefsels. Wanneer u een lamp kwik of lasers van een 1-foton microscoop, moet zeker aan het beperken van de tijd blootgesteld aan het licht. Het percentage van de intensiteit/macht van de lichtbron kan ook worden verminderd. Overmatige blootstelling aan de lichtbron kan photodamage naar het longweefsel. Microscopen uitgerust met light emitting diodes (LED) of 2-foton/multi-photon microscopen zou ideaal zijn omdat ze minder photodamage tijdens longitudinale imaging studies produceren.
De PuMA-model kan worden aangepast en gewijzigd om te bestuderen van vele aspecten van het proces van de kolonisatie van longkanker. Een andere variant van deze aanpak ex vivo wordt beschreven door van den Bijgaart en collega's 21. Voor studies wordt onderzoeken de gevolgen van gene knock-down of anti-metastatische drug activiteit voor celgroei van de tumor in de longen, schaalvergroting terug het aantal cellen geïnjecteerd van 5 x 10,5 tot en met 3 x 10,5 geadviseerd aangezien de gevolgen van de interventie kunnen worden gemaskeerd tijdens de exponentiële groei van een grotere innoculum van de cel. Verschillende studies hebben het PuMA-objectmodel hebt gebruikt om te studeren van bestuurders van longkanker metastatische progressie 4,5,8,22,23,24. Verschillende TL indicator kleurstoffen of fluorescerende reporter genen kunnen worden gebruikt voor label tumorcellen vast te stellen van wijzigingen in cel Fysiologie of gen expressie 8 in de Long-communicatie.
Een beperking van de PuMA-model bevat een beperkt aantal compatibel cellijnen. De gevestigde cellijnen die compatibel is met deze bepaling staan in Mendoza en collega's 3 . Voor hoge en lage metastatische Osteosarcoom cellijnen, de follow-paren van klonaal verwante cellijnen zijn bevonden om te groeien en te handhaven hun metastatische neiging in de PuMA model: menselijke cellen voor MG63.3 & MG63, MNNG & 143 en HOS cellen, lymfkliertest K7M2 en K12 cellen. Onderzoekers moeten empirisch bepalen al dan niet hun cellijnen levensvatbaar in B-media kunnen blijven. Een andere beperking te overwegen is de beperkte duur van die de weefsels van de longen in vitrokunnen worden gehandhaafd. Longweefsel zijn cellulaire componenten kan behouden gedurende 30 dagen, na die tijd en de cellulaire componenten van de longen beginnen te sterven ze af. Dus het bestuderen van de interacties tussen de tumorcellen en longkanker stromale cellen mag niet meer dan 30 dagen.
De PuMA-objectmodel biedt een ongekende manier om te bestuderen hoe metastatische OS cellen koloniseren longweefsel. Het meest opvallende aspect van de PuMA model komt uit het feit dat verschillende lage metastatische OS cellijnen (HOS MG63, K12), waarvan in vivo fenotypen hebben gekenmerkt elders 25, niet groeien in het model van PuMA. Daarentegen hebben klonaal verwante zeer uitgezaaide cellen van de OS (MNNG, MG63.3, K7M2) een grotere neiging tot koloniseren Long weefsel in vivo25 en in de PuMA model. Dit suggereert dat de cellulaire en extracellulaire componenten van de communicatie van de longkanker die voorkomen dat laag metastatische OS cellijnen groeit in vivo, nog steeds worden gehandhaafd in het model van de PuMA ondanks het ontbreken van de bloedstroom. Met andere woorden, oefent de Long-communicatie van de PuMA model nog steeds een "selectiedruk" dat verhindert dat lage metastatische OS cellen groeien in de longen. Inderdaad, studeren hoge metastatische OS cellen groeien in PuMA is nuttig in het identificeren van nieuwe moleculaire bestuurders van de metastatische fenotype 4,5geweest. Bovendien genetische down-modulatie van de genoemde doelen in zeer uitgezaaide cellen werd aangetoond dat het verminderen van metastatische capaciteit in zowel het model van de PuMA en in vivo 5. Voor kandidaat-anti-metastatische drug studies, de PuMA model kan worden gebruikt om te bepalen welk concentratiebereik kan verminderen metastatische uitgroei in weefsels van de longen, die op zijn beurt kan worden gevalideerd in vivo.
Toekomstige toepassingen van dit model moeten gebruikmaken van de overvloed van verkrijgbare fluorescente kleurstoffen en reporter genen om duikt diep in de fundamentele biologie van OS metastase progressie. Bijvoorbeeld kunnen fluorescente kleurstoffen zoals 2', 7' - dichlorofluorescin DIACETAAT of dihydroethidium worden gebruikt om te beoordelen van de redox staat van tumorcellen in de PuMA-model. Fluorescerende reporter genen kunnen worden gebruikt om te studeren organel biologie of promotor activiteiten om te bepalen welke signaalroutes in zeer metastatische OS cellen worden geactiveerd tijdens de kolonisatie beoordelen. Een dergelijke aanpak kunnen worden gebruikt om te visualiseren of een medicamenteuze behandeling heeft activiteit in tumorcellen groeien in de longen. Fluorescent microscopie platformen die minder photodamage aan weefsels, produceren zoals LED-uitgerust microscopen of 2-foton/multiphoton confocal microscopen, inzetbaar bestuderen hoe metastatische OS cellen migreren en binnen te dringen in weefsels van de longen. Hechting interacties tussen tumorcellen en longkanker stromale cellen kunnen bovendien worden bewaakt met fluorescerende reporter genen.
Samenvattend, bespreekt de huidige papier de praktische aspecten van de PuMA model, eerst ontwikkeld door Mendoza en collega's 3. Een voorbeeld van het gebruik van lage-vergroting, widefield fluorescentie microscopie en hoge resolutie confocale microscopie te beoordelen van de groei van hoge en lage metastatische menselijke OS cellen wordt weergegeven. Verschillende kritische stappen van het protocol zijn beschreven. Bovendien, zijn de voordelen en beperkingen van het model van PuMA besproken. Toekomstige toepassingen van de PuMA model te bestuderen van de Long kolonisatie proces naar voren zijn gebracht, en het is te hopen dat dit model een breder gebruik in de onderzoekgemeenschap Osteosarcoom zullen hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Dr. Arnulfo Mendoza die opleiding in de techniek van PuMA. Daarnaast willen we Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), en Sam Aparicio (BC Cancer Agency) erkennen voor het gebruik van hun microscopen verstrekken in de loop van deze studie. Dit onderzoek werd (gedeeltelijk) ondersteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Institutes of Health, Center for Cancer Research, pediatrische oncologie tak. M.M.L. werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid intramurale bezoeken collega-programma (award 15335), en wordt momenteel ondersteund door een Joan Parker Fellowship in metastase onderzoek. P.H.S. wordt ondersteund door British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
