Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Summary

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Abstract

Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.

Introduction

Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf ¹. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst ²ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen³, wonach ein nützliches Werkzeug bei der Entdeckung neuer pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) molekularen Treiber in der Lunge Metastasen Progression in OS ^4,5. Bevor Sie fortfahren, es wäre klug, kurz auf einige aktuelle Modelle von Metastasen zu berühren, und wie das PuMA-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Tests.

Die meisten experimentelle Modellen genutzt, um Metastasen zu untersuchen umfassen in Vitro und in Vivo -Systeme, die entweder einem bestimmten Schritt oder mehrere Stufen der metastatischen Kaskade zu rekapitulieren. Diese Schritte umfassen: (1) die Migration vom Primärtumor, 2) Intravasation in nahe gelegenen Gefäße (Blut- oder Lymphgefäße) und Transitländern im Umlauf, Tumorzellen (3) verhaften am sekundären Standort, 4) Extravasation und Überleben am sekundären Standort, Bildung (5) Fixierungsprotokoll, und 6) Wachstum in vaskularisierte Metastasen (Abbildung 1). In-vitro- Modelle von Metastasen können 2-dimensionale (2D) Migration und 3-dimensionale (3D) Matrigel Invasion Assays, die in überprüft werden ausführlich an anderer Stelle ⁶. Für in-Vivo -Modelle, die zwei häufig verwendete Modellsysteme umfassen: 1) das spontane Metastasierung Modell ist wo ein Tumor-Zellen sind Orthotopically, die in einem bestimmten Gewebetyp einen lokalen Tumor bilden, die spontan metastasierende Zellen wirft injiziert an entfernten Standorten; (2) die experimentelle Metastasierung Modell ist wo Tumorzellen in das Blutgefäß stromaufwärts von dem Zielorgan injiziert werden. Zum Beispiel eine Rute Vene Injektion von Tumor-Zellen-Ergebnisse in der Entwicklung Lunge Metastasen^5,7,8. Andere experimentelle Metastasen-Modelle verfügen über Injektion von Tumorzellen in die Milz oder mesenterialen Vene führt zu die Entwicklung von Lebermetastasen^9,10. Praktische Erwägungen dieser in-Vivo -Modelle werden von Welch ¹¹ausführlich erörtert. Ein weiteres in-Vivo -Modell zur Untersuchung von Metastasen in den pädiatrischen Sarkome ist der Nieren Nieren subkapsuläre Tumor Implantation Modell ergibt sich lokale Tumorbildung und spontane Metastasen in der Lunge ^12,13. Eine technisch anspruchsvolle Technik wie intravitalen Videomicroscopy können direkt sichtbar zu machen, in Echtzeit, Wechselwirkungen zwischen metastatischen Krebszellen und den Microvasculature einer metastatischen Website (dh. Lunge oder Leber) wie beschrieben von MacDonald¹⁴ und Entenberg¹⁵oder Krebs Zelle Extravasation in der chorioallantoic Membrane wie beschrieben durch Kim ¹⁶.

Das PuMA-Modell ist ein ex-Vivo, Lunge Gewebe Explant, geschlossenes Kultursystem wo kann das Wachstum von Tumorzellen fluoreszierende längs über Fluoreszenz-Mikroskopie über einen Zeitraum von einem Monat beobachtet werden (siehe Abb. 2A). Dieses Modell rekapituliert die Anfangsphase der Lunge Kolonisation (Schritte 3-5) in der metastasierten Kaskade. Einige große Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Modellen des Modells PuMA sind: 1) Es bietet die Möglichkeit, metastasiertem Krebs Zelle Wachstum in einem 3D Mikroumgebung längs zu messen, die viele Funktionen der Lunge Mikroumgebung behält Vivo ³; (2) PuMA ermöglicht den Forscher zu beurteilen, ob der Zuschlag einer Kandidaten-gen oder Drogenmissbrauch Behandlung Anti-metastatischen Aktivitäten im Zusammenhang mit einem 3D Lunge Mikroumgebung hat; (3) das PuMA-Modell sind flexibel mit vielen Arten von Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen (Abbildung 2 b) wie Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, Beispiele für jede Abbildung 2 & Dzeigt, bzw.. Dieser Artikel wird erläutert, wie mithilfe der PuMA-Modell um längs Bilddaten auf metastasiertem Wachstum der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) zu erhalten-mit dem Ausdruck, menschliche Ebbe und metastasierendem Osteosarkom Zellen (MNNG und HOS Zellen) mit niedrig-Vergrößerung Weitfeld Fluoreszenz. Beispiele für imaging ein Fluoreszenzfarbstoff, der Lungenparenchyms Etiketten und ein rot-fluoreszierende Protein, die genetische Reporter der Mitochondrien in OS Etiketten im PuMA Modell konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit Zellen werden ebenfalls besprochen.

Protocol

Alle tierischen Protokolle aus denen Bilddaten stammen wurden mit Genehmigung der Animal Care und Use Committee des National Cancer Institute, National Institutes of Health durchgeführt. Alle tierischen Protokolle diskutiert und dargestellt in dem Artikel video wurden von der University of British Columbia Animal Care Ausschuss genehmigt.

1. Vorbereitung der Tumorzellen für Einspritzung und Materialien für das PuMA-Modell

Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Medien-Rezepte finden Sie in Tabelle 1 und Tabelle 2.

1. Wärmen Sie 5 mL A-Media in einem 15 mL konische Rohr in ein Wasserbad 37 ^oC vor.
2. Die 1,2 % niedrig schmelzende Agarose Lösung (in sterilem Wasser) unter Verwendung der Lab-Mikrowelle zu schmelzen.
3. 5 mL flüssige Agarose in ein 15 mL konische Röhrchen zu übertragen, und in einem 37 ^oC Wasserbad warm halten. Sicherstellen Sie, dass die geschmolzene Agarose 37 ^oC und Flüssigkeit vor der Lunge Insufflation Schritt ist.
4. Pre-chill 30 mL der Zellkultur Klasse PBS mit 1 X Pen/Strep in einem Eiskübel ergänzt.
5. Pre-Einweichen Sie in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte einen Gelatine-Schwamm in 1,5 mL B-Medien. Der Schwamm wird der Support für Anker für die Lunge-Scheiben sein.
6. Sicherzustellen, dass die OS-Zellen sind etwa 70-90 % konfluierende am Tag des Verfahrens. Verwenden Sie keine Zellen, die übermäßige Zusammenfluss oder wenn das Medium Orange ist bis gelb, da die Zellen in der Regel betont sind und haben zu diesem Zeitpunkt Lebensfähigkeit vermindert. Für das Osteosarkom-Zell-Linien, MNNG und HOS, wird 5 x 10⁵ in einem Volumen von 100 μl zu injizieren in die Vene Tail 1 Maus verwendet werden. Gehobene entsprechend, wenn mehr Mäuse für die Studie verwendet werden.
7. Ernten Sie die Tumorzellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (3 mL für ein T75-Fläschchen oder 2 mL in einer Kulturschale 10 cm). Wenn Zellen beginnen die Platte abheben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA mit kompletten Medien. Spin-down Zellen und einmal mit Zellkultur Grade PBS abspülen. Aufschwemmen Sie Pellet in 5 mL PBS.
8. Führen Sie eine Zellzahl von Standardmethoden. Es ist am besten, um mehr Zellsuspension als was tatsächlich benötigt wird, da Verlust der Zellsuspension oft während der Nadel erarbeiten tritt und Injektion Versuche scheiterten.
9. Führen Sie einen Trypan blau-Ausschluss-Assay auf einer Stichprobe von der Zellsuspension auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Gehen Sie nur dann, wenn die Zelle 90 % Rentabilität zeigen oder höher.
10. 5 x 10⁵ Zellen in einem Volumen von 100 μl zu injizieren. Um ein Übermaß an 2 X dieses Betrags vorzubereiten, sollte 1 x 10⁶ Zellen nach unten gedreht und Nukleinsäuretablette in 0,2 mL HBSS.
11. Stelle die Zellsuspension in einem Eiskübel während du die Mäuse für die Injektion.

(2) tail Vene Einspritzen und Lunge Insufflation

Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen in diesem Abschnitt werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Eine Liste von Geräten, Materialien und chirurgische Instrumente verwendet, die in den folgenden Schritten finden Sie in Tabelle 3 und Tabelle 4.

1. Wärmen Sie eine weibliche Maus (Alter 6-8 Wochen) unter eine Wärmelampe für 5 min um ihre Rute Vene deutlicher ersichtlich zu machen. Verwenden Sie für murine K7M2 oder K12 Zellen Balb/c Mäuse. Verwenden Sie für menschliche MG63.3, MG63, MNNG und HOS Zellen Severe Combined Immunodeficiency Mäuse.
2. Sicherstellen Sie, dass die Zellsuspension einheitlich ist, durch das Rohr vorsichtig schütteln. Erarbeiten Sie sorgfältig die Zellsuspension in 1 mL Spritze ohne Nadel. Kappe der Spritze mit einer 27 gauge Nadel. Stellen Sie sicher, dass die Nadel Abschrägung auf der gleichen Seite wie die Volumen-Markierungen auf der Nadel ist.
3. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer, und wischen Sie die Rute mit einem Alkohol abwischen.
4. Gehen Sie zum Durchführen einer Rute Vene Injektion und injizieren die 100 μL der Zellsuspension. 5 min nach der Injektion, platzieren Sie den Mauszeiger in einer CO-₂ -Kammer und der Euthanasie Standardarbeitsanweisung (als Umriss Ihres institutionellen Tierpflege-Ausschusses) beginnen. Zervikale Dislokation sollte nicht als Mittel zur Sterbehilfe verwendet werden, da das Verfahren die Luftröhre beschädigt wird.
5. Sobald die Maus eingeschläfert ist, beginnen Sie die Vorbereitung der Laminar-Flow-Haube für Insufflation der Maus-Lunge mit der Agarose/A-Media-Lösung. Innerhalb der Laminar-Flow-Haube einen Arbeitsbereich mit Ihrem sterilen Pad eingerichtet. Auf diese Unterlage platzieren Sie Ihre sterilisierte Instrumente, IV Katheter IV Erweiterungssatz und Schwerkraft Perfusion Apparat (siehe ergänzende Abbildung1).
6. Platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen Recumbancy. Sezieren Sie mit sterilen kleine Schere sorgfältig aus dem Brustbein, die Brusthöhle verfügbar zu machen. Achten Sie darauf, nicht die Lunge punktieren, da eine Agarose/A-Media-Lösung verwendet wird, um die Lunge zu insufflieren.
7. Wenn aus dem Brustbein zu sezieren, zerlegen Sie vorbei an den thorakalen Einlass auf beiden Seiten der Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch sezieren entfernt das umliegende Weichgewebe.
8. Cannulate der Luftröhre mit einem 20 Gauge-IV-Katheter. Verknoten Sie locker chirurgische Verwendung steril Darmsaite Naht um die kanülierte Luftröhre.
9. Legen Sie ein IV Erweiterungssatz von katheterisiert Luftröhre zu 10 mL Spritze der Schwerkraft Perfusion Vorrichtung.
10. Kombinieren Sie die vorgewärmte 37 ^oC Agarose (5 mL) und A-Media (5 mL) in ein 1:1-Gemisch. Gießen Sie die flüssige Agarose/A-Media-Lösung in 10 mL Spritze von der Schwerkraft Perfusion Gerät. Sicherzustellen Sie vor Insufflation der Lungen mit Agarose/A-Media-Lösung, dass die gesamte Länge der Erweiterungssatz mit Agarose/A-Media, damit unbeabsichtigte Insufflation von Proben der Lunge mit Luft zu negieren grundiert worden ist.
11. Füllen Sie die Lunge die Agarose/A-Media-Lösung, bis die Lunge voll insuffliert wird.
12. Sobald die Lunge voll insuffliert, entfernen der Kanüle und fest binden Sie den chirurgischen Knoten Auslaufen der Agarase/A-Media-Lösung durch die Luftröhre zu verhindern.
13. Fahren Sie mit der zupfen (Luftröhre, Herz und Lunge) aus der Brusthöhle zu sezieren. Achten Sie darauf, keine Punktion oder die Oberfläche der Lunge schädigen.
14. Ort der zupfen (in keine bestimmte Ausrichtung) in die vorgekühlt 30 mL PBS mit 1 X Pen/Strep ergänzt und ermöglichen die Agarose/A-Media für 20 min zu festigen.
15. Verwendung von feinen Scheren und Pinzetten, Schneide kleine Stücke der Lunge (3 x 1,5 mm), wie in Figur 1Agezeigt. Kleinere Lunge Scheiben können leicht mit einem 2,5 X Objektiv abgebildet werden. Mehrere Scheiben ist in der Regel 4 bis 10 Scheiben pro Gruppe pro Versuchsbedingung, kürzbar.
    Hinweis: Für jede Versuchsgruppe, legen Sie die Lunge Scheiben in einen separaten Brunnen (6-Well-Platte) mit einem 2 x 2 cm Gelatine Schwamm eingeweicht in B-Medien. Die Anzahl der Medien pro Bohrloch sollte 1,5 mL betragen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Für Medikamentenstudien ist die Häufigkeit der Wechsel der Medien/Droge Benutzer bestimmt.

(3) Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung Lung Slices und Analyse

Hinweis: Für Weitfeld Fluoreszenz sind bildgebende, kleinere Scheiben (3 x 1,5 x 1 mm) geschnitten um die Lunge Abschnitt in 1 Bild mit einem 2,5 X Objektiv passen.

Bildaufnahme auf dem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop:

1. Lunge-Scheiben werden in der Regel bei 0, 3, 7 und 14 Tage nach der Injektion abgebildet. In der sterilen Umgebung des biologischen Kabinetts sorgfältig übertragen die Lunge Scheiben aus der Gelatine Runde Schwämme zu einem sterilen 35 mm Glasboden Schale. Achten Sie darauf, aus die überschüssige Flüssigkeit aus der Lunge Slice Tupfen, da die überschüssige Flüssigkeit als ein Spiegel fungiert und fluoreszierendes Licht aus der Tumorzellen zu reflektieren.
2. Ordnen Sie die Lunge Scheiben in ähnlicher Weise dargestellt in Abbildung 1A. Jede Spalte würde eine andere experimentelle Erkrankung darstellen. Achten Sie darauf, nicht Kreuz-die Lungen mit der Pinzette verunreinigen. Mit 70 % Ethanol spülen und trocknen vor dem Umgang mit Lunge Scheiben aus einer anderen experimentellen Gruppe.
3. Optimieren der bildgebenden Parameter (dh. Gain, Offset, Belichtung Zeit, binning), bietet den besten Kontrast zwischen der fluoreszierenden Tumorzellen und Hintergrund Lungengewebe im Steuerelement (Fahrzeug unbehandelt) Gruppe. Verwenden Sie die gleichen Parameter aus der Kontrollgruppe zu die experimentellen Gruppen Bild. Speichern Sie als TIFF-Bildformat.
4. Zu Referenzzwecken eine Skala nehmen Sie ein digitales Foto von einem Mikrometer auf das gleiche Ziel.
5. Da Lunge Auto-Fluoreszenz im Laufe der Zeit ändert, müssen die bildgebenden Parameter jeder bildgebenden Sitzung zu den Lungen Kontrolle angepasst werden. Die bildgebende Parameter für eine Sitzung unbedingt nicht optimal für nachfolgende bildgebende Sitzungen.

Bildanalyse:
Hinweis: Die folgenden Bild-Bearbeitungsschritte erfolgen mit ImageJ 1,51 h Software Paket ¹⁷.

1. Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ (Abb. 3A).
2. Subtrahieren Sie Hintergrund: Prozess > subtrahieren Hintergrund > Rolling Ball Radius (Start mit 50 Pixel), deaktivieren Sie die Option "Licht Hintergrund" (Abb. 3 b).
3. Bild 8-Bit-Format zu konvertieren: Bild > Art > 8 - Bit (Abbildung 3).
4. Einheiten auf Pixel festgelegt: Bild > Enter "Pixel" Längeneinheit, geben Sie 1 in "Pixelbreite", "Pixelhöhe", "Voxel Tiefe". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Global" auf nachfolgende Bilder anwenden.
5. Mit dem Polygon-Auswahl-Werkzeug, skizzieren Sie die Form des gesamten Lung Slices und ermitteln Sie Bereich (Pixel²) des gesamten Lunge Slice. Dieser Wert wird verwendet werden, um die prozentuale Tumorlast der Lunge zu berechnen.
6. Schwelle Bild: Bild > anpassen > Schwellenwert > Markieren Sie "Standard" und "B & W" > verwenden Sie den Schieberegler Schwelle das Bild so, dass die Mehrheit der Tumorzellen genau hervorgehoben werden. "Apply" drücken führt zu einer schwarz / weiß Bild, wo die Lunge ist ganz schwarz, und die fluoreszierenden Läsionen sind weiß (Abbildung 3D). Ein zweites Drücken der "Übernehmen" wird das Bild invertieren, wo alle fluoreszierende Strukturen jetzt schwarze Formen (Abbildung 3E sind).
7. Quantifizierung von der Anzahl und Form der Läsionen:
   Analysieren > Messungen festlegen > "Area" zu überprüfen. Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen.
   Analysieren Sie Partikel > Größe (Pixel²): 0-unendlich repräsentiert den Bereich der Formen, die ImageJ auflisten wird. Bestimmen Sie empirisch die kleinste Läsion, die als eine einzelne Tumorzelle in Tag 0 Fahrzeugbilder gilt. Verwenden Sie den Bereich von diesem einzelnen Tumorzelle als untere Grenze für die restlichen Bilder im Dataset. Für die Arbeit in diesem Papier präsentiert ist 11 Pixel² als untere Grenze festgelegt. Für die Arbeit in der video-Beispiel vorgestellt ist 24 Pixel² als untere Grenze festgelegt. Lassen Sie "Rundheit" Palette als 0-1. "Show" auf eingestellt werden "Nichts". Alternativ, wenn "Show" und "Umrisse" ausgewählt ist, wird eine Zeichnung von allen Formkonturen generiert. Suchen Sie ein separates Fenster Messungen Pop-up "Ergebnisse anzeigen". Optional sparen mit "Add to Manager" Kontrollkästchen aktiviert alle Shapes, die quantifiziert mit einem ROI-Manager, die für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Nach dem "OK" drücken, erscheint ein Fenster "Ergebnisse" mit allen aufgezählten Formen und Flächenmaße (Abbildung 3F).
8. Kopieren und Einfügen der Daten aus dem Fenster "Ergebnisse" in eine Tabellenkalkulation. Verwenden Sie die mathematische Summe-Funktion in Excel fassen wir alle Bereiche der metastatischen Läsionen für diesen bestimmten Lunge-Slice. Um die Tumorlast Prozent Lunge Lunge Slice zu bewerten, teilen Sie die Summe der Flächen der metastatischen Läsionen durch die Gesamtfläche des Lung Slices. Dieser Parameter ist auch bekannt als Bereich Bruchteil (ein_A) die beschrieben wird durch Underwood ¹⁸weiter.
   Lunge Tumorlast = Summe der metastatischen Läsion Bereiche/Gesamt Fläche von Lung Slice
9. Berechnen Sie die Lunge Tumorlast für den Rest der Lunge Abschnitte in Kontrollgruppe und verbleibenden Gruppen. Zeichnen Sie die durchschnittliche Lunge Tumorlast pro Gruppe in 0, 3, 7 und 14 Tagen. Vertreter Weitfeld fluoreszierende Bilder hoch und niedrig metastasierendem menschlicher OS Zellen wachsen in das PuMA-Modell zu progressive Zeitpunkten werden (Abb. 4A) angezeigt. Ein Liniendiagramm zeigt die Falte-Änderung (normiert auf Tag 0) in Prozent metastasierendem Tumorlast im Laufe der Zeit ist (Abbildung 4 b) gezeigt.

4. konfokale Fluoreszenz-Bildgebung des PuMA-Modells

Hinweis: Für die konfokale Bildgebung ist Gewebe Verarbeitung ähnlich wie im vorherigen Abschnitt außer dass größere Lunge Scheiben (komplette Querschnitte, 1-2 mm dick) geschnitten werden, um für mehr ROIs, abgebildet werden können.

Kennzeichnung des Lungenparenchyms mit DAR4M:

1. Tauchen Sie Lunge Scheiben in 10 μμM DAR4M (in HBSS) für 45 min bei 37 ° C. DAR4M Etiketten reaktivem Stickstoff-Spezies innerhalb der Zellen der Lunge.
2. Spülen Sie nach 45 min Inkubation die Lunge Scheiben mit frischen HBSS.
3. Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.
4. Die bildgebende Parameter für die Beispielbilder, die in Abbildung 5 dargestellten sind in Tabelle 5aufgeführt.
5. Erwerben Sie einen Z-Stapel für eine Region von Interesse. Verwenden Sie die empfohlene Z Scheibendicke für Nyquist Sampling. In Movie 1 und ergänzende Film 1kostenfrei ein repräsentativen Film eines 3D Stacks zeigt grüne fluoreszierende OS Zellen im Lungengewebe DAR4M beschriftet.

Für die konfokale Beispielbilder in Abbildung 5gezeigt war die bildgebende Session terminal. Wenn längs Bildgebung erforderlich ist, wird die Verwendung eines 2-Photonen oder Multi-Photonen ausgestattete konfokale LSM Mikroskops für die Bildgebung empfohlen, da gibt es weniger lichtbedingten lebenden Gewebe^19,20.
Bildgebung Mito-RFP mit dem Ausdruck ihrer MG63 Zellen in das PuMA-Modell:

1. Führen Sie das PuMA-Protokoll als Gliederung in Schritt 1 und 2 mit MG63 Zellen mit dem Ausdruck der Mito-RFP-Konstrukt.
2. Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.
3. Die bildgebende Parameter für die in Abbildung 6 gezeigten Beispielbilder sind in Tabelle 6aufgeführt. Einen repräsentativen Film eines 3D Stacks grüne fluoreszierende OS Zellen mit rot fluoreszierende Mitochondrien erfolgt in Movie 2 und zusätzliche Movie 2zeigen.

Representative Results

Low-Vergrößerung Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie

Für Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder und Quantifizierung Daten in Abbildung 2und Abbildung 4A und Bdargestellt. Die metastatischen Neigungen für hohe und niedrige metastasierendem Zelllinien sind über progressive Zeitpunkten visuell sichtbar. MNNG Zellen können effizient das Lungengewebe besiedeln, während HOS Zellen überhaupt nicht wachsen können. Bildanalyse können quantitative Daten entnommen werden um Wachstum im Laufe der Zeit zu bewerten, wie im Diagramm der Abbildung 4 bdargestellt. Bei geringer Vergrößerung (2.5 X) wird bevorzugt, um die gesamte Lunge Slice in einem Bild einzufangen. Diese Methode erlaubt Batch Bildgebung eine große Anzahl PuMA-Scheiben.

Hohe Vergrößerung konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Für die konfokale Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder in Abbildung 5dargestellt. EGFP exprimierenden MG63 Einzelzellen in Abbildung 5A in Bezug auf das Lungenparenchym sehen, die durch den DAR4M fluoreszierenden Farbstoff in Abbildung 5 bgekennzeichnet ist. Zusammengefügte Bild zeigt sich in Abbildung 5und eine vergrößerte Bild einer fluoreszierenden Tumor Zelle in einem Gefäß ist in Abbildung 5gezeigt. 3D-Filme von Abbildung 5 und 5 D Movie 1 und ergänzende Film 1, bzw. erscheinen. Konfokale imaging der subzellulären Strukturen, wie die Mitochondrien in gezeigt werden Abbildung 6. Cytosolischen eGFP-Ausdruck erlaubt die Gliederung Tumorzellen in Abbildung 6A, und die Mitochondrien mit RFP beschriftet sind in Abbildung 6 bdargestellt. Zusammengefügte Bild ist in Abbildung 6sehen. 3D-Filme von Abbildung 6 sind in Movie 2 und zusätzliche Movie 2dargestellt. Subzelluläre Strukturen wie die Mitochondrien Imaging kombinierbar mit anderen Fluoreszenzmarkierungen Organelle Biologie in metastasierenden OS Zellen. Wenn Sie weitere Beschriftungen hinzufügen, sicherzustellen Sie, dass die Laserlinien und Emission Filter kompatibel mit bestimmten Fluorophore/fluoreszierenden Proteins des Interesses sind. Vermeiden Sie imaging Fluorophore/fluoreszierende Proteine, deren Erregung und Emissionsspektren eng überlappen.

Abbildung 1 : Diagramm zur Veranschaulichung der metastatischen Kaskade. Die metastatische Kaskade kann in mehrere, Bandbreitenbegrenzung Schritte aufgegliedert werden. (1) metastasiertem Tumor Zellen der Primärtumor Website verlassen zu müssen und dringt in den lokalen Parenchym; (2) Tumor Zellen in Blut/lymphatische Behälter und Transit in die Zirkulation Intravasating; (3) Tumor Zelle Verhaftung am sekundären Standort; (4) Tumor Zelle Extravasation heraus aus den Microvasculature und Überleben in den sekundären Standort; (5) Wachstum in Fixierungsprotokoll; (6) Wachstum in vaskularisierte offene metastasierten Tumoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Imaging PuMA Lunge Scheiben mit Weitfeld-Fluoreszenz und konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie Plattformen. (A) Beispiel PuMA Scheiben werden in einem Glasboden 35 mm Teller angezeigt. (B) confocal Mikroskop Ausrüstung. (C) Low-Vergrößerung Beispielbild einer PuMA-Scheibe mit eGFP-Ausdruck OS Zellen. Maßstabsleiste = 0,5 mm. (D) Beispiel konfokale Bild der Subregion von einem PuMA-Slice. Maßstabsleiste = 100 μm. (*) Lungenparenchym ist rot gekennzeichnet, durch DAR4M (siehe Kasten) und (∇) auf eGFP exprimierenden MG63 Zellen verweisen. Maßstabsleiste = 30 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Verarbeitung einer niedrig-Vergrößerung Bild einer PuMA-Scheibe mit ImageJ. (A) Originalbild PuMA. (B) Subtraktion des Hintergrunds. (C) Umwandlung in eine 8-Bit-Bild. (D) das Bild Schnittstellenüberwachung, fluoreszierende Tumorzellen hervorzuheben. (E) Umkehrung des Bildes. (F) Aufzählung der diskreten Formen und Quantifizierung der Form Bereiche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . Low-Vergrößerung seriellen Bilder zeigen das Wachstum von hoch und niedrig metastasierendem menschlichen OS Zellen in das PuMA-Modell im Laufe der Zeit. (A) serielle Bilder von hoch metastatischen MNNG und niedrigen metastasierendem HOS Zellen angezeigt werden bei 0, 3, 7 und 14 Tage nach der Injektion. MNNG Zellen sind in der Lage, besser in die Lunge Mikroumgebung im Gegensatz zu den HOS Zellen wachsen. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Falte-Veränderung in Prozent metastasierendem Tumorlast für MNNG und HOS Zellen im Laufe der Zeit als Liniendiagramme angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Konfokale Mikroskopie eines DAR4M-Label PuMA Lunge Slice. Ein repräsentatives konfokale Bild eGFP exprimierenden MG63 Zellen im PuMA Lungengewebe mit DAR4M beschriftet. (A) Grünkanal zeigt eGFP exprimierenden MG63 Zellen (∇). (B) Rot-Kanal zeigt die DAR4M Farbstoff binden an reaktivem Stickstoff-Spezies in Lunge Parenchymzellen. Der Farbstoff zeigt das Lungenparenchym (#), und Strukturen, die ähnlich wie ein Blutgefäß (*). Der Rand der Lunge Abschnitt ist PuMA bezeichnet (↓). (C) zusammengeführten grünes und rotes Bild. Maßstabsleiste = 100 μm. (D) einem gezoomten Bild der gestrichelte weiße Feld (von C) zeigt eine Tumorzelle in einem Gefäß. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Konfokale Mikroskopie von Mitochondrien in Osteosarkom Zellen in das PuMA-Modell. Ein repräsentatives konfokale Bild der Mitochondrien in eGFP exprimierenden MG63 Zellen. (A) Grünkanal zeigt eGFP exprimierenden MG63 Zellen (∇). (B) Rot-Kanal zeigt die RFP in Mitochondrien (*) lokalisiert. (C) zusammengeführten grünes und rotes Bild. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kultur, Medien	Rezept
Komplette Medien (500mL)	•440 mL DMEM
	•50 mL EB
	•5 mL 10 X Pen/Strep Lösung (10000U/mL)
	•5 mL L-Glutamin (200 mM)
A-Media (250mL)	•177.58 mL sterilem Wasser
	•50 mL 10 X M-199 Medien
	•15 mL 7,5 % Natriumbicarbonat Lösung
	•2.25 mL 50 mM hydrocortizone
	•125 mL 0,4 mg/ml Retinol Acetat (in sterilem Wasser)
	•5 mL 10 X Pen/Strep Lösung (10000U/mL)
	•50 mL 10mg/ml Rinder insulin
B-Medien (500ml)	•427.6 mL sterilem Wasser
	•50 mL 10 X M-199 Medien
	•15 mL 7,5 % Natriumbicarbonat Lösung
	•2.25 mL 50 mM hydrocortizone
	•125 mL 0,4 mg/ml Retinol Acetat (in sterilem Wasser)
	•5 mL 10 X Pen/Strep Lösung (10000U/mL)
	•50 mL 10mg/ml Rinder insulin

Tabelle 1. Rezepte für komplette Media, A-B-Medien. Rezepte für die Zellkultur und Medien für die PuMA-Assay werden aufgelistet.

Zell-Kultur-Reagenzien	Beschreibung	Katalog Nr.	Unternehmen
MNNG-HOS	hoch metastatischen OS-Zell-Linie	CRL-1547	ATCC
HOS	schlecht metastasierendem OS-Zell-Linie	CRL-1543	ATCC
MG63.3	hoch metastatischen OS-Zell-Linie	N/A	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)
MG63	schlecht metastasierendem OS-Zell-Linie	CRL-1427	ATCC
10 X M199 Medien	Base Medien für A-Media und B-Medien	11825015	Thermofisher
Destilliertes Wasser (sterilisiert)	Komponente A-Media &	15230-147	Thermofisher
	B-Medien
7,5 % Natriumbicarbonat Lösung	Komponente A-Media &	25080094	Thermofisher
	B-Medien
Hydrocortizone	Komponente A-Media &	H6909	Sigma-Alrich
	B-Medien
Retinol Acetat-Wasser löslich	Komponente A-Media & B-Medien	R0635 - 5MG	Sigma-Alrich
Penicillin/Streptomycin 10 X konzentriert (10000 U/ml) Lösung	Komponente A-Media &	15140122	Thermofisher
	B-Medien, komplette
Bovine Insulinlösung (10mg/ml)	Komponente A-Media &	I0516 - 5ML	Sigma-Alrich
	B-Medien
DMEM, hoher Blutzucker	Komplette Media Base Medien	11965092	Thermofisher
L-Glutamin (200 mM)	Bestandteil des kompletten Medien	25030081	Thermofisher
Fetale Rinderserum	Bestandteil des kompletten Medien	16000044	Thermofisher
Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Verwendet in der Zellkultur	14190144	Thermofisher
Hank es gepuffert Salze Lösung, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenol rot	Verwendet, um die Zelle Pellet vor der Injektion Aufschwemmen	14175095	Thermofisher
Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenol rot	Verwendet in der Zellkultur	25200114	Thermofisher
DAR4M	Zur Beschriftung von Lungenparenchym verwendet	ALX-620-069-M001	Enzo

Tabelle 2: Zell-Kultur Reagenzien für A-Media, B-Medien und Medien führen. Komponenten für Medien Rezepte, Reagenzien und Puffer sind mit Katalog und Namen aufgeführt.

Materialien	Beschreibung	Katalog Nr.	Unternehmen
Konfokale LSM 710 Zeiss	Aufrechte LSM confocal Mikroskop	N/A	Zeiss
Zeiss 780 konfokale LSM	Invertierte LSM confocal Mikroskop	N/A	Zeiss
SCID-Mäuse	NICKEN. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, Weiblich, Alter 6-8 Wochen	N/A	Charles River
GelFoam	Als Unterstützung verwendet für die Lunge Gewebeschnitte	59-9863	Harvard-Apparat
SeaPlaque Agarose	Während Insufflation der Lunge verwendet	50100	Lonza
1 ml Spritze mit 27 gauge Nadel	Für Heck Vene Injektion verwendet		Fisherscientific
		14-826-87
10 ml Spritze	Verwendet für Insufflation der Lunge	309604	BD
20 Gauge Katheters	Während Insufflation der Lunge verwendet	SR-OX2032CA	Terumo
Abbott IV Nachfrist zu setzen (30", steril)	Während Insufflation der Lunge verwendet	8342	Medisca
Alkoholtupfer	Zum Abwischen von Tail Vene vor der Injektion	326895	BD
Sterile OP-Handschuhe	Aseptische Umgang mit Maus-Lunge	Variiert mit der Größe	Fisherscientific
30 cm Lineal	Verwendet für Insufflation der Lunge		Heftklammern
Ständer für Lineal	Verwendet für Insufflation der Lunge	HS29022A	Pipette.com
35 mm Glasboden Kulturschale	Während der Aufnahme der Lunge Scheiben verwendet	81158	Ibidi
Saugfähige Krankenunterlagen mit wasserdichten Feuchtigkeitssperre	Verwendet, um den sterilen Arbeitsbereich in der biologischen Haube Linie	56617-014	VWR
Catgut Plain resorbierbarem Nahtmaterial	Verwendet, um aus kanülierte Luftröhre binden	N/A	Braun

Tabelle 3. Materialien für PuMA. Für das PuMA-Protokoll benötigten Materialien sind mit Katalog und Namen aufgeführt.

Materialien	Beschreibung	Katalog Nr.	Unternehmen
Schere Mikro sezieren 3,5" gerade scharf/scharf	Für Lungen-Abschnitte schneiden	RS-5910	Roboz
4"(10 cm) lange gezackte gerade besonders empfindliche 0,5 mm Spitze	Für Manipulation/Holding Lungen-Abschnitte	RS-5132	Roboz
4"(10 cm) lange gezahnte leichten Kurve 0,8 mm Spitze	Für Manipulation/Holding Lungen-Abschnitte	RS5135	Roboz
Daumen-Dressing Zange; Gezahnt; Delicate; 4.5" Länge; Spitze Breite 1,3 mm	Für allgemeine Dissektion	RS-8120	Roboz
Daumen Sie-Dressing Zange Tipp 4,5" gezackte 2,2 mm breite	Für allgemeine Dissektion	RS-8100	Roboz
Extra feine Mikro Dissecting Schere 3,5" gerade scharf/scharf, 20mm Klingenlänge	Für allgemeine Dissektion	RS-5880	Roboz
Knapp Schere; Gerade; Sharp-Blunt; 27mm Klingenlänge; 4" Länge über alles	Für allgemeine Dissektion	RS-5960	Roboz

Tabelle 4. Chirurgische Instrumente für PuMA. Verschiedenen Edelstahlinstrumente im Protokoll mit Katalog und Namen aufgeführt sind.

Parameter	488 laser	561 laser
Ziel	Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27
macht	2 %		2 %
Pixel-wohnen	1,61		1,61
Durchschnitt	0		0
Zoom	1		1
Meister zu gewinnen	820		814
Digitale Verstärkung	1		0.51
Digital offset	-4,5		-9.24
Lochkamera	51		57
Durchstimmbare Filter	496-553		570-618

Tabelle 5. Parameter für die konfokale Darstellung von PuMA DAR4M-markierten Abschnitte. Bestimmtes Bildparameter verwendet, erhalten die konfokale Bilder in der aktuellen Zeitung sind in der Tabelle angegeben.

Parameter	488 laser	561 laser
Ziel	Plan-Apochromat 63 X / 1.40 Oil DIC M27
macht	2 %		2 %
Pixel-wohnen	0,6		0,6
Durchschnitt	2 (Linie)		2 (Linie)
Zoom	2.3		2.3
Meister zu gewinnen	449		390
Digitale Verstärkung	1		1.23
Digital offset	0		0
Lochkamera	136		136
Durchstimmbare Filter	493-550		566-703

Tabelle 6. Parameter für die konfokale Bildgebung der Mitochondrien MG63 Zellen in PuMA Abschnitten. Bestimmtes Bildparameter verwendet, erhalten die konfokale Bilder in der aktuellen Zeitung sind in der Tabelle angegeben.

Ergänzende Abbildung1: Schwerkraft Perfusion Apparat. Die Schwerkraft Perfusion Apparat wird verwendet, um die Lunge mit einer flüssigen Agarose/A-Media-Lösung bei 20 cm H₂0 hydrostatischen Druck insufflieren. Die Agarose/A-Media-Lösung wird in 10 mL Spritze, gegossen, die durch ein IV Erweiterungssatz zur kanülierte Trachea (nicht dargestellt) angebracht ist. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Movie 1: Drehung eines Bildes 3D konfokale Z-Stapel von eGFP exprimierenden OS Zellen in einer DAR4M-Label PuMA-Lunge-Scheibe. DAR4M (Rot-Kanal) wird verwendet, um Lungenparenchym markieren und eGFP exprimierenden MG63 Zellen können auch gesehen (Grün-Kanal). Maßstabsleiste = 100 μm. Klicken Sie bitte hier, um diesen Schritt herunterladen.

Movie 2: Drehung eines 3D konfokale Z-Stapel Bildes des RFP-Label Mitochondrien in OS eGFP exprimierenden Zellen in das PuMA-Modell. Subzellularen Organellen wie Mitochondrien sind beschriftet mit RFP (Rot-Kanal) in eGFP exprimierenden MG63 Zellen (Grün-Kanal) in das PuMA-Modell dargestellt. Maßstabsleiste = 10 μm. Klicken Sie bitte hier, um diesen Schritt herunterladen.

Ergänzende Film 1: gezoomten 3D-Film einer metastatischen OS-Zelle in einem Gefäß in der Lunge. Gefäß in der Lunge Mikroumgebung zeigt eine eGFP exprimierenden MG63 Zelle. Maßstabsleiste = 30 μM. Klicken Sie bitte hier, um diesen Schritt herunterladen.

Ergänzende Movie 2: gezoomten 3D-Film von Mitochondrien in einer metastatischen OS-Zelle in der Lunge. Mitochondrien mit RFP beschriftet werden in den MG63 Zellen in der Lunge Mikroumgebung angezeigt. Maßstabsleiste = 5 μM. Klicken Sie bitte hier, um diesen Schritt herunterladen.

Discussion

Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte

(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders auf wie die schräge der Nadel die Luftröhre, beim Einführen der Kanüle gelangt.

(b) Punktion oder eine Beschädigung der Oberfläche der Lunge. Die Lunge kann leicht punktiert oder beschädigt mit Präparierscheren beim Entfernen des Brustbeins und Freilegung der Brusthöhle. Seien Sie vorsichtig beim heraus zupfen aus der Brusthöhle zu sezieren. Punktion oder eine Beschädigung der Oberfläche der Lunge wird dazu führen, dass der flüssige Agarose/A-Media, austreten und die Lunge wird entlüftet werden.

(c) entfernen Sie überschüssiges Medium aus Lunge Abschnitte während imaging. Überschüssige flüssige Medien rund um die Lunge Abschnitt können dazu führen, dass einen ""-Spiegeleffekt, wenn Sie unter dem Mikroskop betrachtet. Die überschüssige Flüssigkeit kann fluoreszierendes Licht aus den Tumorzellen so übertreiben die Fluoreszenz-Bereich im Bild wiedergeben. Entfernen von überschüssigem Medien Flüssigkeit verhindert dieses Artefakt in das Bild. Alternativ kann das Bild Artefakt während der Nachbearbeitung der Bilder entfernt werden.

(d) lichtbedingten des lebenden Gewebes. Bei Verwendung einer Quecksilber-Lampe oder Laser von einem 1-Photonen-Mikroskop, achten Sie darauf, die Zeit dem Licht ausgesetzt zu begrenzen. Die Intensität/Power-Prozentsatz der Lichtquelle kann auch reduziert werden. Überbelichtung zur Lichtquelle kann lichtbedingten, des Lungengewebes führen. Mikroskope mit Leuchtdioden (LED) ausgestattet oder 2 Photon/multi photon Mikroskope wäre ideal, weil sie weniger lichtbedingten während imaging Längsschnittstudien produzieren.

Das PuMA-Modell angepasst und geändert, um viele Aspekte des Prozesses Lunge Kolonisation zu studieren. Eine andere Variante dieses ex-Vivo -Ansatzes wird durch van Den Bijgaart und Kollegen ²¹beschrieben. Für Studien ist Untersuchung der Auswirkungen der Aktivität der Gene Knock-down oder anti-metastatischen Droge auf das Zellwachstum der Tumor in der Lunge, die Anzahl der Zellen injiziert von 5 x 10⁵ bis 3 x 10⁵ zurückfahren geraten, da die Effekte der Intervention maskiert werden können während des exponentiellen Wachstums der eine größere Zelle Innoculum. Mehrere Studien haben das PuMA-Modell verwendet, um Treiber von Lunge metastasierendem Fortschreiten ^{4,5,8,22,23,24}zu studieren. Verschiedenen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen oder fluoreszierende Reporter-Gene einsetzbar zum Label Tumorzellen um zu Änderungen in Zelle Physiologie oder gen Ausdruck ⁸ in der Lunge Mikroumgebung zu prüfen.

Eine Einschränkung der PuMA-Modell umfasst eine begrenzte Anzahl von kompatiblen Zelllinien. Etablierte Zelllinien, die kompatibel mit dieser Assay werden nach Mendoza und Kollegen ³ aufgeführt. Für hohe und niedrige metastasierendem Osteosarkom-Zell-Linien, die Paare folgen klonal Verwandte Zelllinien zu wachsen und pflegen ihre metastasierendem Neigung in das PuMA-Modell gefunden wurden: MG63.3 & MG63 Zellen, MNNG & 143B und HOS Zellen, murine K7M2 und K12 Zellen. Forscher müssen empirisch ermitteln, unabhängig davon, ob ihre Zelllinien in B-Medien lebensfähig bleiben können. Eine weitere Einschränkung zu berücksichtigen ist die begrenzte Zeitdauer des Lungengewebes in Vitroaufrechterhalten werden können. Lungengewebe kann seinen zellulären Komponenten für 30 Tage nach diesem Zeitpunkt behalten und die zellulären Komponenten der Lunge beginnen abzusterben. Daher die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Stromazellen Lungenzellen sollte 30 Tage nicht überschreiten.

Das PuMA-Modell bietet eine noch nie dagewesene Methode zu studieren wie metastasiertem OS Zellen besiedeln Lungengewebe. Der auffälligste Aspekt der das PuMA-Modell stammt aus der Tatsache, dass mehrere niedrige metastasierendem OS Zelllinien (HOS, MG63, K12), deren in-Vivo -Phänotypen wurden an anderer Stelle ²⁵, gekennzeichnet kann nicht wachsen, in das PuMA-Modell. Im Gegensatz dazu haben klonal Verwandte hoch metastatische OS Zellen (MNNG, MG63.3, K7M2) eine größere Neigung zu kolonisieren Lunge Gewebe in Vivo²⁵ und in den PuMA zu modellieren. Dies deutet darauf hin, dass die zellulären und extrazellulären Komponenten der Lunge Mikroumgebung, die verhindern, dass niedrige metastasierendem OS Zelllinien wächst in Vivo, in das PuMA-Modell trotz mangelnder Durchblutung noch gepflegt werden. In anderen Worten, übt der Lunge Mikroumgebung von PuMA-Modell noch eine "Selektionsdruck", die verhindert, dass niedrige metastasierendem OS-Zellen in der Lunge wachsen. In der Tat Studium hohe metastatische OS Zellen wachsen PuMA bei der Identifizierung von molekularen Fahranfänger von metastasierendem Phänotyp ^4,5nützlich erwiesen hat. Darüber hinaus genetische Down-Modulation der genannten Ziele in höchst metastasierenden Zellen konnte gezeigt werden, metastasierendem Kapazität im PuMA-Modell nachlassen und in-vivo ⁵. Für Kandidaten anti-metastatischen Medikamentenstudien, die PuMA Modell verwendet werden kann, um festzustellen, welche Konzentrationsbereich metastasierendem Auswuchs im Lungengewebe, reduzieren kann was wiederum dann validierten in Vivokann.

Zukünftige Anwendungen dieses Modells sollte die Fülle der im Handel erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen und Reporter-Gene nutzen, um tief in die grundlegende Biologie OS Metastasen Progression zu vertiefen. Fluoreszierende Farbstoffe wie 2', 7' - Dichlorofluorescin Diacetat oder Dihydroethidium können beispielsweise verwendet werden, zur Bewertung des Redox-Zustandes von Tumorzellen in das PuMA-Modell. Fluoreszierende Reporter Gene lässt sich Organelle Biologie zu studieren oder bewerten Promotoraktivität um festzustellen, welche Signalwege bei der Kolonisation in hoch metastatischen OS Zellen aktiviert werden. Solche Ansätze können verwendet werden, ob eine medikamentöse Behandlung hat Tätigkeit in Tumorzellen wachsen in der Lunge zu visualisieren. Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen, die weniger lichtbedingten Gewebe, zu produzieren, wie z. B. LED-bestückte Mikroskope oder 2-Photon/Multiphoton confocal Mikroskope, einsetzbar zu studieren wie metastasiertem OS Zellen migrieren und im gesamten Lungengewebe eindringen. Darüber hinaus können Haftung Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Stromazellen Lungenzellen mit fluoreszierenden Reporter Gene überwacht werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, beschreibt das aktuelle Papier die praktischen Aspekte des Modells PuMA, zuerst von Mendoza und Kollegen ³entwickelt. Ein Beispiel der Verwendung von Low-Vergrößerung, Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie um zu beurteilen, das Wachstum von hohen und niedrigen metastasierendem menschlichen OS Zellen. Mehrere wichtige Schritte des Protokolls sind beschrieben worden. Darüber hinaus wurden die Vorzüge und Grenzen des PuMA Modells erörtert. Zukünftige Anwendungen das PuMA-Modell den Lunge Kolonisation Prozess zu studieren sind vorgebracht worden, und es ist zu hoffen, dass dieses Modell eine breitere Nutzung in der Forschungsgemeinschaft Osteosarkom haben wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	highly metastatic OS cell line
HOS	ATCC	CRL-1543	poorly metastatic OS cell line
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N/A	highly metastatic OS cell line
MG63	ATCC	CRL-1427	poorly metastatic OS cell line
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized)	Thermofisher	15230-147	Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution	Thermofisher	25080094	Component of A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution	Thermofisher	15140122	Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose	Thermofisher	11965092	Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum	Thermofisher	16000044	Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red	Thermofisher	14175095	Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermofisher	25200114	Used in cell culture.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Used to label lung parenchyma.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Inverted LSM confocal microscope
SCID mice	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle	Fisherscientific	14-826-87	Used for tail vein injection.
10 ml syringe	BD	309604	Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter	Terumo	SR-OX2032CA	Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile)	Medisca	8342	Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs	BD	326895	For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves	Fisherscientific	Varies with size	Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler	Staples		Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler	Pipette.com	HS29022A	Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish	Ibidi	81158	Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014	Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Used to tie off cannulated trachea.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip	Roboz	RS-5132	For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width	Roboz	RS-8120	For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width	Roboz	RS-8100	For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade	Roboz	RS-5880	For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length	Roboz	RS-5960	For general dissection.