Summary
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.
Abstract
El ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) es un ex vivo el explante de pulmón y el sistema de cultivo de célula cerrada que permite a los investigadores a estudiar la biología de la colonización del pulmón en osteosarcoma (OS) por microscopía de fluorescencia. Este artículo proporciona una descripción detallada del protocolo y discute ejemplos de obtención de datos de imagen en crecimiento metastático con campo amplio o plataformas de microscopia confocal de la fluorescencia. La flexibilidad del modelo PuMA permite a los investigadores a estudiar no sólo el crecimiento de las células de la OS en el microambiente del pulmón, sino también evaluar los efectos de la terapéutica anti-metastásico con el tiempo. La microscopia confocal permite la proyección de imagen de alta resolución, sin precedentes de las interacciones de la célula de OS con la parenquimia de pulmón. Por otra parte, cuando se combina el modelo de PuMA con colorantes fluorescentes o reporteros genético proteína fluorescente, los investigadores pueden estudiar el microambiente del pulmón, las estructuras celulares y subcelulares, funciones de los genes y actividad del promotor en células metastásicas de OS. El modelo PuMA proporciona una nueva herramienta para los investigadores de osteosarcoma a descubrir la nueva biología de la metástasis y evaluar la actividad de nuevas terapias anti-metastásicas, dirigidas.
Introduction
Mejores resultados para los pacientes pediátricos con osteosarcoma metastático (OS) sigue siendo una crítica necesidad clínica 1. Esto subraya la importancia de desarrollar nuevas terapias dirigidas molecularmente. Quimioterápicos convencionales que la proliferación de células de tumor de destino no han demostrado para ser eficaces en el tratamiento de enfermedad metastásica y, por tanto, estrategias novedosas deben apuntar el proceso metastático sí mismo 2. El actual artículo discute los aspectos prácticos de un tipo relativamente nuevo de ex vivo el modelo metástasis de pulmón, el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) desarrollado por Mendoza y colaboradores3, que proporciona una herramienta útil para descubrir nuevas Controladores moleculares en la progresión de la metástasis de pulmón en OS 4,5. Antes, sin embargo, sería prudente mencionar brevemente varios modelos actuales de la metástasis y cómo el modelo PuMA ofrece varias ventajas sobre los convencionales en vitro ensayos.
Modelos más experimentales utilizados para estudiar la metástasis forman parte de sistemas in vitro e in vivo que recapitulan un determinado paso o varios pasos de la cascada metastásica. Estos pasos incluyen: células de tumor 1) migrar lejos el tumor primario, 2) intravasación en vasos cercanos (arterial o linfática) y tránsito dentro de la circulación, 3) detener en el sitio secundario, 4) la extravasación y la supervivencia en el sitio secundario, 5) formación de micrometástasis y 6) crecimiento en metástasis vascularizadas (figura 1). Modelos in vitro de la metástasis pueden incluir migración (2D) 2 dimensiones y 3 dimensiones (3D) ensayos de invasión de Matrigel cuales son revisados en detallan en otra parte 6. Para los modelos en vivo , los dos sistemas modelo utilizados incluyen: 1) el modelo de metástasis espontáneas es donde las células de un tumor son orthotopically inyectado en un tipo de tejido específico para formar un tumor local que espontáneamente arroja las células metastásicas a sitios distantes; 2) el modelo experimental de metástasis es donde las células del tumor se inyectan en los vasos sanguíneos contra la corriente del órgano blanco. Por ejemplo, una cola vena inyección de células de tumor en el pulmón de desarrollo metástasis5,7,8. Otros modelos de metástasis experimentales incluyen la inyección de las células del tumor en el bazo o en la vena mesentérica que se traduce en el desarrollo de las metástasis del hígado9,10. Consideraciones prácticas de estos modelos en vivo se discuten en detalle por Welch 11. Otro en vivo modelo usado para estudiar la metástasis en sarcomas pediátricos es el modelo de implantación del tumor subcapsular renal riñones que resulta en la formación local del tumor y la metástasis espontánea a los pulmones 12,13. Una técnica más técnicamente exigente como videomicroscopía intravital puede visualizar directamente, en tiempo real, interacciones entre las células de cáncer metastásico y la microvascularización de un sitio metastásico (es decir. pulmón o hígado) descrito por MacDonald14 y Entenberg15o extravasación de células de cáncer en la membranas corioalantoideas como descrito por Kim 16.
El modelo de PuMA es una ex vivo, explantes de tejido pulmonar, el sistema de cultivo cerrado donde el crecimiento de las células del tumor fluorescente puede longitudinalmente observar mediante microscopía de fluorescencia durante un período de un mes (ver figura 2A). Este modelo recoge las etapas iniciales de la colonización del pulmón (pasos 3 a 5) en la cascada metastásica. Algunas ventajas importantes del modelo PuMA sobre modelos convencionales en vitro son: 1) ofrece una oportunidad para medir el crecimiento de la célula de cáncer metastásico en un microambiente 3D que conserva muchas características del microambiente pulmón longitudinalmente en vivo 3; 2) puMA permite al investigador evaluar si la caída de un candidato gene o droga tiene actividad anti-metastásico en el contexto de un microambiente de pulmón 3D; 3) el modelo de PuMA es flexible con muchos tipos de plataformas de la microscopia de la fluorescencia (figura 2B) como microscopía de fluorescencia de campo amplio o microscopia confocal de láser, ejemplos de cada uno se muestran en la figura 2 y D, respectivamente. Este artículo discutirá cómo utilizar el modelo de PuMA para obtener datos de imágenes longitudinales sobre el crecimiento metastásico de mayor proteína verde fluorescente (eGFP)-expresar, las células de osteosarcoma metastásico altas y bajas humanas (MNNG y HOS células, respectivamente) mediante fluorescencia de campo amplio de baja magnificación. También se discuten ejemplos de la imagen un tinte fluorescente que las etiquetas de la parenquimia de pulmón y una proteína fluorescente roja reportero genética que etiquetas mitocondrias en OS de células en el modelo de PuMA con microscopía de escaneo láser confocal.
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Protocol
Todos los protocolos de animal de que se obtuvieron datos de proyección de imagen fueron realizados con la aprobación del cuidado Animal y uso Comité de Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud. Todos los protocolos animales discuten y retratado en el artículo video han sido aprobados por el Comité de cuidado Animal de Universidad de British Columbia.
1. preparación de las células tumorales para la inyección y materiales para el modelo de PuMA
Nota: La cantidad de soluciones y células será suficiente para 1 ratón. Ampliar según sea necesario si más ratones se utilizan en el estudio. Recetas de medios de comunicación, consulte la tabla 1 y tabla 2.
- Precalentar 5 mL de un-Media en un tubo cónico de 15 mL en un baño de agua de 37 oC.
- Derretir la solución 1.2% baja fusión agarosa (en agua estéril) usando el microondas de laboratorio.
- Transferir 5 mL de agarosa fundido en un tubo cónico de 15 mL y calentarse en baño María a 37 oC. Asegúrese de que la agarosa fundida está a 37 oC y líquido antes del paso de insuflación pulmonar.
- Pre-enfriar 30 mL de grado cultivo celular PBS suplementado con 1 X pluma/estreptococos en un cubo de hielo.
- En un pocillo de una placa de 6 pozos, pre-empape una esponja de gelatina en 1,5 mL de B-medios de comunicación. La esponja será el ancla de apoyo para las lonchas de pulmón.
- Las células OS sean unos 70-90% confluente en el día del procedimiento. No utilice las células confluentes excesivamente o si los medios de comunicación son de color naranja a amarillo ya que las células generalmente se estresan y han disminuido la viabilidad en este punto. Para las líneas celulares de osteosarcoma, MNNG y HOS, 5 x 105 en un volumen de 100 μL se utilizará para inyectar en la vena de la cola del 1 ratón. De lujo por consiguiente si más ratones se utilizan para el estudio.
- Las células del tumor usando 0.25% tripsina-EDTA (3 mL para un frasco de T75 o 2 mL en una placa de cultivo de 10 cm) de la cosecha. Cuando las células están comenzando a levantar la placa, neutralizar el tripsina-EDTA con los medios de comunicación completa. Desactivación de las células y enjuague una vez con grado cultivo celular PBS. Resuspender el precipitado en 5 mL de PBS.
- Realizar un recuento de células por métodos estándar. Es mejor hacer la suspensión más de lo que realmente se necesita desde pérdida de suspensión de células a menudo se produce durante la confección de la aguja e inyección intentos fallidos.
- Realizar un análisis de exclusión azul de tripano en una muestra de la suspensión de células para evaluar la viabilidad de las células. Proceda sólo si la celda Mostrar viabilidad 90% o superior.
- Inyectar 5 x 105 células en un volumen de 100 μL. Para preparar un exceso de 2 X de esta cantidad, 1 x 106 células deben girar hacia abajo y resuspendió en 0,2 mL de HBSS.
- Colocar suspensión celular en un cubo de hielo mientras se preparan los ratones para la inyección.
2. inyección en la vena y la insuflación pulmonar la cola
Nota: La cantidad de soluciones y células en esta sección será suficiente para 1 ratón. Ampliar según sea necesario si más ratones se utilizan en el estudio. Para una lista de los equipos, materiales y los instrumentos quirúrgicos utilizados en los pasos siguientes, consulte la tabla 3 y tabla 4.
- Caliente un ratón hembra (edad 6-8 semanas) bajo una lámpara de calentamiento durante 5 minutos para hacer la cola de la vena más visible aparente. Para las células murinas de K7M2 o K12, usar ratones Balb/c; para MG63.3 humano, células MG63, MNNG y HOS, usar ratones de inmunodeficiencia combinada severa.
- Asegúrese de que la suspensión de células es uniforme agitando suavemente el tubo. Elaborar cuidadosamente la suspensión de células en la jeringa de 1 mL sin la aguja. Aguja g tapa la jeringa con un 27. Asegúrese de que el bisel de la aguja está en el mismo lado que las marcas de volumen de la aguja.
- Coloque el ratón en el limitador y limpiar la cola con un paño con alcohol.
- Proceder a realizar una inyección de la vena de la cola e inyectar 100 μL de la suspensión de células. 5 minutos después de la inyección, coloque el ratón en una cámara de2 CO y comenzar el procedimiento de funcionamiento estándar de eutanasia (como esquema por su Comité institucional de cuidado animal). Dislocación cervical no debería utilizarse como una forma de eutanasia ya que lo daña la tráquea.
- Una vez que el ratón es eutanasia, comienzan la preparación de la campana de flujo laminar para la insuflación del pulmón del ratón con la solución de agarosa/un-media. Dentro de la campana de flujo laminar, establecer un área de trabajo con su pad estéril. En esta almohadilla colocará sus instrumentos esterilizados, catéter IV, IV extensión fijada y aparato de perfusión de gravedad (véase figura 1 complementaria).
- Coloque el ratón en recumbancy dorsal. Con pequeñas tijeras estériles, diseccionar cuidadosamente hacia fuera el esternón para exponer la cavidad torácica. Tenga cuidado de no perforar el pulmón ya que se utilizará una solución de agarosa/un-media para insuflar el pulmón.
- Cuando la disección por el esternón, disecar más allá de la entrada torácica a ambos lados la tráquea. Exponer la tráquea por disección a los tejidos blandos circundantes.
- Canule la tráquea con un catéter IV de 20 calibre. Sin apretar un nudo quirúrgico mediante sutura catgut estéril alrededor de la tráquea canulada.
- Instale una extensión de IV de la tráquea cateterizada en la jeringa de 10 mL de los aparatos de perfusión de gravedad.
- Combinar la agarosa al precalentado 37 oC (5 mL) y un-media (5 mL) en una mezcla 1:1. Verter la solución de agarosa/un-media líquida en la jeringa de 10 mL del dispositivo de perfusión de gravedad. Antes de la insuflación de los pulmones con la solución de agarosa/un-media, asegúrese de que toda la longitud de la extensión fijada ha sido preparada con agarosa/un-media, negando tal modo insuflación accidental de muestras de pulmón con el aire.
- Llenar los pulmones de la solución de agarosa/un-media hasta que los pulmones se insuflan completamente.
- Una vez que los pulmones se insuflan completamente, retire la cánula y atar firmemente el nudo quirúrgico para evitar la fuga de la solución de agarase/un-media a través de la tráquea.
- Proceda a disecar hacia fuera el pluck (tráquea, corazón y pulmón) de la cavidad torácica. Tenga cuidado de no perfore o dañar la superficie del pulmón.
- Lugar el pluck (en ninguna orientación particular) en el pre enfriado 30 mL de PBS suplementado con 1 X pluma/strep y permiten el agarosa, un-media solidificar por 20 min.
- Usando tijeras finas y pinzas, cortadas pequeños trozos de pulmón (3 x 1,5 mm) como se muestra en la figura 1A. Pequeñas lonchas de pulmón pueden ser reflejadas fácilmente usando un objetivo de X 2.5. Varias rebanadas pueden cortarse por condición experimental, por lo general 4-10 rebanadas por grupo.
Nota: Para cada grupo experimental, colocar las lonchas de pulmón en un pozo independiente (placa de 6 pozos) que contiene una esponja de gelatina de 2 x 2 cm previamente empapada en B-medios de comunicación. La cantidad de medios de comunicación por el bien debe ser 1,5 mL. Cambiar el medio cada 2-3 días. Para estudios de medicamentos, la frecuencia de cambio de las medios de comunicación y las drogas es usuario determinado.
3. imágenes de fluorescencia Widefield de lonchas de pulmón y el análisis
Nota: Para fluorescencia de campo amplio imágenes, pequeñas rebanadas se cortan (3 x 1,5 x 1 mm) para ajustar la sección del pulmón en 1 imagen con un objetivo X 2.5.
Adquisición de imágenes en un microscopio de fluorescencia de campo amplio:
- Lonchas de pulmón son típicamente reflejadas en 0, 3, 7 y después de la inyección 14 días. En el ambiente estéril del gabinete biológico, transferir cuidadosamente los trozos de pulmón de la gelatina de esponjas para un fondo de cristal de 35 mm estéril ronda plato. Tenga cuidado de dab fuera el exceso de líquido de la rebanada del pulmón como el exceso de líquido actuará como un espejo y reflejar la luz fluorescente proveniente de las células del tumor.
- Arreglar los trozos de pulmón de manera similar, representada en la figura 1A. Cada columna representa una diversa condición experimental. Tenga cuidado de no Cruz-contaminar los pulmones con las pinzas. Enjuagar con etanol al 70% y seca antes de manipular segmentos de pulmón de otro grupo experimental.
- Optimizar los parámetros de proyección de imagen (es decir. ganancia, offset, exposición tiempo, binning) que ofrece el mejor contraste entre las células del tumor fluorescente y tejido pulmonar de fondo del control (vehículo sin tratamiento) grupo. Utilice los mismos parámetros del grupo de control para los grupos experimentales de la imagen. Guardar como formato de imagen tiff.
- Para una referencia de escala, tomar una foto digital de un micrómetro en el mismo objetivo.
- Desde pulmón auto-fluorescencia cambia con el tiempo, los parámetros de proyección de imagen se deben ajustar a los pulmones control cada sesión de imagen. Los parámetros de proyección de imagen para una sesión podrán no necesariamente ser óptimos para posteriores sesiones de proyección de imagen.
Análisis de la imagen:
Nota: Los siguientes pasos del proceso de imagen se realizan con ImageJ 1,51 h software paquete 17.
- Abrir un archivo de imagen en ImageJ (Figura 3A).
- Quitar fondo: proceso > restar fondo > radio bola de balanceo (inicio con 50 píxeles), desmarque "Luz de fondo" (figura 3B).
- Convertir imagen a formato de 8 bits: imagen > tipo > 8 bits (figura 3).
- Establece las unidades en píxeles: imagen > Enter "Píxeles" en la unidad de longitud, escriba 1 en "Píxeles altura de la anchura","Pixel", "Profundidad de Voxel". La casilla "Global" para aplicar a las imágenes posteriores.
- Con la herramienta de selección de polígono, delinear la forma de la rebanada del pulmón entero y determinar el área (pixel2) de la división pulmonar total. Este valor se utilizará para calcular la carga por ciento tumor del pulmón.
- Imagen de umbral: imagen > ajustar > umbral > destacar "Por defecto" y "B & W" > Utilice el control deslizante al umbral de la imagen que la mayoría de las células del tumor se destaca con precisión. Pulsar "Aplicar" se traducirá en una imagen en blanco y negro donde el pulmón es todo negro, y las lesiones fluorescentes son de color blancas (figura 3D). Al presionar "Aplicar" una segunda vez se invierta la imagen donde todas las estructuras fluorescentes ahora son formas negras (figura 3E).
- Cuantificación del número y forma de las lesiones:
Analizar > establecer medidas > Compruebe "Área". Desactive todas las casillas.
Analizar partículas de > tamaño (pixel2): 0-infinito representa la gama de formas que enumerar ImageJ. Determinar empíricamente la lesión más pequeña que se considera que una célula solo tumor en imágenes del vehículo de día 0. Utilizar el área de esta célula de tumor único como el límite inferior para las restantes imágenes del conjunto de datos. El trabajo presentado en este documento, se establece como el límite inferior 11 pixel2 . El trabajo presentado en el video ejemplo, 24 pixel2 se establece como el límite inferior. Va gama de "Circularidad" como 0-1. "Show" puede establecerse en "Nada". Por otra parte, si se selecciona "Show" y "Contornos", se genera un dibujo de todas las formas de contorno. Comprobar "Mostrar resultados" para una ventana independiente de mediciones a pop-up. Opcionalmente, tener marcada la casilla "Add to manager" guardará todas las formas cuantificadas a un encargado del retorno de la inversión, que puede guardarse para referencia futura. Después de pulsar OK, aparecerá una ventana de "Resultados" hasta que contenga todas las formas enumeradas y medidas de área (figura 3F). - Copiar y pegar los datos desde la ventana de "Resultados" en una hoja de cálculo. Utilice la función matemática de suma en Excel para sumar todas las áreas de las lesiones metastáticas por ese trozo de pulmón particular. Para evaluar la carga de tumor pulmonar por ciento del segmento de pulmón, dividir la suma de las áreas de lesiones metastásicas por el área total del trozo de pulmón. Este parámetro es también conocido como fracción del área (unA) que se describe más lejos por Underwood 18.
Carga del tumor de pulmón = suma del área de áreas/total de lesión metastática de rebanada de pulmón - Calcular la carga de tumor de pulmón para el resto de las secciones del pulmón en el grupo control y los restantes grupos. Parcela la carga del tumor pulmonar promedio por grupo sobre 0, 3, 7 y 14 días. Imágenes fluorescentes representante widefield de alta y baja metastásicas células humanas de OS en el modelo de PuMA en tiempo progresivo se muestran (Figura 4A). Un gráfico de línea que muestra el cambio de doblez (normalizado a día 0) en carga del tumor metastásico por ciento con el tiempo se muestra (Figura 4B).
4. proyección de imagen de confocal de la fluorescencia del modelo PuMA
Nota: Para la proyección de imagen confocal, las procesamiento de tejido es similar a la de la sección anterior excepto que lonchas de pulmón más grandes se cortan (secciones transversales completas, 1-2 mm de espesor) para permitir más ROIs a ser reflejada.
Etiquetado de parénquima pulmonar con DAR4M:
- Sumerja las rebanadas del pulmón en 10 μμM de DAR4M (en HBSS) por 45 min a 37 ° C. DAR4M etiquetas de especies de nitrógeno reactivo dentro de las células del pulmón.
- Después de 45 minutos de incubación, lavar los trozos de pulmón con HBSS fresco.
- Coloque el trozo de pulmón en un fondo de cristal de 35 mm redonda de plato y la imagen en el microscopio confocal.
- Los parámetros de proyección de imagen para las imágenes de ejemplo que se muestra en la figura 5 se enumeran en la tabla 5.
- Adquirir una pila de Z para una región de interés. Use el espesor de corte sugerido de Z para el muestreo de Nyquist. Una película representativa de una pila de 3D mostrando células de OS fluorescentes verdes en el tejido pulmonar marcada con DAR4M se suministra en 1 película y 1 película suplementario.
Para las imágenes confocales de ejemplo que se muestra en la figura 5, la sesión de imágenes era terminal. Si la proyección de imagen longitudinal se requiere, se recomienda el uso de un 2-fotón o varios fotones confocal LSM microscopio equipado para la proyección de imagen ya que hay menos fotodaño a la vida de los tejidos19,20.
Proyección de imagen de mito-RFP expresando MG63 las células en el modelo de PuMA:
- Realizar el protocolo de PuMA como contorno en paso 1 y 2 con el uso de células MG63 expresando la construcción del mito-RFP.
- Coloque el trozo de pulmón en un fondo de cristal de 35 mm redonda de plato y la imagen en el microscopio confocal.
- Los parámetros de proyección de imagen para las imágenes de ejemplo que se muestra en la figura 6 se muestran en la tabla 6. Una película representativa de una pila de 3D mostrando verde fluorescente OS las células con mitocondrias fluorescentes es siempre de rojo en la película 2 y adicional 2 de la película.
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Representative Results
Microscopía de fluorescencia de campo amplio de baja magnificación
Para microscopía de fluorescencia de campo amplio de lonchas de pulmón PuMA, imágenes representativas y cuantificación de datos se muestra en la figura 2y Figura 4A y B. Las propensiones metastásicas para líneas de alta y baja metastático de la célula son visualmente evidentes momentos progresivo. Las células MNNG eficientemente pueden colonizar el tejido pulmonar mientras que las células HOS no crecen en absoluto. De análisis de imagen, se pueden obtener datos cuantitativos para evaluar el crecimiento en el tiempo como se muestra en el gráfico de la Figura 4B. Adquisición en baja magnificación (2,5 X) es el preferido para captar el segmento de pulmón entero en una sola imagen. Este método permite la proyección de imagen por lotes de un gran número rebanadas de PuMA.
Microscopía de fluorescencia confocal de alta magnificación
Para la microscopia confocal de lonchas de pulmón PuMA, imágenes representativas se muestran en la figura 5. Las células MG63 expresaban eGFP individuales pueden verse en la figura 5A en relación con el parénquima pulmonar, que es por el tinte fluorescente de DAR4M en la figura 5B. Una imagen combinada se muestra en la figura 5y un zoom imagen de una célula tumoral fluorescente en un recipiente se muestra en la figura 5. Películas en 3D de la figura 5 y 5 D se muestran en 1 película y 1 película suplementario, respectivamente. Imagen confocal de estructuras subcelulares como las mitocondrias aparecen en figura 6. Expresión de eGFP citosólica permite que las células del tumor del esquema en la figura 6A, y las mitocondrias con RFP se muestran en la Figura 6B. Una imagen fusionada se observa en la figura 6. Películas en 3D de la figura 6 se muestran en la película 2 y adicional 2 de la película. Imágenes de estructuras subcelulares como las mitocondrias pueden combinarse con otras etiquetas fluorescentes para estudiar la biología del orgánulo en las células metastásicas del OS. Al agregar más etiquetas, asegúrese de que las líneas de láser y filtros de emisión son compatibles con la proteína fluorescente fluoróforo particular de interés. Evitar la proyección de imagen fluorescente fluoróforos proteínas cuya excitación y espectros de emisión se superponen estrechamente.
Figura 1 : Diagrama ilustrando la cascada metastásica. La cascada metastásica puede dividirse en varios, pasos Tarifa-limitación. (1) metástasis tumor las células dejando el sitio del tumor primario e invade en la parenquimia local; (2) tumor intravasating de células en los vasos sanguíneo/linfático y tránsito dentro de la circulación; (3) detención de la célula el tumor en el sitio secundario; (4) extravasación de células tumor fuera de la microvasculatura y la supervivencia en el sitio secundario; (5) crecimiento en micrometástasis; (6) crecimiento en tumores metastásicos abiertos vascularizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Lonchas de pulmón PuMA de la proyección de imagen usando fluorescencia de campo amplio y plataformas de microscopía de fluorescencia confocal. (A) rebanadas de PuMA el ejemplo se muestran en un plato de 35 mm de fondo de cristal. (B) equipo de microscopio confocal. (C) imagen de baja magnificación ejemplo de una rebanada de PuMA con células de OS expresión de eGFP. Scalebar = 0,5 mm. (D) confocal imagen de ejemplo de una subregión de un trozo de PuMA. Scalebar = 100 μm. (*) Parénquima pulmonar se etiqueta roja por DAR4M (ver recuadro) y (∇) señalan a las células MG63 expresaban eGFP. Scalebar = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Procesamiento de una imagen de baja magnificación de una rebanada de PuMA con ImageJ. (A) imagen de PuMA original. B sustracción de fondo. (C) conversión en una imagen de 8 bits. (D) umbral la imagen para resaltar las células del tumor fluorescente. (E) inversión de la imagen. F enumeración de formas discretas y cuantificación de las áreas de la forma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Imágenes seriales de bajo aumento que muestra el crecimiento de OS humanos bajo y altamente metastático de las células en el modelo de PuMA con el tiempo. (A) serie imágenes de células altamente metastáticas de MNNG y bajo células metastásicas de HOS aparecen en 0, 3, 7 y después de la inyección 14 días. MNNG las células son capaces de crecer mejor en el microambiente de pulmón a diferencia de las células HOS. Scalebar = 1 mm. (B) cambio de doblez de carga porcentaje de tumor metastático de células MNNG y HOS con el tiempo se muestran como gráficos de línea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Microscopia confocal de un trozo de pulmón PuMA marca DAR4M. Una imagen representativa confocal de células MG63 eGFP-expresión en tejido pulmonar de PuMA con DAR4M. (A) canal verde mostrando células MG63 expresaban eGFP (∇). (B) canal rojo con el tinte de DAR4M vinculante a las especies de nitrógeno reactivo en las células del parénquima pulmonar. El tinte resalta la parenquimia de pulmón (#) y las estructuras que se asemejan a un vaso sanguíneo (*). El borde del PuMA sección del pulmón es denotado (↓). Combinada (C) imagen de verde y rojo. Scalebar = 100 μm. (D) una imagen ampliada de la caja blanca discontinua (de C) muestra una célula tumoral en un recipiente. Scalebar = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : La microscopia confocal de la mitocondria en las células de osteosarcoma en el modelo PuMA. Una imagen confocal representativa de mitocondrias en las células MG63 expresaban eGFP. (A) canal verde mostrando células MG63 expresaban eGFP (∇). (B) canal rojo de la RFP localizada en las mitocondrias (*). Combinada (C) imagen de verde y rojo. Scalebar = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios de cultivo | Receta |
| Media completa (500mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X pluma/strep solución 10000U/mL | |
| •5 mL L-glutamina (200 mM) | |
| A-los medios de comunicación (250mL) | •177.58 mL de agua estéril |
| •50 mL 10 X media M-199 | |
| •15 mL 7.5% de solución de bicarbonato de sodio | |
| •2.25 mL de hidrocortisona de 50 mM | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetato (agua estéril) | |
| •5 mL de 10 X pluma/strep solución 10000U/mL | |
| •50 mL de insulina bovina de 10mg/ml | |
| B-los medios de comunicación (500ml) | •427.6 mL de agua estéril |
| •50 mL 10 X media M-199 | |
| •15 mL 7.5% de solución de bicarbonato de sodio | |
| •2.25 mL de hidrocortisona de 50 mM | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetato (agua estéril) | |
| •5 mL de 10 X pluma/strep solución 10000U/mL | |
| •50 mL de insulina bovina de 10mg/ml |
Tabla 1. Recetas para los medios de información, A-los medios de comunicación, B medios de comunicación. Recetas para el cultivo celular y los medios de comunicación para el ensayo de PuMA se enumeran.
| Reactivos de cultivo celular | Descripción | Catálogo no. | Empresa |
| MNNG HOS | línea de celular OS altamente metastático | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | línea de celular OS mal metastásico | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | línea de celular OS altamente metastático | N / A | Amy LeBlanc laboratorio (NCI) |
| MG63 | línea de celular OS mal metastásico | CRL-1427 | ATCC |
| 10 medios de X M199 | Base media de un media y B-los medios de comunicación | 11825015 | Thermofisher |
| Agua destilada (esterilizado) | Componentes de los medios de comunicación A & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-los medios de comunicación | |||
| 7.5 solución de bicarbonato de sodio % | Componentes de los medios de comunicación A & | 25080094 | Thermofisher |
| B-los medios de comunicación | |||
| Hidrocortisona | Componentes de los medios de comunicación A & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-los medios de comunicación | |||
| Retinol acetato-agua soluable | Componente de los medios de comunicación A & B-los medios de comunicación | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Solución de penicilina/estreptomicina 10 X concentrado (10000 U/ml) | Componentes de los medios de comunicación A & | 15140122 | Thermofisher |
| B-los medios de comunicación, medios completo | |||
| Insulina bovina solución 10mg/ml | Componentes de los medios de comunicación A & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-los medios de comunicación | |||
| DMEM, glucosa alta | Base media de medios completo | 11965092 | Thermofisher |
| L-glutamina (200 mM) | Componente de medios completo | 25030081 | Thermofisher |
| Suero bovino fetal | Componente de medios completo | 16000044 | Thermofisher |
| Fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina | Utilizado en cultivo celular | 14190144 | Thermofisher |
| Sales solución de Hank tampón, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol | Utiliza para Resuspender el precipitado de células antes de la inyección | 14175095 | Thermofisher |
| Tripsina-EDTA (0.25%), rojo de fenol | Utilizado en cultivo celular | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Utilizó para etiquetar la parenquimia de pulmón | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabla 2. Reactivos de cultivo de células para un-media, B-medios de comunicación y completar los medios de comunicación. Componentes para recetas de medios, reactivos y tampones figuran con nombre de compañía y número de catálogo.
| Materiales | Descripción | Catálogo no. | Empresa |
| LSM Confocal Zeiss 710 | Microscopio confocal vertical de LSM | N / A | Zeiss |
| LSM Confocal Zeiss 780 | Microscopio confocal invertido de LSM | N / A | Zeiss |
| Ratones de SCID | CABECEO. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, mujer, edad 6-8 semanas | N / A | Río Charles |
| GelFoam | Utiliza como soporte para las secciones de tejido pulmonar | 59-9863 | Aparato de Harvard |
| SeaPlaque agarosa | Utilizado durante la insuflación del pulmón | 50100 | Lonza |
| jeringa de 1 ml con 27 medidor de aguja | Utilizado para la inyección de la vena de la cola | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| jeringa de 10 ml | Utilizado para la insuflación del pulmón | 309604 | BD |
| catéter de calibre 20 | Utilizado durante la insuflación del pulmón | SR-OX2032CA | Terumo |
| El juego de extensión IV Abbott (30", estéril) | Utilizado durante la insuflación del pulmón | 8342 | Medisca |
| Hisopos de alcohol | Para limpiar la cola de la vena antes de la inyección | 326895 | BD |
| Guantes quirúrgicos estériles | Entrega de aséptica de los pulmones de ratón | Varía con el tamaño | Fisherscientific |
| regla 30 cm | Utilizado para la insuflación del pulmón | Grapas | |
| Soporte para regla | Utilizado para la insuflación del pulmón | HS29022A | Pipette.com |
| placa de cultivo con fondo de cristal de 35 mm | Durante la proyección de imagen de cortes de pulmón | 81158 | Ibidi |
| Protectores absorbentes con barrera de humedad resistente al agua | Utilizado para el área de trabajo estéril en la campana biológica | 56617-014 | VWR |
| Sutura absorbible Catgut llano | Utilizado para amarrar la tráquea canulado | N / A | Braun |
Tabla 3. Materiales para el PuMA. Se indican los materiales necesarios para el protocolo de PuMA con el nombre de compañía y número de catálogo.
| Materiales | Descripción | Catálogo no. | Empresa |
| Tijeras de disección micro 3.5" recta aguda/aguda | Para cortar secciones de pulmón | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) largo dentado recto punta de 0,5 mm Extra delicada | Para secciones del pulmón de manipulación/explotación | RS-5132 | Roboz |
| Punta de 0,8 mm largo filo curva leve 4"(10 cm) | Para secciones del pulmón de manipulación/explotación | RS5135 | Roboz |
| Pulgar vestirse fórceps; Serrado; Delicado; 4.5" de longitud; Punta de 1,3 mm. | Para la disección general | RS-8120 | Roboz |
| Pulgar vestirse pinzas dentadas de 4.5" 2,2 punta mm. | Para la disección general | RS-8100 | Roboz |
| Extra fino Micro disecante tijeras 3.5" recta aguda/Sharp, hoja 20mm | Para la disección general | RS-5880 | Roboz |
| Tijeras de Knapp; Recto; Sharp-Blunt; 27mm longitud de la lámina; 4" longitud total | Para la disección general | RS-5960 | Roboz |
Tabla 4. Instrumentos quirúrgicos para PuMA. Varios instrumentos de acero inoxidable utilizados en el protocolo aparecen con el nombre de compañía y número de catálogo.
| Parámetros | láser de 488 | 561 láser | |
| objetivo | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| energía | 2% | 2% | |
| Detención de pixel | 1.61 | 1.61 | |
| Promedio | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Principal ganancia | 820 | 814 | |
| Ganancia digital | 1 | 0.51 | |
| Offset digital | -4,5 | -9.24 | |
| Agujero de alfiler | 51 | 57 | |
| Filtro sintonizable | 496-553 | 570-618 | |
Tabla 5. Parámetros para la proyección de imagen confocal de secciones de PuMA DAR4M-etiquetados. Parámetros imagen específica obtenidos las imágenes confocales en el actual documento se proporcionan en la tabla.
| Parámetros | láser de 488 | 561 láser | |
| objetivo | Plan-Apochromat 63 x 1.40 DIC M27 de aceite | ||
| energía | 2% | 2% | |
| Detención de pixel | 0.6 | 0.6 | |
| Promedio | 2 (línea) | 2 (línea) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Principal ganancia | 449 | 390 | |
| Ganancia digital | 1 | 1.23 | |
| Offset digital | 0 | 0 | |
| Agujero de alfiler | 136 | 136 | |
| Filtro sintonizable | 493-550 | 566-703 | |
Tabla 6. Parámetros para la proyección de imagen confocal de mitocondrias células MG63 en PuMA en. Parámetros imagen específica obtenidos las imágenes confocales en el actual documento se proporcionan en la tabla.
Suplementario Figura 1: aparato de perfusión de gravedad. El aparato de perfusión de la gravedad se utiliza para insuflar el pulmón con una solución de agarosa/un-media líquida a 20 cm de H20 presión hidrostática. Se vierte la solución de agarosa/un-media en la jeringa de 10 mL, que se une por una extensión de IV en la tráquea canulada (no mostrada). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Película 1: rotación de una imagen confocal 3D z-pila del OS expresaban eGFP células en un trozo de pulmón PuMA marca DAR4M. DAR4M (canal rojo) se utiliza para resaltar la parenquimia de pulmón y células MG63 eGFP-expresión también pueden ser visto (canal verde). Scalebar = 100 μm. Haga clic aquí para descargar esta.
Película 2: rotación de una imagen confocal 3D z-stack de mitocondrias etiqueta RFP en OS eGFP expresar las células en el modelo PuMA. Orgánulos subcelulares como las mitocondrias aparecen etiquetados con RFP (canal rojo) en células MG63 expresión de eGFP (canal verde) en el modelo de PuMA. Scalebar = 10 μm. Haga clic aquí para descargar esta.
Adicional 1 de la película: película 3D ampliada de una célula metastásica de OS en un vaso en el pulmón. Una célula de MG63 expresaban eGFP se muestra en recipiente dentro del microambiente de pulmón. Scalebar = 30 μM. Haga clic aquí para descargar esta.
Adicional 2 de la película: película 3D zoom de mitocondrias en una célula OS metastática en el pulmón. Mitocondrias con RFP aparecen en células MG63 en el microambiente del pulmón. Scalebar = 5 μM. Haga clic aquí para descargar esta.
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Discussion
El siguiente artículo técnico describe algunos aspectos prácticos del modelo PuMA en el estudio de colonización pulmonar en OS. Algunos pasos críticos en el protocolo donde los investigadores deben tomar cuidado adicional son los siguientes:
a) canulación de la tráquea. La tráquea puede ser dañada fácilmente mientras que disecar el músculo circundante y el tejido conectivo. Además, la aguja del catéter puede introducirse fácilmente a través de la tráquea. Preste atención a cómo el bisel de la aguja entra en la tráquea al colocar la cánula.
b) perforar o dañar la superficie del pulmón. El pulmón puede ser fácilmente perforado o dañado con tijeras de disección mientras quitar el esternón y exponer la cavidad torácica. Tenga cuidado al disecar hacia fuera el desplume de la cavidad torácica. Perforar o dañar la superficie del pulmón causará el agarosa/un-media líquido a escaparse hacia fuera y el pulmón se desinfla.
c) eliminar el exceso de medio de secciones del pulmón mientras que la proyección de imagen. Exceso de medio líquido que rodea la sección del pulmón puede causar un efecto de "espejo" cuando se observa bajo el microscopio. El exceso de líquido puede reflejar la luz fluorescente de las células del tumor exagerando de tal modo el área de fluorescencia en la imagen. Extracción del exceso de medio líquido evitará este artefacto en la imagen. Por otra parte, el artefacto de la imagen puede eliminarse durante el procesamiento posterior de las imágenes.
d) fotoenvejecimiento de los tejidos vivos. Cuando se utiliza una lámpara de mercurio o de un microscopio 1 fotón, asegúrese de limitar el tiempo de exposición a la luz. También puede reducirse el porcentaje de intensidad/potencia de la fuente de luz. Sobre exposición a la fuente de luz puede provocar fotoenvejecimiento para el tejido pulmonar. Los microscopios equipados con diodos electroluminosos (LED) o 2-fotón/multi-fotones microscopios sería ideal ya que producen menos fotoenvejecimiento durante estudios de imagen longitudinales.
El modelo de PuMA puede ser adaptado y modificado para estudiar muchos aspectos del proceso de colonización pulmonar. Otra variante de este enfoque ex vivo es descrito por van den Bijgaart y colegas 21. Estudios examinan los efectos de la actividad de drogas anti-metastásico o precipitación del gene en el crecimiento de la célula del tumor en el pulmón, escalado detrás el número de células inyectadas de 5 x 105 a 3 x 105 se recomienda ya que pueden enmascarar los efectos de la intervención durante el crecimiento exponencial de una innoculum de la célula más grande. Varios estudios han utilizado el modelo de PuMA para el estudio de los conductores de pulmón metastásico progresión 4,5,8,22,23,24. Varios tintes de indicador fluorescente o genes del reportero fluorescente pueden utilizarse para las células tumorales de la etiqueta para determinar cambios en célula fisiología o gene expresión 8 en el microambiente del pulmón.
Una limitación del modelo PuMA incluye un número limitado de líneas celulares compatibles. Las líneas celulares establecidas compatibles con este ensayo se enumeran por Mendoza y colaboradores 3 . Para líneas celulares de osteosarcoma metastásico altas y bajas, los pares de seguimiento de líneas de células clonally relacionados se han encontrado para crecer y mantener su propensión metastásico en el modelo de PuMA: células humanas MG63.3 & MG63, MNNG & 143B y células HOS, murino K7M2 y K12 células. Los investigadores deben determinar empíricamente o no sus líneas celulares pueden permanecer viables en el medio B. Otra limitación a considerar es la duración limitada de que los tejidos pulmonares se pueden mantener in vitro. Tejido pulmonar puede conservar sus componentes celulares por 30 días, más allá de ese tiempo y los componentes celulares del pulmón comienzan a morir. Por lo tanto, estudiar las interacciones entre las células tumorales y células del estroma pulmonar no debe exceder 30 días.
El modelo PuMA proporciona un método sin precedentes para estudiar cómo metastásico OS las células colonizan el tejido pulmonar. El aspecto más llamativo del modelo PuMA viene del hecho de que no pueden desarrollarse varios baja metastásico OS líneas celulares (HOS, MG63, K12), cuyos fenotipos en vivo han caracterizado otros 25, en el modelo de PuMA. En cambio, las células clonally relacionadas altamente metastáticas OS (MNNG, MG63.3, K7M2) tienen una mayor propensión a colonizar tejido pulmonar en vivo25 y en el PuMA modelo. Esto sugiere que los componentes celulares y extracelulares del microambiente del pulmón que impiden el crecimiento en vivo, bajo líneas de celulares so metastásicas se mantienen en el modelo de PuMA a pesar de la falta de flujo sanguíneo. En otras palabras, el microambiente del pulmón del modelo PuMA todavía ejerce una "presión de selección" que impide que las células metastásicas baja de OS creciendo en el pulmón. De hecho, estudiar alta OS las células metastásicas crecen en PuMA ha sido útil en la identificación de nuevos controladores moleculares del fenotipo metastásico 4,5. Por otra parte, abajo-modulación genética de dichos objetivos en células altamente metastáticas fue demostrada para disminuir la capacidad metastásica en ambos el modelo de PuMA y en vivo 5. Para estudios de medicamentos anti-metastásico de candidato, el PuMA modelo puede usarse para determinar que rango de concentración puede reducir consecuencia metastático en el tejido pulmonar, que a su vez, puede ser validado en vivo.
Futuras aplicaciones de este modelo deben explotar la gran cantidad de tintes fluorescentes disponibles en el mercado y genes reporteros con el fin de profundizar en la biología básica de la progresión de metástasis OS. Por ejemplo, tintes fluorescentes como 2', 7' - dichlorofluorescin diacetato o dihydroethidium pueden utilizarse para evaluar el estado redox de las células del tumor en el modelo de PuMA. Genes del reportero fluorescente pueden utilizarse para estudiar la biología del orgánulo o evaluar la actividad de promotor para determinar que vías de señalización se activan en las células altamente metastáticas de OS durante el proceso de colonización. Estos enfoques se pueden utilizar para visualizar si un tratamiento farmacológico tiene actividad en las células del tumor en el pulmón. Plataformas de microscopia fluorescente que producen menos fotoenvejecimiento a tejidos, tales como microscopios equipados con LED o microscopios confocales multifotón-fotón/2, puede ser utilizado estudian cómo metastásico OS células migrar e invadir a través de los tejidos pulmonares. Además, las interacciones de adherencia entre las células tumorales y las células stromal del pulmón pueden controlarse con genes reporteros fluorescentes.
Para resumir, el actual artículo analiza los aspectos prácticos del modelo PuMA, desarrollado por Mendoza y colaboradores 3. Se muestra un ejemplo de la utilización de baja magnificación, widefield de microscopía de fluorescencia y microscopia confocal de alta resolución para evaluar el crecimiento de las células humanas y metastásicos de OS. Se han descrito varios pasos críticos del protocolo. Además, se han discutido las ventajas y limitaciones del modelo PuMA. Futuras aplicaciones del modelo de PuMA para estudiar el proceso de colonización del pulmón se han presentado, y se espera que este modelo tendrá un uso más amplio en la comunidad de investigación de osteosarcoma.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Dr. Arnulfo Mendoza quien proporcionó capacitación en la técnica de PuMA. Además, nos gustaría reconocer los Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) y Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para proporcionar el uso de los microscopios en el transcurso de este estudio. Esta investigación fue apoyada (en parte) por el programa de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud, centro de investigación del cáncer, rama de oncología pediátrica. M.M.L. fue apoyado por el programa nacional de institutos de salud intramuros visitando compañeros (Premio 15335) y actualmente es apoyado por una beca de Parker de Joan en la investigación de metástasis. P.H.S. es apoyado por la Fundación del cáncer de Columbia Británica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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