Summary
Questo protocollo serve come uno schema per istituire un sistema funzionale di Tet-ON in linee cellulari del cancro e la successiva utilizzazione, in particolare per studiare il ruolo di proteine derivati da cellule tumorali nel reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale.
Abstract
siRNA e abbattere shRNA-mediata di metodi (KD) di regolazione dell'espressione genica sono strumenti preziosi per capire la funzione genica e proteica. Tuttavia, nel caso che il KD della proteina di interesse ha un effetto letale sulle cellule o l'effetto atteso di KD è dipendente dal tempo, incondizionati KD metodi non sono adatti. Sistemi di condizionale sono più adatte in questi casi e sono state oggetto di grande interesse. Questi includono sistemi di sovraespressione ecdisone-inducibile, citocromo P-450 induzione sistema1, e la tetraciclina regolato sistemi di espressione genica.
Il sistema di espressione del gene di tetraciclina regolamentato consente un controllo reversibile l'espressione della proteina di induzione dell'espressione di shRNA in presenza di tetraciclina. In questo protocollo, vi presentiamo un progetto sperimentale utilizzando sistema Tet-ON funzionale in linee cellulari tumorali umane per condizionale regolazione dell'espressione genica. Dimostriamo quindi l'uso di questo sistema nello studio dell'interazione delle cellule-monociti del tumore.
Introduction
Macrofagi tumore associato (TAMs) contribuiscono allo sviluppo del tumore, promuovendo la crescita del tumore, metastasi e che regolano la risposta immunitaria2. Le cellule tumorali infiammatorie monociti recluta, che infiltrano il tumore e differenziano in pro-cancerogeno TAMs3. Infiltrazione del tumore con TAMs correla con risultato clinico difficile ed è stato collegato al ruolo immunosopressivo di macrofagi4,5. Tuttavia, i meccanismi del reclutamento dei macrofagi di tumore non sono ben esplorati e una migliore comprensione delle vie coinvolte è cruciale per l'ulteriore avanzamento del campo e promettenti terapie. Una delle sfide nello studiare le interazioni tra cellule tumorali e cellule normali nel microambiente tumorale (TME) è la complessità dei meccanismi e cellule coinvolte, che richiedono approcci in vitro che consentono la dissezione del crosstalk. Qui presentiamo una metodologia versatile che può essere applicata per studiare l'effetto di paracrine di un cancro cellula-derivato, proteina secernuta sulla migrazione di altri tipi di cellule come i macrofagi, in vitro. Utilizza un sistema in cui l'espressione di shRNA contro una cellula-derivati dalla proteina del cancro coinvolta nel reclutamento dei monociti è sotto il controllo del promotore inducibile tetraciclina, è quantificato l'effetto paracrino della proteina secernuta sui monociti. In questo protocollo, clonazione delle sequenze shRNA nella tetraciclina regolamentato vettoriale è presentato seguita dalla generazione di linee cellulari tumorali stabile. Inoltre, la purificazione di monociti umani primari e un'analisi della camera di Boyden vengono utilizzati per analizzare l'effetto di paracrine di una proteina della cellula tumorale derivata sulla migrazione dei monociti.
Downregulation dei geni di codificazione della proteina è comunemente applicato con tecniche di siRNA e shRNA, anche se non senza limitazioni nel suo utilizzo. Il knock-down a lungo termine (KD) di geni può suscitare risposte adattative secondarie delle cellule che interferiscono con i risultati sperimentali. Mancanza di controllo temporale sull'espressione genica rende impegnativo per studiare il ruolo dinamico di una proteina nel tempo o il ruolo di una proteina fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. Questo problema è particolarmente importante nelle impostazioni di in vivo , dove il ruolo di una proteina nello sviluppo del tumore e nella progressione potrebbe richiedere downregulation dell'espressione della proteina di interesse solo dopo che il tumore è stabilito. KD condizionale ha il vantaggio di evitare un effetto letale troppo presto di KD sulle cellule e per attivare l'analisi del ruolo della proteina all'interno di diverse fasi di crescita del tumore, mentre KD incondizionato potrebbe causare mancanza di sviluppo del tumore.
Un numero di condizionale KD sistemi è stato sviluppato per risolvere le limitazioni di KD stabile. I sistemi di espressione genica condizionale includono sistemi di sovraespressione ecdisone-inducibile, sistema induzione del citocromo P-4501, e tetraciclina regolato sistemi di espressione genica. I sistemi di espressione di gene tetraciclina-regolato consentono di controllare l'espressione di shRNA con l'aggiunta della tetraciclina antibiotica (o il suo analogo più stabile - doxiciclina). Nei sistemi di Tet-ON, l'espressione di shRNA è indotta in presenza di tetraciclina/doxiciclina risultante in un'espressione genica KD, mentre nei sistemi di Tet-OFF, l'espressione di shRNA è soppressa in presenza di tetraciclina conseguente espressione genica. Uno svantaggio del sistema tetraciclina-inducibile è precedentemente segnalati a bassi livelli di espressione di shRNA in assenza di doxiciclina - cosiddetto permeabilità6,7. Tet-on sistema descritto qui, somministrazione di tetraciclina, il legame della proteina repressore (TetR) tetraciclina costitutivamente espressa per la sequenza di elementi (TRE) Tet-sensible a reagire all'interno il H1 regione del promotore di shRNA di interesse è soppresso. Questo si traduce in espressione di shRNA e inibizione della traduzione della proteina di interesse in un modo dipendente dalla tetraciclina8,9.
Altri sistemi di Tet-ON disponibili includono knock-in simultanea di TetO sequenza tra TATA box ed elemento sequence prossimale (PSE) e tra trascrizione e TATA box avviare sito sviluppato da Chan et al. 10 questo sistema richiede meno di dosi tossiche di tetraciclina di regolare l'espressione di shRNA, tuttavia, in uno stato indotto non, bassi livelli di shRNA vengono espressi. La casella Krüppel-collegata (KRAB) basato Tet-ON sistema11 include KRAB, una proteina del dito di zinco, che geni soggetti si trovano all'interno di una gamma di 3 kb del sito di legame di KRAB a soppressione trascrizionale. TTRKRAB la proteina chimerica può associare a TetO, e dovuto la vasta gamma di capacità controllabile del DNA, TetO non bisogno essere limitato tra la trascrizione aprire il sito e il promotore hanno basso impatto sull'attività del promotore. Sotto lo stato indotto non, questo sistema di interferenza RNA controllabile è stato segnalato per mostrare un livello inferiore di trapelate espressione di shRNA11,12; Tuttavia, esso richiede un approccio sequenza, due-vettore di clonazione. Rispetto ai sistemi di KD condizionale precedentemente sviluppati come il sistema di sovraespressione ecdisone-inducibile o sistema di induzione del citocromo P-450, il sistema di tetraciclina-regolato ha il vantaggio della sua robustezza e la reversibilità e pertanto è il più usato ordinariamente sistema13. Il sistema utilizzato in questo protocollo ha il vantaggio rispetto il KRAB Tet-ON sistema e TetO knock-in sistema duale in quanto richiede dritto in avanti, singolo vettore clonazione, permettendo la rapida generazione di più cloni, e presenta livelli molto bassi di permeabilità nella assenza di doxiciclina.
TME è fondamentale per lo sviluppo del cancro. Per facilitare la crescita del tumore, le cellule tumorali reclutano infiammatori monociti secernendo proteine chemiotattiche. Reclutati monociti infiltrano il tumore e differenziano in tam pro-cancerogeno che contribuiscono alla crescita del tumore e metastasi. Studi in vitro del reclutamento delle cellule immuni utilizzano saggi di migrazione, con Boyden analisi della camera essendo ampiamente usato14,15,16,17. In questa analisi, la fonte della proteina chemoattractant, ad esempio, le cellule tumorali, o una proteina purificata, viene inserita nella camera inferiore. Le cellule immunitarie sono collocate nella camera superiore separata con membrana porosa dal vano inferiore. La migrazione verso la pendenza crescente di chemoattractant e quelli che si trovano sul lato inferiore della membrana di cellule sono macchiate e conteggiate sotto il microscopio. Qui testiamo la funzione chemoattractant del Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) sui monociti generando linee cellulari stabili, inducibile cancro dove espressione di PAI-1 è regolata da aggiunta di doxiciclina. Utilizziamo monociti umani primari in analisi migrazione dell'alloggiamento di Boyden per valutare il ruolo di PAI-1 in migrazione di monociti. Differenze tra linee cellulare monocytic ampiamente usato come THP1 e monociti umani primari sono state segnalate e includono diverse citochine espressione modelli18; ad esempio, aumento di 5-10 volte nei livelli di espressione di TNF-α dalle cellule THP1 rispetto ai monociti umani19. Le cellule THP1 sono derivati da cellule monocytic umane di leucemia, sono facili da mantenere e proliferare con una media di 19-50 h20il tempo di raddoppiamento. Al contrario, monociti umani sono caratterizzati da una durata breve in assenza di fattori di crescita. Dal momento che i monociti sono purificati dal sangue dei donatori, una discreta quantità di variabilità si verifica tra gli individui e a seconda del metodo di purificazione, può verificarsi la contaminazione con altri tipi di cellule. Tuttavia, monociti primari sono rilevanti ed è stato raccomandato di utilizzare o confermare i risultati ottenuti con le linee di cellule monocytic utilizzando monociti primari nella ricerca biologica19. Qui descriviamo un protocollo per la purificazione dei monociti umani primari da sangue periferico. Metodi alternativi di purificazione del monocito sono protocolli di adesione e del gradiente di densità e procedura di due step con singoli gradiente di Ficoll-Hypaque seguita da un gradiente di Percoll21. La purezza della popolazione monocito ottenuta da quelle gamme di metodi tra 70-90%. Il metodo qui descritto utilizza un gradiente di densità seguito da una selezione negativa immuni22 e permette la purificazione dei monociti umani senza contatto diretto con gli anticorpi, quindi evitando loro attivazione accidentale e conseguente un > 95% della popolazione di puro dei monociti.
Il protocollo presentato qui è utilizzato per l'impostazione di un sistema funzionale di Tet-ON per l'espressione genica KD in linee cellulari tumorali umane per studiare l'effetto di chemoattractant della proteina secernuta cancro-derivato PAI-1 sui monociti. PAI-1 è overexpressed da una varietà di tumori e la sua espressione paradossalmente correla con risultato clinico difficile23,24. Il ruolo pro-cancerogeno di PAI-1 è un risultato della sua pro-angiogenici e anti-apoptotici funzioni25,26. PAI-1 ha dimostrato di contribuire alla infiammazione promuovendo l'assunzione dei macrofagi al sito di infiammazione27. PAI-1 è stata indicata per promuovere il muscolo liscio cellmigration28,29 e a partecipare al Mac-1 dipendente del macrofago migrazione30. Sovraespressione di PAI-1 ha dimostrata anche di migliorare significativamente l'assunzione dei macrofagi Raw 264.7 in B16F10 del melanoma tumori31. Tuttavia, il ruolo di PAI-1 in migrazione TAM non è stato studiato in dettaglio. Utilizziamo il protocollo descritto per rispondere alla domanda di se PAI-1 attrae i monociti alle cellule tumorali. Questa metodologia consente una dissezione del crosstalk tra tumore e TME silenziamento la proteina secernuta in cellule tumorali ed analizzando le componenti della TME.
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Protocol
La sezione di protocollo che utilizza monociti umani ottenuti dai volontari sani segue le linee guida del comitato etico di bambini Ospedale Los Angeles umana ricerca ed è stata approvata dal comitato di revisione istituzionale sotto il materiale umano Numero di protocollo: CCI 08-00208.
1. preparazione di linee cellulari del cancro con tetraciclina-regolato shRNA espressione
- Clonazione di shRNA PAI-1 nel vettore di Tet-pLKO-puro 8 , 9
- Progettazione di oligomeri di shRNA contenenti etàio ed EcoRI fenditura sito all'estremità 5', la sequenza di senso, un ciclo di 6 nucleotidi e la sequenza antisenso.
Nota: Tipici oligonucleotidi sono progettati come segue: avanti oligo: 5' CCGG - 19-21 bp senso - CTCGAG - 19-21 bp antisenso - TTTTT, Reverse oligo: senso 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 antisenso bp 3'. Protocollo dettagliato per la progettazione di oligomero può essere trovato in 8. In questo studio 3 sequenze shRNA contro PAI-1 sono stati testati per il più forte effetto di silenziamento: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333e strapazzate33 sono inclusi in tabella 1. - Tempri gli oligomeri di shRNA e strapazzate shRNA oligomeri.
- Ricostituire oligonucleotidi a 100 µM in acqua e mescolare oligonucleotide in avanti di 1 µ l, oligonucleotide inverso di 1 µ l e 8 µ l H2O.
- Per temprare i oligonucleotides, mescolare le seguenti: 1 µ l del oligonucleotide miscela, 5 µ l tampone 10 mM Tris (idrossimetil) amminometano (Tris) a pH 7.5, 50 mM di cloruro di sodio (NaCl), 10 mM di cloruro di magnesio (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) e 44 µ l H 2 O.
- Incubare la miscela in un termociclatore di reazione a catena (PCR) della polimerasi a 95 ° C per 5 min, spegnere lo strumento e attendere fino a quando viene raggiunta la temperatura ambiente (RT).
- Precipiti Ricotti oligonucleotidi aggiungendo 5 µ l 3 M µ l di acetato di sodio pH 5.2 a 50 ricotto oligonucleotidi.
- Aggiungere 100 µ l freddo 100% di etanolo (EtOH) ed incubare per 30 min a-80 ° C. Centrifugare in una centrifuga da banco a velocità massima per 30 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 500 µ l freddo 70% EtOH, centrifuga per 30 min, rimuovere il surnatante e sciogliere risospeso in 20 µ l di H2O.
- Valutare la concentrazione di oligonucleotidi Ricotti mediante spettrofotometria, misurando l'assorbanza a 260 nm. Oligonucleotidi diluiti alla concentrazione finale di 1 ng / µ l.
- Preparare mezzo Luria Bertani (LB) e piastre di agar LB.
- Per mezzo di LB, sciogliere 10 g triptone, Estratto di lievito 5 g, 10 g di NaCl in 1 L di acqua. Regolare il pH del mezzo a pH 7.0 utilizzando 1 N NaOH e autoclave.
- Per piastre di agar LB, aggiungere 15 g/L di agar in mezzo di LB. Autoclave e raffreddare a circa 50 ° C. Aggiungere Antibiotico e versare le piastre.
- Streak batteri trasformati con un vettore di Tet-pLKO-puro (Vedi la Tabella materiali) su LB agarizzato completati con ampicillina di 100 µ g/mL e incubare per una notte (O/N) a 37 ° C.
- Inoculare 100 mL di terreno LB completati con ampicillina 100 µ g/mL (LB/ampicillina) con 1 Colonia dalla piastra e crescere O/N con agitazione a 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro da coltura batterica 100 mL utilizzando un kit di isolamento del plasmide.
- Preparare la reazione di restrizione per il vettore di Tet-pLKO-puro con enzimi di restrizione EcoRI e AgeI come segue: 1 µ l EcoRI, 1 µ l AgeI, 5 µ l di tampone di 10x, 1 µ l plasmide DNA (1 µ g), 42 µ l H2O. Incubare 1 h a 37 ° C. Per ottenere abbastanza di vettore spaccati, preparare le reazioni fino a 5 x 50 µ l.
- Utilizzare gel di agarosio 1% per purificare fenduti vettore dal gel dell'agarosi utilizzando un kit di purificazione di DNA. Per aumentare il rendimento del DNA, ridurre al minimo l'agarosio al rapporto di DNA nel gel utilizzando un pettine di gel di agarosio per grandi pozzi e rimuovendo con attenzione la maggior parte dell'agarosi dalla band usando un bisturi.
- Preparare la miscela di reazione di legatura come segue: 1 oligonucleotidi ng ricotto, 50 ng fenduti vettore, 2 µ l tampone di 10x ligasi, 1 della ligasi µ l e acqua fino a 20 µ l. legare il vettore con oligonucleotidi di shRNA ricotto a 16 ° C O/N.
- Inoltre, preparare una reazione di controllo negativo senza oligonucleotidi per contabilizzare il vettore ApoAlert, parzialmente spaccato e auto-legato che si tradurrà in colonie positive false.
- Utilizzando tecniche di trasformazione standard, trasformare miscele di legatura in cellule batteriche chimicamente competenti progettate per impedire la ricombinazione omologa di vettori lentivirali contenenti ripetizioni diretti.
- Crescere batteri sui piatti con ampicillina O/N a 37 ° C.
Nota: Se si verifica la crescita delle colonie satellitare, ripetere la trasformazione e crescere batteri a 30 ° C per rallentare la crescita e prevenire così colonie satellitare. - Per verificare il successo legatura, scegliere tra 10-20 singole colonie, inoculando mL 2 LB/ampicillina culture e una piastra di ampicillina come una piastra d'archivio (per essere utilizzato come un clone positivo in seguito). Coltivare colture liquide con agitazione O/N a 37 ° C. Incubare la piastra O/N a 37 ° C.
- Sigillare la piastra con parafilm e conservare a 6 ° C.
- Isolare il DNA del plasmide da colture liquide utilizzando un kit di isolamento del plasmide.
- Eseguire l'analisi di restrizione del DNA del plasmide isolato dalle colonie ampicillina-resistente usando enzima XhoI. Per ogni clone, preparare la seguente miscela di reazione: 0,5 µ l XhoI, 2,5 µ l di tampone 10x, 1 µ l plasmide DNA (0,5 µ g) e 21 µ l H2O. Incubare per 1h a 37 ° C. Analizzare il risultato della reazione di restrizione eseguendo la reazione su un gel di agarosio all'1%.
Nota: L'analisi di limitazione del vettore WT spaccato di XhoI genererà 3 frammenti: 8.447, 1.800 e 200 bp. La sequenza di stuffer nel vettore di Tet-pLKO-puro di 1.800 bp non è presente in cloni positivi contenenti shRNA-PAI-1 e il digest XhoI si tradurrà in frammenti di DNA di dimensioni: 8.447, 190 e 130 bp. Come illustrato nella Figura 1, il frammento di bp 2.000 non viene trovato in DNA isolato dal numero di colonie ampicillina resistente: 3, 8 e 11. Secondo il disegno di oligonucleotidi, la lunghezza e il numero di frammenti ottenuti nel DNA da colonie positive possono variare. - Verificare il corretto inserimento delle sequenze shRNA in vector Tet-pLKO-puro da sequenziamento8,9.
- Inoculare 100 mL cultura LB/ampicillina con la Colonia contenente il clone corretto e crescere O/N a 37 ° C.
- Isolare il DNA del plasmide utilizzando un kit di isolamento del plasmide.
- Progettazione di oligomeri di shRNA contenenti etàio ed EcoRI fenditura sito all'estremità 5', la sequenza di senso, un ciclo di 6 nucleotidi e la sequenza antisenso.
- Generazione di particelle lentivirali.
- Ricoprire una piastra di coltura del tessuto di 15cm con poli-L-lisina coprendo la superficie del piatto con soluzione di acqua sterile dello 0,01% Poly-L-lisina e incubare a temperatura ambiente per 15 min. eliminare la soluzione tramite aspirazione e asciugare i piatti.
- (HEK293) seme 5 x 106 293 di rene embrionale umano cells nel piatto rivestiti con poli-L-lisina 15 cm, e cultura in medium Medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco per volta completati con 10% FBS e 1% mix di penicillina/streptomicina (Pen/Strep) a 37 ° C, 5% CO 2 fino a raggiungere confluency di 70%.
- Per produrre particelle virali, transfect cellule HEK293 con 25 µ g pLKO-Tet-su-shRNA, 25 µ g psPAX, (imballaggi plasmide) e 5 µ g pMD2.G plasmidi (plasmide esprimenti busta) usando il reagente di transfezione.
Nota: psPAX e pMD2.G plasmidi sono un regalo dal laboratorio Didier Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Svizzera). - Indurre le cellule HEK293 il giorno successivo modificando il mezzo in DMEM completate con 10 mM di sodio butirrato e 20 mM HEPES pH 7,2 e coltura per 8 h.
- Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 25 mL di fresco DMEM Media contenente 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) pH 7.2. Dopo incubazione a 37 ° C per 48 h, raccogliere con cura i media contenenti virus pipettando; evitare fuoriuscite.
- Il mezzo raccolto filtrare su filtro da 0,45 µM siringa per rimuovere le cellule HEK293. Il supporto che contiene le particelle virali può essere usato immediatamente o conservato a-80 ° C per un uso successivo.
- Generazione di linee cellulari trasfettate stabilmente
- HCT116 cellule di cancro del colon e le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 a 50.000 cellule/pozzetto in medium DMEM completate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di semi Pen/Strep in una piastra 12-pozzetti. Incubare a 37 ° C 5% CO2 fino a quando le cellule sono 60-70% confluenti.
- Lavare le cellule con PBS e aggiungere 1 mL di contenenti virus medio al cancro cellule e O/N di incubare a 37 ° C 5% CO2. Come controllo, aggiungere 1 mL di fresco DMEM supplementato con 10% FBS e 1% Pen/Strep a 2 pozzi con le cellule tumorali.
- Rimuovere con cautela contenenti virus medio dall'aspirazione. Lavare le cellule con PBS e modificare il mezzo in DMEM con 10% (v/v) privo di tetraciclina (Tet-libero) FBS e 1% Pen/Strep.
- Dopo 72 h, lavare le cellule con PBS e modificare il mezzo in DMEM 10% FBS Tet-libero 1% Pen/Strep, con puromicina. 1 µ g/mL per la selezione di cellule trasfettate con virus.
- A seconda della linea cellulare utilizzata, regolare la concentrazione con puromicina per ottimale selezione test l'intervallo di concentrazioni con puromicina (0,1, 0,5, 1, 2 e 5 µ g/mL) in cellule non trasdotte e scegliendo la più bassa concentrazione dove non sopravvivono cellule di controllo Dopo 3 giorni di cultura.
- Selezionare le cellule trasdotte virus di coltura delle cellule in presenza con puromicina per 3-14 giorni. Come controlli, preparare ulteriori due pozzetti con cellule non trasdotte, uno con mezzo contenente con puromicina e uno senza con puromicina. Osservare parziale uccisione delle cellule con puromicina nel pozzo con cellule trasdotte virus rispetto ai pozzetti di controllo.
Nota: Le cellule Non trasdotte non crescerà in presenza con puromicina. - Verificare l'efficienza del KD condizionale nel tumore del colon con puromicina-resistente HCT116 e cellule di cancro al seno MDA-MB-231.
Nota: La concentrazione efficace di doxiciclina varierà con la linea cellulare utilizzata e deve essere titolata (in genere da 100 ng/mL a 2 µ g/mL).- Determinare la concentrazione di doxiciclina non è tossico per le cellule ma efficace nella downregulating l'espressione della proteina di interesse. In questo protocollo, 1 µ g/mL è stato utilizzato con successo in vitro.
- Coltura delle cellule per 72 h in presenza ed assenza di doxiciclina µ g/mL 0,1, 1 e 2. Verificare il livello di espressione della proteina downregulated (qui, PAI-1) nel lisato cellulare tramite Western blot analisi. Confrontare le cellule HCT116 e MDA-MB-231 condizionalmente esprimono shRNA alle cellule di controllo uova strapazzate.
- Preparazione del medium condizionato
- Semi 1 x 106 delle cellule transfettate stabile con doxiciclina regolato il lentivirus contenenti pLKO-shRNA in piatti di 10 cm.
- Linee cellulari in mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% FBS privo di Tet e 1% di crescere Pen/Strep in assenza e in presenza di 1 doxycycline µ g/mL per 72 h a 37 ° C 5% CO2, aggiunta di doxiciclina fresca ogni giorno.
Nota: Medium RPMI è compatibile con le condizioni di coltura dei monociti. La doxiciclina è un composto leggero e sensibile. Proteggere le colture cellulari da luce coprendo con carta stagnola ed evitare di lavorare sotto l'esposizione diretta alla luce. - Raccogliere il mezzo di pipettaggio, filtrare su filtro a 0,45 µm e congelare a-80 ° C in aliquote.
2. isolamento dei monociti da sangue umano
- Isolare i monociti da sangue periferico umano.
Nota: Monociti umani primari sono isolati da 7 mL di globuli bianchi concentrati in un filtro del leucocita ottenuto da donatori sani della piastrina. A seconda del donatore, un filtro del leucocita produce tra 1 x 109 e 2 x 109 di cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs), circa il 10% di cui costituiscono i monociti.- Preparare la workstation nel flusso laminare.
- Sterilizzare le forbici e il flusso laminare con luce ultravioletta (UV) per 30 min.
- Spruzzare il filtro del leucocita con 70% EtOH e asciugato all'aria dentro il flusso laminare.
- Entrambe le estremità del filtro del leucocita di tagliare con le forbici e svuotare il contenuto del filtro in una provetta da 50 mL.
- Diluire a 90 mL aggiungendo PBS contenente l'1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
- Preparare 3 x 50 mL provette con 15 mL di soluzione gradienti di densità. Strato lentamente 30 mL di PBS/FBS diluito sangue sopra la densità gradiente soluzione usando un pipettatore automatico impostato sul flusso gravitazionale per evitare la miscelazione degli strati.
- Centrifugare in un rotore di swing a 400 x g a RT senza freni per 25 min.
- Lo strato superiore di alienare e trasferire lo strato intermedio contenente PBMCs ad un tubo fresco 50 mL.
- Aggiungere CHE PBS/FBS fino a 50 mL e centrifugare a x 120 g a RT per 10 min. rimuovere il supernatante contenente piastrine. Ripetere questo passaggio altre due volte.
- Risospendere il pellet in 50 mL di PBS/FBS e contare i PBMCs utilizzando un emocitometro. Centrifugare a 120 x g a RT e risospendere il pellet in PBS/FBS contenente 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (PBS/FB/EDTA) a una concentrazione finale di 5 x 107 cellule/mL.
- Utilizzare un kit di selezione negativa per arricchire i monociti da svuotamento delle cellule non-monocytic.
Nota: Il kit di selezione negativa utilizza un cocktail di anticorpi (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 e glycophorin A) contro T cellule NK le cellule, neutrofili, B cellule, granulociti ed eritrociti. I complessi anticorpo legano la superficie di queste cellule non-monocytic e per le particelle magnetiche di destrano. Quando il tubo è collocato in un magnete, le perle di aderiscano alle pareti del tubo e rimuovere le cellule non-monocytic dalla soluzione.- Aggiungere 50 µ l anticorpo cocktail a 1 mL di 5 x 107 PBMCs/mL, mescolare con una pipetta e incubare per 10 min a biglie magnetiche di RT. aggiungere 50 µ l di PBMCs con l'anticorpo cocktail, mescolare con una pipetta e incubare per altri 10 min a TA.
- Aggiungere PBS/FB/EDTA fino a 25 mL e posto la miscela PBMC in un magnete che può ospitare un tubo da 50 mL. Incubare per 10 min a RT. magnetico perline potranno aderire alle pareti del tubo e sequestrare le cellule non-monocytic dalla soluzione.
- Utilizzando una pipetta 25 mL, rimuovere la soluzione contenente i monociti dal tubo nel magnete. Fare attenzione a non toccare i lati del tubo con la pipetta.
- Centrifugare la soluzione a 250 x g a RT, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente monociti in medium RPMI contenente 10% FBS privo di Tet e 1% Pen/Strep.
3. analisi di migrazione di alloggiamento di Boyden
- Preparare la soluzione di albumina di siero bovino (BSA) 1% (p/v) sciogliendo 1 g di BSA in 100 mL di acqua ultrapura e filtrare attraverso una dimensione dei pori di 0,2 µm per sterilizzare.
- Incubare il membrana porosa inserti in soluzione sterile 1% BSA O/N per una migliore aderenza dei macrofagi alla membrana. Per i monociti/macrofagi, utilizzare inserti di dimensioni di 5-8 µm poro.
- Riempire un piatto di coltura di tessuto sterile con soluzione di BSA 1% e gli inserti nel piatto. Applicare 200 µ l soluzione di BSA 1% all'interno degli inserti.
- Lavare gli inserti due volte mettendoli in un piatto riempito con PBS sterile e applicando PBS all'interno del filtro.
- 40.000 cellule HCT116 o MDA-MB-231 in 0,5 mL di terreno RPMI contenente 10% FBS privo di Tet e 1% di semi Pen/Strep per pozzetto, in una piastra a 24 pozzetti, in triplice copia. In alternativa, posizionare 0,5 mL di medium condizionato generato in precedenza nel pozzo come fonte di chemoattractant.
- Il giorno successivo, monociti piastra 8.000 nel preparato inserire in 0,3 mL di volume del medium RPMI contenente 10% FBS privo di Tet e 1% Pen/Strep, in triplice copia e incubare a 37 ° C 5% CO2.
- Raccogliere gli inserti dopo 48 h.
Nota: La lunghezza di un esperimento dovrà essere ottimizzata a seconda delle condizioni specifiche e le cellule utilizzate, eseguendo un esperimento di corso di tempo dove inserti sono raccolti a tempi diversi di incubazione.- Scrollarsi di dosso l'eccesso del prodotto e precisamente strisciare la superficie interna con un applicatore con punta di cotone per rimuovere le cellule che non sono stati migrati.
- Macchia il lato esterno degli inserti utilizzando il metodo di Wright-Giemsa.
- Montare con cura 3 inserti/vetrino in un olio di immersione microscopio ad alta viscosità, assicurandosi che il lato del filtro con i macrofagi migrati rivolto verso l'alto.
- Immagine le diapositive utilizzando un microscopio ottico con obiettivo X 20. Scattare foto di 9 campi/filtro. Contare i macrofagi migrati in 9 campi/filtro.
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Representative Results
Tre sequenze di shRNA sono stati testati per il più efficiente KD di PAI-1. Per questo, sequenze shRNA contro PAI-1 e uova strapazzate (tabella 1) sono stati clonati nel vettore di espressione di Tet-pLKO-puro seguendo il protocollo descritto in precedenza. La linea di cellule di fibrosarcoma HT-1080 era stabilmente trasfettata con costrutti generati e le cellule sono state trattate con doxiciclina per 3 giorni. L'espressione di PAI-1 è stata verificata mediante Western blotting (Figura 2A) e l'intensità delle bande corrispondenti a PAI-1 e la tubulina è stata analizzata da densitometria. Utilizzando la sequenza più efficace di KD (shRNA 2), abbiamo generato inoltre le cellule epiteliali della mammella dell'adenocarcinoma del MDA-MB-231 (Figura 2B) e cellule di carcinoma colorettale HCT116 (Figura 2) stabilmente trasfettate con una tetraciclina-regolato pLKO-shRNA2-PAI-1 espressione vettoriale (e shRNA strapazzate come controllo). Abbiamo raggiunto una diminuzione del 74% di PAI-1 espressione nella linea cellulare di MDA-MB-231 (Figura 2B) e 17,5% diminuzione nella linea cellulare HCT116 in presenza di doxiciclina (1 µ g/mL)(Figura 2) come valutato mediante Western blotting e analisi densitometrica delle le bande. L'analisi della camera di Boyden è stato utilizzato per quantificare la migrazione dei monociti verso le cellule tumorali. Abbiamo supposto che il cancro cellule derivate PAI-1 promuove la migrazione dei monociti verso le cellule del tumore e quindi meno migrazione sarà osservato quando PAI-1 è downregulated dall'aggiunta di doxiciclina. Le cellule tumorali sono state trattate con doxiciclina per 3 giorni e sono state seminate nel fondo di una piastra a 24 pozzetti a 40.000 cellule/pozzetto. Monociti umani primari purificati sono stati applicati nella camera superiore del dosaggio e dopo 24 h, i monociti attaccati al fondo della membrana erano macchiati e contati sotto il microscopio. Dimostriamo che in assenza di doxiciclina e pertanto la presenza di PAI-1, in MDA-MB-231 e HCT116 cellule (PAI-1 shRNA e controlli strapazzati), ha aumentato significativamente la migrazione dei monociti umani (Figura 3). La migrazione dei monociti quindi è stata inibita da 33% e 74% quando doxiciclina è stato aggiunto al co-colture e la produzione di PAI-1 dalle cellule del tumore era giù-regolato (Figura 3A, C). Nessuna inibizione della migrazione del monocito è stata osservata con le cellule tumorali trasformate con i controlli di shRNA strapazzate, che ha anche indicato che doxiciclina ha avuto nessun effetto inibitorio sulla migrazione di monociti. Risultati simili sono stati ottenuti quando il medium condizionato delle cellule di cancro trattati con doxiciclina è stato collocato nel fondo dei pozzi come fonte di chemioattrattanti (Figura 3B, D).
Figura 1 . XhoI analisi di restrizione del DNA estratto dalle colonie batteriche 16. DNA è stato Estratto da 16 colonie batteriche e sottoposto a reazione di restrizione con l'enzima XhoI. I frammenti di DNA risultanti sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Cloni positivi (corsie 3, 8 e 11) che manca il frammento di 2 kb dopo raccolta di limitazione XhoI sono contrassegnati con le frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Espressione condizionale KD di PAI-1 in linee cellulari del cancro. Western blot analisi dell'espressione di PAI-1 in linee cellulari stabilmente trasfettate con tetraciclina-regolato pLKO-shRNA-PAI-1 (1-3 di shRNA) e uova strapazzate vettore di espressione dopo i 3 giorni del trattamento del doxycycline. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. HCT116 (C). Analisi di densitometria delle bande sono indicato sotto le corsie del Western blots come il rapporto tra l'intensità di PAI-1 sopra l'intensità di banda di tubulina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . PAI-1 promuove la migrazione del macrofago. Migrazione dei monociti umani verso MDA-MB-231 (A) e (C) HCT116 cellule linee trasfettate stabilmente con il vettore in modo condizionale che esprimono shRNA 2 contro PAI-1 e strapazzata shRNA, misurata mediante analisi dell'alloggiamento di Boyden. Le cellule tumorali sono state trattate con doxiciclina per 3 giorni e seminate in una piastra a 24 pozzetti in triplice copia. Monociti umani primari sono stati applicati nella parte superiore dell'inserto. Dopo 24 h, monociti sul lato inferiore del filtro erano macchiati e contati sotto il microscopio. Migrazione dei monociti umani verso medium condizionato generato oltre 72 h di MDA-MB-231 (B) e (D) linee cellulari HCT116 condizionalmente esprimendo PAI-1 in presenza ed assenza di doxiciclina. I dati rappresentano la media dei triplici copie tecniche [+ /-deviazione standard (SD)]. Per ogni replica, monociti migrati sono stati contati in 9 campi alle 20 X ingrandimento dell'obiettivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome dell'Oligo | Sequenza | ||||
| shRNA 1 (anti-PAI-1 sequenza 1 - 8 ) | Avanti: | shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Rovescio: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNA 2: (anti-PAI-1 sequenza 2) | Avanti: | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Rovescio: | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (anti-sequenza di PAI-1 - 3 9) | Avanti: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Rovescio: | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (rimescolare sequenza - 4 9) | Avanti: | Scramble 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Rovescio: | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Tabella 1. sequenze shRNA. Qui 3 sequenze shRNA contro PAI-1 sono stati testati per il più forte effetto di silenziamento: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3 e uova strapazzata
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Discussion
Composto da una varietà di tipi cellulari, la TME è cruciale per lo sviluppo del cancro. Per accertare le condizioni di crescita ottimali, le cellule tumorali attraggono i monociti attraverso la secrezione di fattori chemiotattici. Qui presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo di reclutamento di monociti di cellule tumorali in vitro. A tale scopo, viene utilizzata una combinazione di sistema di espressione genica viscoelastica, purificazione dei monociti umani primari e come esempio di un test di migrazione, le analisi della camera di Boyden.
Il primo passo fondamentale nel protocollo presentato è per confermare la corretta clonazione delle sequenze shRNA in vector Tet-ON, che dovrebbero sempre essere valutati mediante sequenziamento. Istituzione ulteriore delle funzionale stabile linee cellulari Tet-ON deve essere confermata dall'analisi del KD in presenza di doxiciclina mediante Western blotting. La quantità di doxiciclina applicata può variare tra linee cellulari, e pertanto si consiglia di testare le concentrazioni efficaci per KD e per tossicità sulle cellule. Uno svantaggio noto di tetraciclina-inducible sistemi è loro permeabilità6,7. La quantità di proteine rilevata in presenza ed assenza di doxiciclina deve essere misurata e confrontata ai comandi strapazzati per tenere conto di questo effetto. Negli esperimenti in vitro , un basso livello di permeabilità è osservato con il KD shRNA2 e shRNA3, come è mostrato nella Figura 2. Inoltre, è importante utilizzare sempre siero privo di tetraciclina in vitro per evitare downregulation dei livelli della proteina in condizioni di controllo. Il sistema utilizzato in questo protocollo ha vantaggi rispetto altri sistemi di Tet-ON in quanto richiede un singolo vettore di clonazione, permette la generazione veloce di più cloni e presenta livelli molto bassi di permeabilità.
Un passo fondamentale nell'ottenimento di monociti umani primari dal sangue sta ottenendo buona separazione gradiente, che si basa sul lento stratificazione del sangue diluito sopra il gradiente di densità. Un altro passo cruciale del protocollo è quello di stimare correttamente il numero di celle prima della fase di selezione negativa perché determinerà la quantità di anticorpo cocktail e magnetico perline aggiunto alla sospensione di sangue. Per assicurare la riproducibilità degli esperimenti, più di un donatore di sangue deve essere utilizzato in esperimenti di replicare. Questa tecnica è superiore alle alternative esistenti di purificazione del monocito, tra cui un gradiente di densità e di protocollo basato su adesione34 e una procedura in due fasi con gradienti singolo21, perché esso garantisce che la contaminazione di basso del linfocita livello e di alta purezza (> 95%) dei monociti ottenuti. Poiché i tipi di cellule non-monocytic vengono rimossi dalla miscela PBMC di selezione negativa, monociti non venire in contatto diretto con gli anticorpi presenti nell'anticorpo cocktail e quindi il rischio di monociti diventando attivati dall'interazione con gli anticorpi è minima. Applicazioni alternative delle cellule ottenute possono includere la differenziazione dei monociti in macrofagi attraverso esperimenti in vitro e in vivo dove monociti umani sono iniettati nei topi immunodeficienti. Modifiche del protocollo comunemente includono uso del buffer di lisi di globuli rossi durante la procedura di lavaggio delle PBMC. Questa modifica mira a ulteriore rimozione dei globuli rossi applicando la pressione osmotica. Limitazioni della tecnica includono un numero limitato di macrofagi che possono essere ottenuti utilizzando una determinata quantità di reagenti.
L'analisi di migrazione di alloggiamento di Boyden è un modo semplice e veloce per analizzare se una proteina secernuta o una linea cellulare stimola la migrazione di altri tipi cellulari. Le insidie di questo test includono bassa sensibilità e non accounting per cellule che subiscono la morte delle cellule. I modi per risolvere quei problemi sarebbero essere confermando i risultati con un dosaggio diverso come un microfluidici basato su analisi e un esperimento di corso di tempo dove la migrazione è misurata per periodi più brevi di tempo. Ad eccezione di piccole popolazioni, monociti maturi non proliferano in vivo35,36; Tuttavia se vengono utilizzate altre cellule, una linea temporale più breve di loro ciclo di divisione dovrebbe essere scelto per evitare un aumento nel numero delle cellule. In alternativa, i reagenti bloccando la divisione cellulare dovrebbero essere utilizzati per evitare di modificare il numero di cellule originariamente placcato.
Il protocollo qui presentato può essere facilmente adattato agli studi di altre proteine secernuti dalle cellule tumorali e le loro funzioni di paracrine. Una delle possibili applicazioni di linee cellulari di cancro KD condizionale sta studiando il ruolo delle proteine cui KD è tossico per le cellule non solo in vitro , ma anche in vivo, dove le linee cellulari Tet-regolati sono xenotrapiantati nei topi, e il KD è indotta dopo l'istituzione del tumore con l'aggiunta di doxiciclina per l'acqua potabile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare Jacqueline Rosenberg per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da l'US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health con una sovvenzione di YA DeClerck (concedere 5R01 CA 129377) e la Fondazione di Martell TJ. Kubala MH è il destinatario di un premio di sviluppo di carriera di ricercatrice dell'Istituto di ricerca Saban a bambini Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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