Summary
L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.
Abstract
Il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) è un ex vivo espianto del polmone e il sistema di coltura di cellule chiuse che permette ai ricercatori di studiare la biologia della colonizzazione del polmone nell'osteosarcoma (OS) da microscopia di fluorescenza. In questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del protocollo e vengono illustrati esempi di ottenere dati di immagine sulla crescita metastatica utilizzando widefield o piattaforme di microscopia di fluorescenza confocale. La flessibilità del modello PuMA permette i ricercatori a studiare non solo la crescita delle cellule di OS nel microambiente polmonare, ma anche di valutare gli effetti di anti-metastatica terapeutica nel tempo. La microscopia confocale permette per l'imaging ad alta risoluzione, senza precedenti delle interazioni cellula OS con il parenchima polmonare. Inoltre, quando il modello di PuMA è combinato con coloranti fluorescenti o reporter genetici proteina fluorescente, i ricercatori possono studiare il microambiente polmonare, strutture cellulare e subcellulare, funzione del gene e l'attività del promotore in cellule metastatiche di OS. Il modello PuMA fornisce un nuovo strumento per i ricercatori di osteosarcoma scoprire la nuova biologia di metastasi e valutare l'attività di nuove terapie anti-metastatiche, mirate.
Introduction
I risultati migliori per i pazienti pediatrici con osteosarcoma metastatico (OS) rimane ancora un bisogno insoddisfatto critico di clinica 1. Ciò sottolinea l'importanza di sviluppare nuove terapie mirate al livello molecolare. Chemioterapici convenzionali che proliferazione delle cellule tumorali di destinazione non hanno dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia metastatica e quindi nuove strategie devono avere come destinazione lo stesso processo metastatico 2. L'attuale articolo vengono illustrati gli aspetti pratici di un tipo relativamente nuovo di ex vivo modello della metastasi del polmone, il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) sviluppato da Mendoza e colleghi3, che fornisce uno strumento utile a scoprire nuovi driver molecolare nella progressione di metastasi del polmone in OS 4,5. Prima di procedere, tuttavia, sarebbe prudente toccare brevemente su diversi modelli correnti della metastasi, e come il modello PuMA offre diversi vantaggi rispetto ai convenzionali in vitro dosaggi.
Modelli più sperimentali usati per studiare metastasi dispongono di sistemi in vitro e in vivo che ricapitolano un passo specifico o diversi passaggi della cascata metastatica. Tali passaggi includono: 1) tumorale abbandonando il tumore primario, 2) intravasation nei vasi vicini (sangue o linfatico) e transito all'interno di circolazione, 3) arresto al sito secondario, 4) stravaso e sopravvivenza presso il sito secondario, formazione di 5) di micrometastasi e 6) crescita in metastasi vascolarizzate (Figura 1). Modelli in vitro di metastasi possono includere migrazione di 2-dimensionale (2D) e 3-dimensionale (3D) saggi di invasione di Matrigel che sono esaminati in dettaglio altrove 6. Per i modelli in vivo , i due sistemi di modello comunemente usate includono: 1) il modello della metastasi spontanea è dove un tumore le cellule sono orthotopically iniettato in un tipo specifico tessuto per formare un tumore locale che getta spontaneamente le cellule metastatiche ai luoghi distanti; 2) il modello della metastasi sperimentale è dove le cellule del tumore sono iniettate nel vaso sanguigno a monte dell'organo bersaglio. Ad esempio, un'iniezione della vena della coda dei risultati delle cellule del tumore nello sviluppo polmonare metastasi5,7,8. Altri modelli di metastasi sperimentali includono iniezione delle cellule del tumore nella milza o vena mesenterica che provoca lo sviluppo di metastasi epatiche9,10. Considerazioni pratiche di questi modelli in vivo sono discussi in dettaglio da Welch 11. Un altro modello in vivo utilizzato per lo studio di metastasi nei sarcomi pediatrici è il modello di impianto di subcapsular del tumore renale del rene che si traduce in formazione locale del tumore e metastasi spontanea per i polmoni 12,13. Una tecnica più tecnicamente impegnativa come videomicroscopia videomicroscopia può visualizzare direttamente, in tempo reale, interazioni tra cellule tumorali metastatiche e del microcircolo di un sito metastatico (cioè. polmone o fegato) come descritto da MacDonald14 ed Entenberg15, o lo stravaso delle cellule di cancro nella membrana corio-allantoidea come descritto da Kim 16.
Il modello di PuMA è un ex vivo, espianto del tessuto polmonare, il sistema di coltura chiuso dove la crescita delle cellule del tumore fluorescenti possa essere osservata longitudinalmente tramite microscopia a fluorescenza per un periodo di un mese (Vedi Figura 2A). Questo modello racchiude in sintesi le fasi iniziali di colonizzazione del polmone (passaggi da 3 a 5) in cascata metastatica. Alcuni vantaggi principali del modello PuMA rispetto ai modelli convenzionali in vitro sono: 1) fornisce la possibilità di misurare la crescita della cellula tumorale metastatico in un microambiente 3D che conserva molte delle caratteristiche del microambiente polmonare longitudinalmente vivo 3; 2) puMA consente al ricercatore di valutare se l'atterramento di un trattamento di gene o farmaco candidato ha attività anti-metastatica nel contesto di un microambiente polmonare 3D; 3) il modello di PuMA è flessibile con molti tipi di piattaforme di microscopia di fluorescenza (Figura 2B) come microscopia di fluorescenza widefield o microscopia confocale a scansione laser, esempi di ciascuno sono mostrati in Figura 2 & D, rispettivamente. Questo articolo verrà illustrato come utilizzare il modello di PuMA per ottenere dati di imaging longitudinali sulla crescita metastatica di migliorata della proteina fluorescente verde (eGFP)-che esprimono, le cellule umane di osteosarcoma metastatico ad alta e bassa (cellule MNNG e HOS, rispettivamente) utilizzando basso ingrandimento widefield fluorescenza. Esempi di un colorante fluorescente che etichette il parenchima polmonare e una proteina fluorescente rosso reporter genetici che etichette mitocondri in OS cellule nel modello PuMA mediante microscopia confocale a scansione laser imaging inoltre sono discussi.
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Protocol
Tutti i protocolli degli animali da cui sono stati ottenuti dati di imaging sono stati eseguiti con approvazione della cura degli animali e Comitato di uso del National Cancer Institute, National Institutes of Health. Tutti i protocolli animali discusso e interpretato l'articolo dei video sono stati approvati dal comitato di cura degli animali di University of British Columbia.
1. preparazione delle cellule del tumore per iniezione e materiali per il modello di PuMA
Nota: La quantità di soluzioni e cellule sarà sufficiente per 1 mouse. La scalabilità necessarie se più topi vengono utilizzati nello studio. Per ricette di supporti, fare riferimento alla tabella 1 e tabella 2.
- Pre-riscaldare 5 mL di A-Media in una provetta conica da 15 mL in bagnomaria a 37 oC.
- Sciogliere l'1,2% bassa fusione soluzione di agarosio (in acqua sterile) utilizzando il forno a microonde di laboratorio.
- Trasferire 5 mL dell'agarosio fuso in una provetta conica da 15 mL e tenere in caldo in un bagno di acqua di 37 oC. Garantire che l'agarosio fuso è al 37 oC e liquido di prova prima il passo di insufflazione del polmone.
- Pre-raffreddare 30 mL di grado di coltura cellulare PBS completati con 1 X penna/strep in un secchio di ghiaccio.
- In un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, pre-immergere una spugna di gelatina in 1,5 mL di B-media. La spugna sarà l'ancoraggio del supporto per le fette di polmone.
- Garantire le cellule OS sono circa 70-90% confluenti il giorno della procedura. Non utilizzare le celle confluenti eccessiva o se il media è arancione al giallo, dal momento che le cellule sono solitamente stressate e hanno diminuito la vitalità a questo punto. Per le linee di cellule di osteosarcoma, MNNG e HOS, 5x105 in un volume di 100 μL serviranno per iniettare nella vena caudale del 1 mouse. Upscale conseguenza se più topi sono utilizzati per lo studio.
- Raccogliere le cellule del tumore con 0,25% tripsina-EDTA (3 mL per un pallone da T75 o 2 mL in una piastra di coltura di 10 cm). Quando le cellule stanno cominciando a sollevare la piastra, neutralizzare la tripsina-EDTA con completa per i media. Rotazione verso il basso le cellule e sciacquare una volta con il grado di coltura cellulare PBS. Risospendere il pellet in 5 mL di PBS.
- Eseguire un conteggio delle cellule con i metodi standard. È meglio fare più sospensione cellulare rispetto a quello che è effettivamente necessario dato che la perdita della sospensione cellulare spesso si verifica durante la redazione dell'ago e tentativi falliti di iniezione.
- Eseguire un'analisi di esclusione del Trypan blu su un campione della sospensione delle cellule per valutare la vitalità delle cellule. Procedere solo se la cella Visualizza attuabilità 90% o superiore.
- Iniettare cellule5 5 x 10 in un volume di 100 μL. Per preparare un eccesso di 2 X di questo importo, 1 x 106 celle dovrebbero essere filate giù e risospesi in 0,2 mL di HBSS.
- Posto sospensione cellulare in un secchio di ghiaccio mentre si prepara i topi per iniezione.
2. iniezione in vena e insufflazione del polmone di coda
Nota: La quantità di soluzioni e le cellule in questa sezione sarà sufficiente per 1 mouse. La scalabilità necessarie se più topi vengono utilizzati nello studio. Per un elenco delle attrezzature, materiali e strumenti chirurgici utilizzati in questa procedura, fare riferimento alla tabella 3 e tabella 4.
- Scaldare un topo femmina (età 6-8 settimane) sotto una lampada di riscaldamento per 5 min al fine di rendere loro coda della vena più visibilmente evidente. Per cellule murine K7M2 o K12, utilizzare topi Balb/c; per MG63.3 umano, cellule MG63, MNNG e HOS, utilizzare topi di immunodeficienza combinata grave.
- Assicurarsi che la sospensione cellulare è uniforme agitando delicatamente il tubo. Redigere con cura la sospensione cellulare nella siringa 1 mL senza ago. Cappuccio della siringa con un 27 ago del manometro. Assicurarsi che la smussatura dell'ago è sullo stesso lato come le marcature di volume sull'ago.
- Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta e tampone la coda con un batuffolo imbevuto di alcool.
- Procedere per eseguire un'iniezione della vena della coda e iniettare 100 μL della sospensione delle cellule. 5 min dopo l'iniezione, posizionare il mouse in una camera di CO2 e iniziare la procedura operativa standard di eutanasia (come contorno dalla vostra commissione istituzionale cura degli animali). Dislocazione cervicale non deve essere utilizzata come mezzo di eutanasia poiché la procedura potrebbe danneggiare la trachea.
- Una volta che il mouse è eutanasia, iniziare la preparazione della cappa a flusso laminare per insufflazione del polmone del mouse con la soluzione di agarosio/A-media. All'interno della cappa a flusso laminare, impostare un'area di lavoro con il vostro pad sterili. Su questo tampone si inserirà il tuo strumenti sterilizzati, catetere IV, IV set di prolunga e apparato di aspersione di gravità (Vedi Supplemental figura 1).
- Posizionare il mouse in recumbancy dorsale. Con piccole forbici sterili, sezionare con cura lo sterno per esporre la cavità toracica. Fare attenzione a non forare il polmone, poiché una soluzione di agarosio/A-media verrà utilizzata per insufflazione del polmone.
- Quando dissezione fuori dello sterno, sezionare passato l'ingresso toracico su entrambi i lati della trachea. Esporre la trachea dissecando via il tessuto molle circostante.
- Incannulare la trachea con un catetere IV 20 calibro. Senza stringere un nodo chirurgico usando il suturare catgut sterili intorno alla trachea cannulata.
- Allegare un'estensione IV impostata dalla trachea cateterizzata la siringa da 10 mL dell'apparato di aspersione di gravità.
- Combinare l'agarosio di pre-riscaldato 37 oC (5 mL) e A-media (5 mL) in una miscela 1:1. Versare la soluzione di agarosio/A-media liquida nella siringa da 10 mL del dispositivo di aspersione di gravità. Prima insufflazione dei polmoni con la soluzione di agarosio/A-media, assicurarsi che l'intera lunghezza del set di estensione è stata innescata con agarosio/A-media, vanificando così il insufflation accidentale di campioni del polmone con aria.
- Riempire il polmone la soluzione di agarosio/A-media fino a quando il polmone è completamente insufflato.
- Una volta che il polmone è completamente insufflato, rimuovere la cannula e legare saldamente il nodo chirurgico per impedire la fuoriuscita della soluzione il agarase/A-media attraverso la trachea.
- Procedere a sezionare la coratella (trachea, cuore e polmone) dalla cavità toracica. Fare attenzione a non puntura o danneggiare la superficie del polmone.
- Posto la coratella (in nessun particolare orientamento) nel pre-refrigerati 30 mL di PBS integrati con 1 X penna/strep e consentire l'agarosio/A-media a solidificare per 20 min.
- Usando bene forbici e pinzette, tagliare piccoli pezzi del polmone (3 x 1,5 mm) come mostrato in Figura 1A. Sezioni più piccole del polmone possono essere imaged facilmente utilizzando un obiettivo X 2.5. Più sezioni possono essere tagliati a condizione sperimentale, in genere 4-10 fette per ogni gruppo.
Nota: Per ogni gruppo sperimentale, sistemare le fettine di polmone in un pozzo separato (piastra a 6 pozzetti) contenente una spugna di gelatina di 2 x 2 cm pre-con B-media. La quantità di supporti per pozzetto deve essere 1,5 mL. Modificare i media ogni 2-3 giorni. Per studi di farmaco, la frequenza di modifica la media/droga è utente determinato.
3. Widefield fluorescenza Imaging di fette di polmone e di analisi
Nota: Per fluorescenza widefield imaging, più piccole fette sono tagliate (3 x 1,5 x 1 mm) al fine di inserirsi nella sezione di polmone 1 immagine utilizzando un obiettivo X 2.5.
Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza widefield:
- Fette del polmone sono in genere imaging a 0, 3, 7 e 14 giorni post-iniezione. Nell'ambiente sterile del gabinetto biologico, trasferire con cautela le fettine di polmone dalla gelatina spugne per un fondo di vetro sterile 35 mm tondo piatto. Aver cura di asciugare il liquido in eccesso dal slice del polmone come il liquido in eccesso sarà agire come uno specchio e riflettono la luce fluorescente provenienti dalle cellule del tumore.
- Disporre le fette di polmone in modo simile, raffigurato in Figura 1A. Ogni colonna rappresenta una diversa condizione sperimentale. Fare attenzione a non cross-contaminare i polmoni con le pinzette. Risciacquare con etanolo al 70% e asciugare prima di maneggiare le fette del polmone da un altro gruppo sperimentale.
- Ottimizzare i parametri di imaging (ie. guadagno, offset, esposizione del tempo, binning) che fornisce il miglior contrasto tra le cellule del tumore fluorescente e tessuto polmonare di sfondo del controllo (veicolo non trattata) gruppo. Utilizzare gli stessi parametri del gruppo di controllo per i gruppi sperimentali di immagine. Salvare come formato di immagine tiff.
- Per un riferimento di scala, è possibile scattare una foto digitale di un micrometro allo stesso obiettivo.
- Poiché polmone auto-fluorescenza cambia nel corso del tempo, i parametri di imaging devono essere adeguati ai polmoni controllo ogni sessione di imaging. I parametri di imaging per una sessione potrebbero non necessariamente essere ottimali per le sessioni successive di formazione immagine.
Analisi dell'immagine:
Nota: Le seguenti fasi di lavorazione di immagine sono fatte con ImageJ 1,51 h software pacchetto 17.
- Aprire un file di immagine in ImageJ (Figura 3A).
- Sfondo di sottrarre: processo > sottrarre sfondo > Rolling raggio della sfera (inizio con 50 pixel), deseleziona "Light Background" (Figura 3B).
- Convertire immagine in 8-bit formato: immagine > tipo > 8 - bit (Figura 3).
- Impostare le unità di pixel: immagine > invio "Pixel" in unità di lunghezza, immettere 1 nella "Larghezza in Pixel", "Altezza in Pixel", "Voxel profondità". La casella "Global" per applicare alle immagini successive.
- Utilizzando lo strumento di selezione poligono, delineare la forma della fetta intero polmone e determinare l'area (pixel2) della sezione totale del polmone. Questo valore verrà utilizzato per calcolare il carico percentuale del tumore del polmone.
- Immagine di soglia: immagine > regolazione > soglia > evidenziare "Predefinito" e "B & W" > usare il cursore soglia l'immagine tale che la maggior parte delle cellule del tumore è evidenziata con precisione. Premere "Applica" si tradurrà in un'immagine in bianco e nero dove il polmone è tutto nero, e le lesioni fluorescenti sono bianche (Figura 3D). Premendo "Apply" una seconda volta sarà invertito l'immagine dove tutte le strutture fluorescenti sono ora forme nere (Figura 3E).
- Quantificazione del numero e della forma delle lesioni:
Analizzare > impostare misure > Verifica "Area". Deselezionare tutte le altre caselle.
Analizzare le particelle > dimensioni (pixel2): 0-infinito rappresenta l'intervallo di forme che enumererà ImageJ. Determinare empiricamente la lesione più piccola che è ritenuta per essere una cellula di singolo tumore nelle immagini di veicolo giorno 0. Utilizzare l'area di questa cella di singolo tumore come limite inferiore per le immagini rimanenti nel set di dati. Per il lavoro presentato in questa carta, 11 pixel2 è impostato come il limite inferiore. Per il lavoro presentato nell'esempio dei video, 24 pixel2 è impostato come il limite inferiore. Lasciare "Circolarità" intervallo 0-1. "Show" può essere impostato su "Nothing". In alternativa, se "Show" e "Contorni" è selezionata, viene generato un disegno di tutte le forme con contorni. Verifica "Visualizza risultati" per una finestra separata di misurazioni di pop-up. Facoltativamente, avere selezionata la casella "Aggiungi al manager" salverà tutte le forme quantificate a un manager di ROI, che possa essere salvato per riferimento futuro. Dopo aver premuto OK, una finestra "Risultati" si aprirà contenente tutte le forme enumerate e misure di zona (Figura 3F). - Copiare e incollare i dati dalla finestra "Risultati" in un foglio di calcolo. Utilizzare la funzione di somma matematica in Excel per sommare tutte le aree delle lesioni metastatiche per quella fetta di particolare del polmone. Per valutare l'onere di tumore del polmone per cento della fetta del polmone, dividere la somma delle aree delle lesioni metastatiche dall'area totale della sezione del polmone. Questo parametro è noto anche come zona frazione (unaA) che è descritto più ulteriormente da Underwood 18.
Carico del tumore del polmone = somma dell'area di aree/totale di lesione metastatica della fetta del polmone - Calcolare il carico del tumore del polmone per il resto delle sezioni del polmone nel gruppo di controllo e restanti gruppi. Tracciare l'onere di tumore polmonare medio per ogni gruppo nel 0, 3, 7 e 14 giorni. Rappresentante widefield immagini fluorescenti delle cellule OS ad alta e bassa metastatiche umane cresce nel modello PuMA a intervalli di tempo progressivo sono visualizzate (Figura 4A). Un grafico di linea che indica il piega-cambiamento (normalizzato al giorno 0) carico percentuale del tumore metastatico nel corso del tempo è mostrato (Figura 4B).
4. formazione immagine di fluorescenza confocale del modello PuMA
Nota: Per l'imaging confocale, elaborare del tessuto è simile a quello nella sezione precedente tranne che fette più grandi del polmone sono tagliati (sezioni trasversale complete, 1-2 mm di spessore) per consentire più ROIs essere imaged.
Etichettatura del parenchima polmonare con DAR4M:
- Immergere le fette di polmone in 10 μμM di DAR4M (in HBSS) per 45 min a 37 ° C. DAR4M etichette di specie reattive dell'azoto all'interno delle cellule del polmone.
- Dopo 45 min di incubazione, sciacquare le fette di polmone con HBSS fresco.
- Mettete la fetta di polmone in un fondo di vetro 35 mm tondo piatto e l'immagine al microscopio confocale.
- I parametri di imaging per le immagini di esempio illustrate nella Figura 5 sono elencati nella tabella 5.
- Acquisire un Z-stack per una regione di interesse. Utilizzare lo spessore di taglio Z suggerito per il campionamento di Nyquist. Un film rappresentativo di uno stack 3D risultati cellule OS fluorescente verde nel tessuto polmonare DAR4M-labeled è fornito in Movie 1 e supplementare Movie 1.
Per le immagini confocal di esempio illustrate nella Figura 5, la sessione di imaging era terminale. Se la formazione immagine longitudinale è necessaria, si consiglia l'uso di un 2-fotone o multi-fotone attrezzata LSM microscopio confocale per l'imaging poiché ci è meno photodamage vivente tessuti19,20.
Cellule MG63 esprimenti di mito-RFP nel modello PuMA di imaging:
- Eseguire il protocollo PuMA come muta nel passaggio 1 e 2 con l'utilizzo di cellule MG63 esprimendo il costrutto di mito-RFP.
- Mettete la fetta di polmone in un fondo di vetro 35 mm tondo piatto e l'immagine al microscopio confocale.
- I parametri di imaging per le immagini di esempio illustrate nella Figura 6 sono elencati nella tabella 6. Un film rappresentativo di uno stack 3D risultati cellule OS fluorescente verde con rosso fluorescenti mitocondri è fornito in 2 film e supplementare Movie 2.
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Representative Results
Microscopia di fluorescenza basso ingrandimento widefield
Per microscopia di fluorescenza widefield delle fette di polmone di PuMA, immagini rappresentative e quantificazione dei dati è mostrati in Figura 2e Figura 4A e B. Le propensioni per linee ad alta e bassa metastatico delle cellule metastatici sono visivamente evidente sui punti di tempo progressivo. Cellule MNNG è in grado di colonizzare in modo efficiente il tessuto polmonare mentre HOS cellule non crescono affatto. Da analisi dell'immagine, dati quantitativi possono essere ottenuti per valutare crescita nel tempo come mostrato nel grafico della Figura 4B. Acquisizione a basso ingrandimento (2.5 X) è preferito al fine di catturare la fetta di intero polmone in un'unica immagine. Questo metodo consente la formazione immagine di batch di un gran numero fette di PuMA.
Microscopia a fluorescenza confocale ad alto ingrandimento
Per microscopia confocal di fette di polmone di PuMA, immagini rappresentative sono illustrati nella Figura 5. Individuali che esprimono eGFP MG63 cellule possono essere visto in Figura 5A in relazione al parenchima polmonare, che viene etichettato per il colorante fluorescente DAR4M in figura 5B. Un'immagine unita è mostrata in Figura 5e una zoomata immagine di una cellula tumorale fluorescente in un recipiente è mostrata nella Figura 5. Film in 3D di Figura 5 e 5D sono mostrati in Movie 1 e supplementare Movie 1, rispettivamente. Confocale imaging delle strutture subcellulari, come i mitocondri sono mostrati in nella figura 6. Espressione di eGFP citosolico permette le cellule del tumore muta in Figura 6A, e i mitocondri etichettati con RFP sono mostrati in Figura 6B. Un'immagine unita si vede in Figura 6. Film in 3D di Figura 6 sono mostrati in 2 film e supplementare Movie 2. Strutture subcellulari quali i mitocondri di imaging è combinabile con altre etichette fluorescenti per studiare biologia degli organelli in cellule metastatiche di OS. Quando si aggiungono più etichette, assicurarsi che le linee laser e i filtri di emissione siano compatibili con la particolare proteina fluoroforo/fluorescente di interesse. Evitare di imaging fluorofori/fluorescente proteine cui eccitazione e spettri di emissione strettamente si sovrappongono.
Figura 1 : Diagramma illustra la cascata metastatica. La cascata metastatica può essere suddiviso in fasi diverse, dilimitazione. (1) tumore metastatico delle cellule lasciando il sito del tumore primario e invade nel parenchima locale; (2) intravasating di cellule del tumore nei vasi sanguigni/linfatico e transito all'interno della circolazione; (3) arresto delle cellule tumorali presso il sito secondario; (4) lo stravaso di cellulare tumore fuori dal microcircolo e la sopravvivenza nel sito secondario; (5) crescita in micrometastases; (6) crescita nei tumori metastatici evidenti vascularized. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Fette di polmone PuMA imaging utilizzando widefield fluorescenza e piattaforme di microscopia di fluorescenza confocale. (A) fette di esempio PuMA sono mostrati in un piatto di 35mm con fondo di vetro. (B) strumentazione del microscopio confocale. (C) immagine di basso ingrandimento esempio di una fetta di PuMA con cellule OS eGFP-espressione. Barra della scala = 0,5 mm. (D) esempio immagine confocale di una sottoregione di una fetta di PuMA. Barra della scala = 100 μm. (*) Parenchima polmonare con l'etichetta rossa di DAR4M (vedi riquadro) e (∇) scegliere cellule MG63 che esprimono eGFP. Barra della scala = 30 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . L'elaborazione di un'immagine a basso ingrandimento di una fetta di PuMA usando ImageJ. (A) immagine di PuMA originale. (B) sottrazione del background. (C) la conversione di un'immagine a 8 bit. (D) la soglia dell'immagine per evidenziare le cellule del tumore fluorescente. (E) inversione dell'immagine. (F) enumerazione di forme discrete e quantificazione delle aree di forma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Basso ingrandimento seriale immagini che mostrano la crescita di basso e altamente metastatico umano OS cellule nel modello PuMA nel corso del tempo. (A) immagini di serie di cellule altamente metastatiche MNNG e basse cellule metastatiche di HOS sono mostrate a 0, 3, 7 e 14 giorni post-iniezione. MNNG cellule sono in grado di crescere meglio nel microambiente polmonare contrariamente alle cellule HOS. Barra della scala = 1 mm (B) Fold-cambiamento nel peso percentuale del tumore metastatico per cellule MNNG e HOS nel tempo vengono visualizzati come grafici a linee. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Microscopia confocal di una fetta di polmone PuMA DAR4M-labeled. Un'immagine rappresentativa confocal di eGFP-esprimendo le cellule MG63 nel tessuto polmonare PuMA etichettata con DAR4M. (A) verde canale mostra cellule MG63 che esprimono eGFP (∇). (B) canale rosso mostrando la tintura di DAR4M associazione a specie reattive dell'azoto nelle cellule di parenchima polmonare. Il colorante mette in evidenza il parenchima polmonare (#) e simili ad un vaso sanguigno (*). Il bordo del PuMA del polmone sezione è denotato (↓). (C) Merged immagine verde e rosso. Barra della scala = 100 μm. (D) un'immagine ingrandita della finestra bianca tratteggiata (da C) Mostra una cellula del tumore in un vaso. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Microscopia confocale dei mitocondri in cellule di osteosarcoma nel modello PuMA. Un'immagine rappresentativa confocale dei mitocondri in cellule MG63 che esprimono eGFP. (A) verde canale mostra cellule MG63 che esprimono eGFP (∇). (B) canale rosso mostrando la RFP localizzata ai mitocondri (*). (C) Merged immagine verde e rosso. Barra della scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Terreni di coltura | Ricetta |
| Completa per i Media (500mL) | • 440 mL DMEM |
| • 50 mL FBS | |
| • 5 mL 10 X soluzione Pen/strep (10000U/mL) | |
| • 5 mL L-Glutammina (200 mM) | |
| A-Media (250mL) | •177.58 mL di acqua sterile |
| • 50 mL 10 X supporti di M-199 | |
| • 15 mL 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio | |
| •2.25 mL di 50mm hydrocortizone | |
| •125 mL di acetato di retinolo 0,4 mg/ml (in acqua sterile) | |
| • 5 mL di soluzione Pen/strep (10000U/mL): 10x | |
| • 50 mL di insulina bovina 10mg/ml | |
| B-media (500ml) | •427.6 mL di acqua sterile |
| • 50 mL 10 X supporti di M-199 | |
| • 15 mL 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio | |
| •2.25 mL di 50mm hydrocortizone | |
| •125 mL di acetato di retinolo 0,4 mg/ml (in acqua sterile) | |
| • 5 mL di soluzione Pen/strep (10000U/mL): 10x | |
| • 50 mL di insulina bovina 10mg/ml |
Tabella 1. Ricette per multimediale completo, A-media, B-media. Ricette per colture cellulari e supporti per il dosaggio di PuMA sono elencati.
| Reagenti di coltura delle cellule | Descrizione | N. di catalogo | Azienda |
| MNNG-HOS | linea di cellulare altamente metastatica OS | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | linea di cellule scarsamente metastatico OS | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | linea di cellulare altamente metastatica OS | N/A | Laboratorio di Amy LeBlanc (NCI) |
| MG63 | linea di cellule scarsamente metastatico OS | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 media | Base supporto per A-media e B-media | 11825015 | ThermoFisher |
| Acqua distillata (sterilizzato) | Componente di A-media & | 15230-147 | ThermoFisher |
| B-media | |||
| 7,5 soluzione di bicarbonato di sodio % | Componente di A-media & | 25080094 | ThermoFisher |
| B-media | |||
| Hydrocortizone | Componente di A-media & | H6909 | Sigma-Franco |
| B-media | |||
| Retinolo acetato-acqua solubile | Componente di A-media & B-media | R0635 - 5MG | Sigma-Franco |
| Soluzione di penicillina/streptomicina 10 X concentrato (10000 U/ml) | Componente di A-media & | 15140122 | ThermoFisher |
| B-mezzi di comunicazione, completa | |||
| Soluzione di insulina bovina (10mg/ml) | Componente di A-media & | I0516 - 5ML | Sigma-Franco |
| B-media | |||
| DMEM, alto glucosio | Base media di completa per i Media | 11965092 | ThermoFisher |
| L-Glutammina (200 mM) | Componente di completa per i Media | 25030081 | ThermoFisher |
| Siero bovino fetale | Componente di completa per i Media | 16000044 | ThermoFisher |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Utilizzato nella coltura delle cellule | 14190144 | ThermoFisher |
| Soluzione di Hank tamponata sali, nessun calcio, senza magnesio, nessun rosso fenolo | Utilizzato per risospendere il pellet cellulare prima dell'iniezione | 14175095 | ThermoFisher |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Utilizzato nella coltura delle cellule | 25200114 | ThermoFisher |
| DAR4M | Usato per etichettare il parenchima polmonare | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabella 2. Reagenti di cultura di cella per A-media, B-media e completare la media. Componenti per media ricette, reagenti e buffer sono elencati con il nome di società e numero di catalogo.
| Materiali | Descrizione | N. di catalogo | Azienda |
| LSM confocale Zeiss 710 | Microscopio confocale LSM dritto | N/A | Zeiss |
| LSM confocale Zeiss 780 | Microscopio confocale LSM invertito | N/A | Zeiss |
| Topi SCID | CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, donna, età 6-8 settimane | N/A | Charles River |
| GelFoam | Utilizzato come supporto per le sezioni di tessuto polmonare | 59-9863 | Apparato di Harvard |
| Infine agarosio | Utilizzato durante l'insufflazione del polmone | 50100 | Lonza |
| siringa da 1 ml con 27 ago del manometro | Utilizzato per l'iniezione della vena della coda | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| siringa da 10 ml | Utilizzato per insufflazione del polmone | 309604 | BD |
| catetere di calibro 20 | Utilizzato durante l'insufflazione del polmone | SR-OX2032CA | TERUMO |
| Set di estensione Abbott IV (30", Sterile) | Utilizzato durante l'insufflazione del polmone | 8342 | Medisca |
| Tamponi imbevuti di alcool | Per cancellare la coda venosa prima dell'iniezione | 326895 | BD |
| Guanti chirurgici sterili | Asceptic consegna dei polmoni del mouse | Varia con la dimensione | Fisherscientific |
| righello di 30 cm | Utilizzato per insufflazione del polmone | Staples | |
| Cavalletto di sostegno per il righello | Utilizzato per insufflazione del polmone | HS29022A | Pipette.com |
| piastra di coltura con fondo di vetro di 35 mm | Utilizzato durante la formazione immagine di fette di polmone | 81158 | Ibidi |
| Traverse assorbenti con barriera impermeabile contro l'umidità | Utilizzato per rivestire l'area di lavoro sterile nella cappa biologica | 56617-014 | VWR |
| Catgut Plain sutura assorbibile | Utilizzato per fissare la trachea cannulata | N/A | Braun |
Tabella 3. Materiali per PuMA. Materiali richiesti per il protocollo di PuMA sono elencati con il nome di società e numero di catalogo.
| Materiali | Descrizione | N. di catalogo | Azienda |
| Micro dissezione Forbici 3.5" retta punte acute | Per sezioni di taglio del polmone | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) lunga seghettata dritto punta Extra delicato 0,5 mm | Per sezioni del polmone manipolare/azienda | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) lunga seghettata leggera curva punta 0,8 mm | Per sezioni del polmone manipolare/azienda | RS5135 | Roboz |
| Pollice di medicazione forcipe; Dentata; Delicati; 4.5" lunghezza; Larghezza punta 1,3 mm | Per dissezione generale | RS-8120 | Roboz |
| Medicazione forcipe 4.5" seghettato 2,2 mm punta larghezza del pollice | Per dissezione generale | RS-8100 | Roboz |
| Extra Fine Micro forbici di dissecante 3,5" retta punte acute, lama 20mm | Per dissezione generale | RS-5880 | Roboz |
| Knapp forbici; Dritto; Sharp-Blunt; Lunghezza lama 27mm; 4" lunghezza totale | Per dissezione generale | RS-5960 | Roboz |
Tabella 4. Strumenti chirurgici per PuMA. Vari strumenti in acciaio inossidabile utilizzati nel protocollo sono elencati con il nome di società e numero di catalogo.
| Parametri | 488 laser | 561 laser | |
| obiettivo | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| potenza | 2% | 2% | |
| Sosta di pixel | 1.61 | 1.61 | |
| Media | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Guadagno master | 820 | 814 | |
| Guadagno digitale | 1 | 0.51 | |
| Offset digitale | -4,5 | -9.24 | |
| Foro stenopeico | 51 | 57 | |
| Filtro sintonizzabile | 496-553 | 570-618 | |
Tabella 5. Parametri per l'imaging confocale di sezioni PuMA DAR4M-labeled. Immagine specifica parametri utilizzati per ottenuto le immagini confocale nella carta corrente sono forniti nella tabella.
| Parametri | 488 laser | 561 laser | |
| obiettivo | Piano-Apochromat 63 x / 1.40 Oil DIC M27 | ||
| potenza | 2% | 2% | |
| Sosta di pixel | 0.6 | 0.6 | |
| Media | 2 (linea) | 2 (linea) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Guadagno master | 449 | 390 | |
| Guadagno digitale | 1 | 1.23 | |
| Offset digitale | 0 | 0 | |
| Foro stenopeico | 136 | 136 | |
| Filtro sintonizzabile | 493-550 | 566-703 | |
Tabella 6. Parametri per l'imaging confocale dei mitocondri cellule MG63 nelle sezioni PuMA. Immagine specifica parametri utilizzati per ottenuto le immagini confocale nella carta corrente sono forniti nella tabella.
Supplementare figura 1: apparato di aspersione di gravità. L'apparato di aspersione di gravità viene utilizzato per insufflazione del polmone con una soluzione liquida di agarosio/A-media a 20 cm di H20 pressione idrostatica. La soluzione di agarosio/A-media è versata nella siringa da 10 mL, che è attaccata da un'estensione di IV insieme alla trachea cannulate (non mostrato). Per favore clicca qui per scaricare questa figura.
Movie 1: rotazione di un'immagine 3D confocale z-stack di OS che esprimono eGFP cellule in una fetta di polmone PuMA DAR4M-labeled. DAR4M (canale rosso) viene utilizzato per evidenziare il parenchima polmonare e che esprimono eGFP cellule MG63 possono anche essere visto (canale verde). Barra della scala = 100 μm. Per favore clicca qui per scaricare questa mossa.
Movie 2: rotazione di un'immagine 3D confocale z-stack dei mitocondri RFP-labeled in OS eGFP-esprimendo le cellule nel modello PuMA. Organelli sottocellulari come mitocondri sono mostrati con etichettati con RFP (canale rosso) in cellule MG63 che esprimono eGFP (canale verde) nel modello PuMA. Barra della scala = 10 μm. Per favore clicca qui per scaricare questa mossa.
Supplementare Movie 1: film in 3D con zoom di una cella di OS metastatico in un vascello nel polmone. Delle cellule che esprimono eGFP MG63 sono mostrata in vaso all'interno del microambiente polmonare. Barra della scala = 30 μM. Per favore clicca qui per scaricare questa mossa.
Supplementare Movie 2: film in 3D con zoom di mitocondri in una cella di OS metastatico nel polmone. I mitocondri etichettati con RFP sono indicati in cellule MG63 nel microambiente del polmone. Barra della scala = 5 μM. Per favore clicca qui per scaricare questa mossa.
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Discussion
Il seguente articolo tecnico descrive alcuni aspetti pratici del modello PuMA nello studio di colonizzazione del polmone in OS. Alcuni passaggi critici nel protocollo dove i ricercatori dovrebbero prestare particolare attenzione sono i seguenti:
a) inserimento di una canula della trachea. La trachea può essere facilmente danneggiata durante la dissezione del muscolo circostante e del tessuto connettivo. Inoltre, l'ago del catetere può essere inserito facilmente attraverso la trachea. Prestare molta attenzione a come la smussatura dell'ago entra la trachea durante l'inserimento della cannula.
b) perforatura o danneggiare la superficie del polmone. Il polmone può essere facilmente bucato o danneggiato con forbici di dissezione durante la rimozione dello sterno ed esponendo la cavità toracica. Prestare attenzione quando la coratella da cavità toracica di dissezione. Perforatura o danneggiare la superficie del polmone causerà l'agarosio/A-media liquidi a fuoriuscire fuori e il polmone si sgonfia.
c) rimuovere il terreno in eccesso da sezioni del polmone mentre imaging. Mezzi liquidi in eccesso che circondano la sezione del polmone possono causare un effetto "specchio" quando hanno visto al microscopio. Il liquido in eccesso può riflettere la luce fluorescente dalle cellule del tumore, quindi esagerando la zona di fluorescenza nell'immagine. Rimozione di fluido in eccesso impedirà questo artefatto nell'immagine. In alternativa, l'artefatto di immagine possa essere rimossi in fase di elaborazione delle immagini.
d) Photodamage dei tessuti viventi. Quando si utilizza una lampadina di mercurio o laser di un microscopio 1-fotone, assicurarsi di limitare il tempo esposto alla luce. La percentuale di intensità/potenza della sorgente luminosa può anche essere ridotta. Sovraesposizione alla sorgente di luce può causare photodamage al tessuto polmonare. Microscopi dotati di diodi luminescenti (LED) o 2-fotone/multi-photon microscopi sarebbe l'ideale perché producono meno photodamage durante gli studi di formazione immagine longitudinali.
Il modello PuMA può essere adattato e modificato per studiare molti aspetti del processo di colonizzazione del polmone. Un'altra variante di questo approccio ex vivo è descritta da van den Bijgaart e colleghi 21. Per gli studi che esaminano gli effetti dell'attività del gene knock-down o anti-metastatiche droga sulla crescita delle cellule del tumore nel polmone, ridimensionamento indietro il numero di cellule iniettate da 5 x 105 a 3 x 105 è consigliato poiché gli effetti dell'intervento possono essere mascherati durante la crescita esponenziale di un innoculum di cella più grande. Parecchi studi hanno utilizzato il modello PuMA per studiare i driver del polmone metastatico progressione 4,5,8,22,23,24. Vari indicatore fluorescente tinture o geni reporter fluorescente utilizzabile per le cellule del tumore di etichetta per accertare i cambiamenti di espressione gene o fisiologia cellulare 8 nel microambiente del polmone.
Una limitazione del modello PuMA include un numero limitato di linee cellulari compatibili. Le linee cellulari stabilizzate compatibili con questo test sono elencate da Mendoza e colleghi 3 . Per linee cellulari di osteosarcoma metastatico ad alta e bassa, le coppie di seguire delle linee clonale delle cellule sono state trovate per crescere e mantenere la loro propensione metastatica nel modello PuMA: cellule umane MG63.3 & MG63 MNNG & 143B e cellule HOS, murina K7M2 e K12 cellule. I ricercatori devono determinare empiricamente o meno le loro linee cellulari possono rimanere vitali nei B-media. Un altro limite da considerare è la durata limitata che del tessuto polmonare può essere mantenuto in vitro. Tessuto polmonare può conservare suoi componenti cellulari per 30 giorni, di là di quel tempo e le componenti cellulari del polmone cominciano a morire. Pertanto lo studio delle interazioni tra cellule tumorali e cellule stromal del polmone non dovrebbe superare 30 giorni.
Il modello PuMA fornisce un metodo senza precedenti per studiare come metastatico OS colonizzano le cellule del tessuto polmonare. L'aspetto più impressionante del modello PuMA deriva dal fatto che parecchie basso metastatico OS linee cellulari (HOS, MG63, K12), cui fenotipi in vivo sono stati caratterizzati altrove 25, non possono crescere nel modello PuMA. Al contrario, clonale cellule altamente metastatiche di OS (MNNG, MG63.3, K7M2) hanno una maggiore propensione per colonizzare il tessuto polmonare in vivo25 e in PuMA modello. Ciò suggerisce che i componenti cellulari ed extracellulari del microambiente polmonare che impediscono la crescita in vivo, di Bassi linee cellulari di OS metastatici sono ancora mantenute nel modello PuMA nonostante la mancanza di flusso sanguigno. In altre parole, il microambiente polmonare del modello PuMA esercita ancora una "pressione di selezione" che impedisce la crescita nel polmone le cellule metastatiche basse di OS. Infatti, cellule OS alte studiare metastatiche crescono in PuMA è stato utile per identificare nuovi driver molecolari del fenotipo metastatico 4,5. Inoltre, giù-modulazione genetica di tali obiettivi in cellule altamente metastatiche è stato indicato per diminuire la capacità metastatica in entrambi il modello di PuMA e in vivo 5. Per gli studi di candidati droga anti-metastatica, il PuMA modello può essere utilizzato per determinare quale intervallo di concentrazione può ridurre la conseguenza metastatica nei tessuti polmonari, che a sua volta, può essere convalidato in vivo.
Applicazioni future di questo modello dovrebbero sfruttare la pletora di coloranti fluorescenti disponibili in commercio e geni reporter per scavare in profondità nella biologia di base di progressione metastasi OS. Ad esempio, le tinture fluorescenti come 2', 7' - il dichlorofluorescin diacetate o diidroetidio utilizzabile per valutare lo stato redox delle cellule del tumore nel modello PuMA. Geni reporter fluorescente possono essere utilizzati per studiare biologia organello o valutare l'attività del promotore per determinare quali vie di segnalazione sono attivate in cellule altamente metastatiche OS durante il processo di colonizzazione. Tali approcci possono essere usati per visualizzare se un trattamento farmacologico ha attività in cellule del tumore cresce nel polmone. Piattaforme di microscopia fluorescente che producono meno photodamage ai tessuti, come microscopi dotati di LED o 2-fotone/multifotonica microscopi confocali, può essere usato studiano come metastatico OS cellule migrano e invadere tutto tessuti polmonari. Inoltre, interazioni di adesione tra cellule tumorali e cellule stromal del polmone possono essere monitorate con geni reporter fluorescente.
Per riassumere, la carta attuale discute gli aspetti pratici del modello PuMA, in primo luogo sviluppato da Mendoza e colleghi 3. È riportato un esempio dell'utilizzo di basso ingrandimento, widefield microscopia a fluorescenza e microscopia confocale ad alta risoluzione per valutare la crescita di cellule umane ad alta e bassa metastatiche di OS. Sono stati descritti diversi passaggi critici del protocollo. Inoltre, sono stati discussi i vantaggi e le limitazioni del modello PuMA. Applicazioni future del modello PuMA per studiare il processo di colonizzazione del polmone sono state proposte, e si spera che questo modello avrà un più ampio uso nella comunità di ricerca di osteosarcoma.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Arnulfo Mendoza che ha fornito addestramento sulla tecnica di PuMA. Inoltre, vorremmo riconoscere la d. ssa Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) per permettere l'utilizzo del loro microscopi nel corso di questo studio. Questa ricerca è stata sostenuta (in parte) dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, centro per la ricerca sul cancro, ramo di oncologia pediatrica. M.M.L. è stato sostenuto dal programma nazionale di istituti di salute intramurale visitando Fellow (premio 15335) e attualmente è supportato da un Fellowship di Parker Joan nella ricerca di metastasi. P.H.S è supportato da British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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