Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment

Published: November 23, 2017 doi: 10.3791/56333

Summary

Denne protokollen fungerer som en ordning for å sette opp en funksjonell Tet-ON-system i kreftcelle linjer og dets senere bruk, spesielt for å studere rollen til svulst celle-avledet proteiner i rekrutteringen av monocytter/makrofager til tumor microenvironment.

Abstract

siRNA og shRNA-mediert slå ned (KD) metoder å regulere genuttrykk er uvurderlig verktøy for å forstå gen og protein. Men i tilfelle at KD av proteinet rundt har en dødelig effekt på celler eller den forventede effekten av KD er tidsavhengige, ubetinget KD metoder ikke riktig. Betinget systemer er mer egnet i disse tilfellene, og har vært gjenstand for mye interesse. Disse inkluderer isoinokosterone-induserbart overuttrykte systemer, Cytochrome P-450 induksjon system1, og tetracyclin regulert gene expression systemer.

Tetracycline regulert gene expression systemet muliggjør reversibel kontroll over protein uttrykk ved induksjon av shRNA uttrykk i nærvær av tetracycline. I denne protokollen presenterer vi en eksperimentell design bruke funksjonell Tet-ON system i menneskets kreftcelle linjer for betinget regulering av genuttrykk. Deretter viser vi bruk av dette systemet i studiet av svulst celle-monocytt interaksjon.

Introduction

Svulst forbundet makrofager (TAMs) bidra til tumor utvikling ved å fremme tumorveksten metastasering og regulering av immunrespons2. Kreft celler rekruttere inflammatoriske monocytter, som infiltrere svulst og skille ut pro-tumorigenic TAMs3. Infiltrasjon av svulst med TAMs korrelerer med dårlig kliniske utfallet, og har vært knyttet til rollen suppressive makrofager4,5. Men mekanismer for rekruttering av makrofager til svulsten er ikke bra utforsket og en bedre forståelse av involvert veier er avgjørende for videre utvikling av feltet og lovende terapier. En av utfordringene i å studere interaksjonen mellom kreftceller og normale celler i svulst microenvironment (TME) er kompleksiteten i de mekanismer og involvert, krever i vitro tilnærminger at Disseksjon av crosstalk. Her presenterer vi en allsidig metode som kan brukes til å studere den paracrine effekten av kreft celle-stammer, utskilles protein på overføring av andre celletyper som makrofager, i vitro. Bruker et system der uttrykk for shRNA mot kreft celle-avledet protein er involvert i rekrutteringen av monocytter er under kontroll av tetracycline induserbart arrangøren, er paracrine effekten av secreted protein på monocytter quantitated. I denne protokollen etterfulgt kloning av shRNA sekvenser i tetracycline regulert vektor vises av generasjon av stabil kreftcelle linjer. Videre, rensing av primære menneskelige monocytter og en Boyden kammer analysen brukes til å analysere paracrine effekten av en kreftcelle avledet protein på overføring av monocytter.

Downregulation protein koding gener brukes vanligvis med siRNA og shRNA teknikker, men ikke uten begrensninger i bruk. Den langsiktige knock-ned (KD) av gener kan framprovosere sekundære adaptive svar som forstyrrer eksperimentelle resultater. Timelige kontroll over genuttrykk gjør det utfordrende å studere dynamisk rollen til et protein over tid eller rollen til en protein er avgjørende for cellen overlevelse. Dette problemet er særlig viktig i i vivo innstillinger, der rollen til en protein i tumor utvikling og progresjon kreve downregulation i uttrykket protein av interesse bare etter svulst er opprettet. Betinget KD har fordelen av å forhindre en for tidlig dødelig effekt av KD på celler og aktiverer analyse av rollen av proteinet i ulike stadier av tumor vekst, mens ubetinget KD kan føre til mangel på tumor utvikling.

En rekke betinget KD systemer er utviklet for å løse begrensningene for stabil KD. Betinget gene expression systemene inkluderer isoinokosterone-induserbart overuttrykte systemer, den Cytochrome P-450 induksjon system1, og tetracycline regulert gene expression systemer. Tetracycline regulert gene expression-systemer tillater kontroll over uttrykk for shRNA på tillegg av antibiotika tetracycline (eller dens mer stabil analog - doxycycline). I Tet-ON systemer, uttrykk for shRNA er indusert i nærvær av tetracycline/doxycycline resulterer i en genuttrykk KD, mens i Tet av systemer, uttrykk for shRNA er undertrykt i nærvær av tetracycline resulterer i genuttrykk. En ulempe av tetracycline-induserbart system er tidligere rapportert lave nivåer av uttrykk for shRNA i fravær av doxycycline - såkalte leakiness6,7. Tet-on beskrevet systemet her, ved administrasjon av tetracycline, bindingen constitutively uttrykt tetracycline repressor (TetR) protein Tet svarer element (TRE) sekvensen i H1 promoter regionen shRNA av interesse er undertrykt. Dette gir uttrykk for shRNA og hemming av oversettelse av protein interesse tetracycline-avhengige måte8,9.

Andre tilgjengelige Tet-ON-systemer inkluderer samtidige banke på Tejo sekvens mellom TATA boksen og proksimale rekkefølge element (PSE) og mellom TATA boksen og transkripsjon starte nettsted utviklet av Chan et al. 10 dette systemet krever mindre enn giftige doser av tetracycline å regulere shRNA uttrykk, men under en ikke-indusert stat, lave nivåer av shRNA uttrykkes. Krüppel-assosiert boks (KRAB) basert Tet-ON systemet11 inneholder KRAB, en sink finger protein, som fag gener ligger innenfor en 3 kb KRAB binding området til transcriptional undertrykkelse. Chimeric protein tTRKRAB kan binde til Tejo, og på grunn av det store spekter av DNA kontrollerbar kapasitet, Tejo ikke trenger å være begrenset mellom transkripsjon området og arrangøren og har lav innvirkning på aktiviteten til arrangøren. Under ikke-indusert staten, ble kontrollerbar RNA forstyrrelser systemet rapportert til å vise et lavere nivå av lekkasje uttrykk for shRNA11,12; det krever imidlertid en sekvensiell, to-vector kloning tilnærming. I forhold til tidligere utviklet betinget KD systemer som isoinokosterone-induserbart overuttrykte systemet eller Cytochrome P-450 induksjon system, tetracycline regulert systemet har fordelen av sin robusthet og Reversibilitet, og derfor er de brukes rutinemessig system13. Systemet brukes i denne protokollen har en fordel dobbelt Tejo banke i systemene og KRAB Tet-ON som det krever rett frem, enkelt vektor kloning, tillater rask generasjon av flere kloner, og det har svært lave nivåer av leakiness i den fravær av doxycycline.

TME er avgjørende for utviklingen av kreft. For å lette tumor vekst, rekruttere kreftceller inflammatoriske monocytter av sekresjon chemotactic proteiner. Rekruttert monocytter infiltrere svulsten og skille ut pro-tumorigenic TAMs som bidrar til tumor vekst og metastasering. In vitro studier av immun cellen rekruttering utnytte migrasjon analyser, Boyden kammeret analysen er mye brukt14,15,16,17. I denne analysen, er chemoattractant protein kilden, for eksempel kreftceller, eller en renset protein, plassert i bunnen kammeret. Immunceller plasseres i det øvre kammeret atskilt med porøs membran fra nederste. Celler migrere mot økende gradient av chemoattractant, og de som finnes på undersiden av membran er farget og regnet under mikroskopet. Her teste vi funksjonen chemoattractant Plasminogen aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) på monocytter ved å generere stabil, induserbart kreftcelle linjer der uttrykk for PAI-1 er regulert av doxycycline tillegg. Vi bruker menneskelige primære monocytter i Boyden kammeret migrasjon analysen for å vurdere rollen PAI-1 i monocytt migrasjon. Forskjellene mellom menneskelig primære monocytter og brukte monocytic cellelinjer som THP1 er rapportert og inkluderer forskjellige cytokin uttrykk mønstre18; 5-10 fold økning i TNF-α uttrykk nivåene av THP1 celler sammenlignet eksempelvis menneskelige monocytter19. THP1 celler er avledet fra menneskelige leukemi monocytic celler, er lett å vedlikeholde og spre med gjennomsnittlig dobling tid 19-50 h20. Tvert imot, er menneskelig monocytter preget av en kort levetid i fravær av vekstfaktorer. Siden monocytter er renset fra blodet av givere, en god del variasjon oppstår blant personene og avhengig av metoden rensing oppstå forurensning med andre celletyper. Likevel primære monocytter er relevante og det er anbefalt å bruke eller bekrefte resultatene med de monocytic linjene med primære monocytter i biologiske19. Her beskriver vi en protokoll for rensing av menneskelig primære monocytter fra perifert blod. Alternative metoder for monocytt rensing inkluderer tetthet gradert og vedheft protokoller og to steg fremgangsmåte med enkelt graderinger av Ficoll-Hypaque etterfulgt av Percoll gradient21. Renheten av monocyte befolkningen ved de metoder varierer mellom 70-90%. Metoden beskrevet her bruker en tetthet gradert etterfulgt av en negativ immun utvalg22 og gjør rensing av menneskelig monocytter uten direkte kontakt med antistoffer, og dermed unngå utilsiktet aktivisering og resulterer i en > 95% ren befolkningen av monocytter.

Protokollen presenteres her brukes for å sette opp en funksjonell Tet-ON system for genuttrykk KD i menneskets kreftcelle linjer til å studere chemoattractant effekten av kreft-avledet secreted protein PAI-1 på monocytter. PAI-1 er overexpressed av en rekke svulster og uttrykket korrelerer paradoksalt med dårlig kliniske utfallet23,24. Pro-tumorigenic rollen som PAI-1 er et resultat av sin pro-angiogenic og anti-apoptotisk fungerer25,26. PAI-1 har vist seg å bidra til betennelse ved å fremme rekrutteringen av makrofager til området av betennelse27. PAI-1 ble vist å fremme glatt muskel cellmigration28,29 og delta i Mac-1 avhengige macrophage overføring30. PAI-1 overuttrykte har også blitt vist å betydelig forbedre rekruttering av rå 264.7 makrofager i B16F10 melanom svulster31. Men har rollen som PAI-1 i TAM overføring ikke blitt undersøkt i detalj. Vi bruker beskrevet protokollen for å besvare spørsmålet om PAI-1 tiltrekker monocytter til kreftceller. Denne metoden gjør at Disseksjon av crosstalk mellom svulst og TME ved å stanse secreted protein i kreftcellene og analysere komponentene i TME.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Delen protokollen som bruker menneskelige monocytter fra friske frivillige følger retningslinjene i barnas Hospital Los Angeles menneskelige forskning etikk og er godkjent av institusjonelle gjennomgang styret under den menneskelige materiale Protokollen nummer: CCI 08-00208.

1. utarbeidelse av kreftcelle linjer med Tetracycline regulert shRNA uttrykk

  1. Kloning av shRNA PAI-1 i Tet-pLKO-puro vektor 8 , 9
    1. Utforme shRNA oligomers som inneholder alderjeg og EcoRI cleavage nettsiden på 5' slutten, følelse sekvensen, en 6 nukleotid løkke og antisense sekvensen.
      Merk: Typisk oligonucleotides er utformet slik: frem oligo: 5' CCGG - 19-21 bp forstand - CTCGAG - 19-21 bp antisense - TTTTT, omvendt oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp forstand - CTCGAG - 19-21 bp antisense 3. Detaljert protokollen for oligomer design kan bli funnet i 8. I denne studien 3 shRNA sekvenser mot PAI-1 ble testet for sterkeste stanse effekten: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333og krabbet33 er inkludert i tabell 1.
    2. Anneal shRNA oligomers og eggerøre shRNA oligomers.
      1. Rekonstituer oligonucleotides til 100 µM i vann og bland 1 µL frem oligonucleotide, 1 µL omvendt oligonucleotide og 8 µL H2O.
      2. For å anneal på oligonucleotides, bland følgende: 1 µL oligonucleotide blanding, 5 µL buffer 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM natriumklorid (NaCl), 10 mM magnesiumklorid (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) og 44 µL H 2 O.
      3. Inkuber blandingen i en polymerase kjedereaksjon (PCR) termisk cycler ved 95 ° C i 5 minutter, slå av maskinen og vente til romtemperatur (RT) er nådd.
    3. Utløse glødet oligonucleotides ved å legge til 5 µL 3 M natrium Acetate pH 5.2 50 µL herdet oligonucleotides.
      1. Legg 100 µL kaldt 100% etanol (EtOH) og ruge i 30 min på-80 ° C. Virvel i en Borstemmaskin sentrifuge med maksimal hastighet i 30 min på 4 ° C.
      2. Fjern nedbryting, legge 500 µL kaldt 70% EtOH, sentrifuge for 30 min, fjerne nedbryting og oppløse pellet i 20 µL H2O.
      3. Vurdere konsentrasjonen av glødet oligonucleotides ved spectrophotometry, måle absorbansen på 260 nm. Fortynn oligonucleotides til siste konsentrasjonen av 1 ng/µL.
    4. Forberede Luria Bertani (LB) medium og LB agar plater.
      1. For LB medium, oppløses 10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl i 1 L vann. Justere pH på mellomlang til pH 7.0 bruker 1 N NaOH og autoclave.
      2. For LB agar plater, legge 15 g/L agar i LB medium. Autoclave og kjølig ned ca 50 ° C. Legge til antibiotika og hell platene.
    5. Strek bakterier transduced med Tet-pLKO-puro vektor (se Tabell for materiale) på LB agar plate supplert med 100 µg/mL ampicillin og ruge over natten (O/N) på 37 ° C.
    6. Vaksinere 100 mL LB medium med 100 µg/mL ampicillin (LB/ampicillin) med 1 koloni fra platen og vokse O/N med skjelvende på 37 ° C.
    7. IsolateTet-pLKO-puro fra 100 mL bakteriell kultur med en plasmider isolering kit.
    8. Forberede begrensning reaksjonen for Tet-pLKO-puro vektoren med EcoRI og AgeI begrensning enzymer som følger: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmider DNA (1 µg), 42 µL H2O. ruge 1 h på 37 ° C. For å få nok av kløyvde vektor, forberede opptil 5 x 50 µL reaksjoner.
    9. Bruke 1% agarose gel for å rense kløyvde vektor fra agarose gel bruker en DNA rensing kit. For å øke avkastningen av DNA, minimere agarose DNA forhold i gel ved hjelp av en agarose gel kam store brønner og nøye fjerne mesteparten av agarose fra bandet ved hjelp av en skalpell.
    10. Forberede ligation reaksjonen blanding som følger: 1 ng herdet oligonucleotides, 50 ng kløyvde vektor, 2 µL 10 x ligase buffer, 1 µL ligase og vann opp til 20 µL. Ligate vektor med glødet shRNA oligonucleotides på 16 ° C O/N.
      1. Forberede i tillegg en negativ kontroll reaksjon uten oligonucleotides å ta hensyn til uncleaved, delvis kløyvde og selv samskrevet vektor som vil føre til falske positive kolonier.
    11. Bruke standard transformasjon teknikker, forvandle ligation blandinger til kjemisk kompetent bakterielle celler for å unngå homologe rekombinasjon lentiviral vektorer som inneholder direkte gjentakelser.
    12. Vokse bakterier på plater med ampicillin O/N på 37 ° C.
      Merk: Hvis veksten av satellitt kolonier, gjenta transformasjon og vokse bakterier på 30 ° C til å bremse veksten, og dermed hindre satellitt kolonier.
    13. For å bekrefte vellykket hemorroider, velge mellom 10-20 enkelt kolonier, vaksinere 2 mL LB/ampicillin kulturer og en ampicillin plate som en lager plate (som skal brukes som en positiv klone senere). Vokse flytende kulturer med skjelvende O/N på 37 ° C. Inkuber platen O/N på 37 ° C.
    14. Forsegle platen med parafilm og lager på 6 ° C.
    15. Isolere plasmider DNA fra flytende kulturer ved hjelp av en plasmider isolering kit.
    16. Utføre begrensning analyse av plasmider DNA isolert fra ampicillin-resistente kolonier ved hjelp av XhoI enzym. For hver klone, forberede følgende reaksjonen blanding: 0,5 µL XhoI, 2,5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmider DNA (0,5 µg), og 21 µL H2O. Incubate 1t på 37 ° C. Analysere resultatet av begrensning reaksjonen ved å kjøre reaksjonen på en 1% agarose gel.
      Merk: Begrensning analyse av WT vektoren med XhoI vil generere 3 fragmenter: 8,447, 1800 og 200 bp. Stuffer rekkefølgen Tet-pLKO-puro vektor av 1800 bp finnes ikke i positiv kloner som inneholder shRNA-PAI-1 og XhoI sammendraget vil resultere i DNA fragmenter av størrelse: 8,447, 190 og 130 bp. Som vist i figur 1, 2000 bp fragmentet finnes ikke i DNA isolert fra ampicillin motstandsdyktig kolonier tall: 3, 8 og 11. Avhengig av oligonucleotides, kan lengde og antall innhentet fragmenter i DNA fra positiv koloniene variere.
    17. Kontroller riktig innsetting av shRNA sekvenser i Tet-pLKO-puro vektor av sekvensering8,9.
    18. Vaksinere 100 mL LB/Ampicillin kultur med kolonien inneholder riktig klone og vokse O/N på 37 ° C.
    19. Isolere plasmider DNA ved å bruke en plasmider isolering kit.
  2. Generering av lentivirus partikler.
    1. Coat en 15 cm vev kultur parabol med Poly-L-Lysine av dekker overflaten av fatet med sterilt vann løsning på 0,01% Poly-L-Lysine og rugende på RT i 15 min. fjerne løsningen av aspirasjon og air-dry retter.
    2. Frø 5 x 106 menneskelige embryonale nyre 293 celler (HEK293) celler i Poly-L-Lysine-belagt 15 cm parabolen, og kultur i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) medium supplert med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin blanding (penn/Strep) ved 37 ° C, 5% CO 2 til de når 70% confluency.
    3. For å produsere virus partikler, transfect HEK293 celler med 25 µg pLKO-Tet-på-shRNA, 25 µg psPAX, (emballasje plasmider), og 5 µg pMD2.G plasmider (konvolutt uttrykke plasmider) bruker transfection reagens.
      Merk: psPAX og pMD2.G plasmider er en gave fra Didier Trono lab (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Sveits).
    4. Indusere HEK293 celler dagen ved å endre medium DMEM med 10 mM natrium butyrate og 20 mM HEPES pH 7,2 og dyrking 8 h.
    5. Vask cellene med fosfat-bufret saltvann (PBS) og legge til 25 mL av fersk DMEM middels inneholder 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) pH 7.2. Etter inkubasjon ved 37 ° C i 48t nøye samle virus inneholder middels av pipettering; unngå søl.
    6. Filtrere samlet mediet gjennom et 0,45 µM sprøyte-filter for å fjerne HEK293 celler. Mediet som inneholder virus partikler kan brukes umiddelbart eller lagret ved-80 ° C for senere bruk.
  3. Generasjon av stabilt transfekterte linjer
    1. Frø HCT116 tykktarmskreft celler og MDA-MB-231 brystkreft celler på 50.000 celler/godt i DMEM medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penn/Strep i en 12-vel plate. Ruge på 37 ° C på 5% CO2 til celler er 60-70% confluent.
    2. Vask celler med PBS og legge 1 mL av virus inneholder medium til kreft celler og ruge O/N på 37 ° C på 5% CO2. En kontroll, legge til 1 mL av fersk DMEM medium med 10% FBS og 1% penn/Strep 2 brønner kreftceller.
    3. Nøye fjerne virus inneholder medium ved aspirasjon. Vask cellene med PBS og endre mediet til DMEM med 10% (v/v) tetracycline-fri (Tet-ledig) FBS og 1% penn/Strep.
    4. Etter 72 h, vask celler med PBS og endre mediet til DMEM 10% Tet-fri FBS 1% penn/Strep, 1 µg/mL puromycin for valg av virus-transfekterte celler.
      1. Avhengig av den celle linjen brukes, justere puromycin konsentrasjonen for optimal valg ved å teste området for puromycin (0.1, 0.5, 1, 2 og 5 µg/mL) i ikke-transduced celler og velge den laveste konsentrasjonen hvor ingen kontroll celler overleve etter 3 dager for kultur.
    5. Velg virus-transduced celler av dyrking celler i nærvær av puromycin 3-14 dager. Som kontroller, forberede to flere brønner med ikke-transduced celler, med medium som inneholder puromycin og uten puromycin. Observere delvis drapet på cellene ved puromycin i brønnen med virus-transduced celler i forhold til kontrollen brønner.
      Merk: Ikke-transduced celler vil ikke vokse i nærvær av puromycin.
    6. Kontrollere effektiviteten av betinget KD i puromycin-resistente HCT116 tykktarmskreft og MDA-MB-231 brystkreft celler.
      Merk: Effektiv konsentrasjonen av doxycycline varierer avhengig av den celle linjen brukes og må være titreres (vanligvis fra 100 ng/mL til 2 µg/mL).
      1. Bestemme doxycycline konsentrasjonen som ikke giftig for cellene men effektiv downregulating uttrykket av protein av interesse. I denne protokollen var 1 µg/mL vellykket brukt i vitro.
      2. Kultur celler for 72 h i tilstedeværelse og fravær av 0.1, 1 og 2 µg/mL doxycycline. Kontroller nivået av uttrykk for downregulated protein (her, PAI-1) i cellen lysate Western blot analyse. Sammenligne HCT116 og MDA-MB-231 celler uttrykke betinget shRNA kryptert kontroll celler.
  4. Utarbeidelse av betinget medium
    1. Frø 1 x 106 celler stabilt transfekterte med doxycycline regulert pLKO-shRNA som inneholder lentiviruses i 10 cm retter.
    2. Vokse cellelinjer i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% Tet-fri FBS og 1% penn/Strep i fravær og tilstedeværelsen av 1 µg/mL doxycycline 72 h på 37 ° C på 5% CO2, legge frisk doxycycline daglig.
      Merk: RPMI medium er kompatibel med oppdrettsforholdene av monocytter. Doxycycline er en lys følsom stoff. Beskytte i cellekulturer fra lys ved dekker med aluminiumsfolie og unngå arbeider under direkte eksponering.
    3. Samle mediet av pipettering filtrere gjennom 0,45 µm og fryse på-80 ° C i dele.

2. isolering av monocytter fra Human Blood

  1. Isolere monocytter fra menneskelige perifert blod.
    Merk: Human primære monocytter er isolert fra 7 mL av hvite blodlegemer konsentrert i et leukocytt filter fra sunn Platederivert givere. Avhengig av donor produserer ett leukocytter filter mellom 1 x 109 og 2 x 109 i perifert blod mononukleære celler (PBMCs), ca 10% som utgjør monocytter.
    1. Forberede arbeidsstasjonen i laminær strømning kabinett.
    2. Sterilisere saks og laminær strømning kabinett med ultrafiolett lys (UV) i 30 min.
    3. Spray leukocytter filteret med 70% EtOH og air-dry inne laminær strømning kabinett.
    4. Klippe begge ender av leukocytter filteret med saks og tømme innholdet i filteret i en 50 mL tube.
    5. Fortynne til 90 mL ved å legge til PBS inneholder 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
    6. Forberede 3 x 50 mL rør med 15 mL tetthet gradert løsning. Laget sakte 30 mL PBS/FBS utvannet blod over tetthet gradert løsning bruker en pipette kontroller angi om gravitasjonsakselerasjonen flyt å unngå blanding av lagene.
    7. Virvel i en swing rotor 400 x g på RT uten bremser for 25 min.
    8. Kast det øverste laget og overføre det midterste laget som inneholder PBMCs til en frisk 50 mL tube.
    9. Legge PBS/FBS 50 mL og sentrifuge 120 x g på RT for 10 min. fjerne nedbryting inneholder blodplater. Gjenta dette trinnet to ganger.
    10. Resuspend pellet i 50 mL av PBS/FBS og telle PBMCs med en hemocytometer. Sentrifuge 120 x g på RT og resuspend pellet i PBS/FBS inneholder 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) til en siste konsentrasjon av 5 x 107 celler/mL.
    11. Bruk en negativ utvalg kit for å berike monocytter ved utarming av ikke-monocytic celler.
      Merk: Den negative utvalg kit bruker en cocktail av antistoffer (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 og glycophorin A) mot T celler, NK celler, nøytrofile, B celler, granulocytter og erytrocytter. Antistoff komplekser binde overflaten av disse ikke-monocytic celler og dekstran magnetiske partikler. Når røret er plassert i en magnet, perler overholder veggene av rør og fjerne ikke-monocytic celler fra løsningen.
      1. Legge til 50 µL antistoffer cocktail i 1 mL av 5 x 107 PBMCs/mL, bland med en pipette, og ruge i 10 min på RT. legge 50 µL magnetiske perler til PBMCs med antistoffer cocktail, bland med en pipette og ruge for en annen 10 min på RT.
      2. Legge til PBS/FBS/EDTA opptil 25 mL og sted PBMC blandingen i en magnet som rommer en 50 mL tube. Inkuber i 10 min på RT. magnetiske perler vil følge veggene av røret og beslaglegge ikke-monocytic cellene fra løsningen.
    12. Bruker en 25 mL pipette, fjerne løsningen som inneholder monocytter fra røret i magneten. Vær forsiktig så du ikke berører sidene av røret med pipette.
    13. Sentrifuge løsningen på 250 x g ved RT, fjerne nedbryting og resuspend pellets inneholder monocytter i RPMI medium som inneholder 10% Tet-fri FBS og 1% penn/Strep.

3. Boyden kammeret migrasjon analysen

  1. Forberede 1% (w/v) bovin serum albumin (BSA) løsning ved å løse opp 1 g BSA i 100 mL ultrapure vann, og filtrere gjennom en 0,2 µm porestørrelse å sterilisere.
  2. Inkuber porøs membran innsettinger i 1% sterile BSA løsning O/N for forbedret overholdelse av makrofager membranen. Monocytter/makrofager, bruke 5-8 µm pore størrelse setter inn.
    1. Fylle en steril vev kultur parabol med 1% BSA løsning og Legg skivene i fatet. Bruke 200 µL 1% BSA løsning innenfor skivene.
  3. Vask som setter inn to ganger ved å plassere dem i en fat fylte med sterilt PBS og bruk PBS inne filteret.
  4. Frø 40.000 HCT116 eller MDA-MB-231 celler i 0,5 mL RPMI medium som inneholder 10% Tet-fri FBS og 1% penn/Strep per Vel, en 24-vel monteringsplate i tre eksemplarer. Alternativt sted 0,5 mL av tidligere genererte betinget medium i brønnen som en kilde til chemoattractant.
  5. Neste dag, plate 8000 monocytter i den forberedt sett inn i 0,3 mL volum av RPMI mediet som inneholder 10% Tet-fri FBS og 1% penn/Strep, i tre eksemplarer, og Inkuber på 37 ° C på 5% CO2.
  6. Samle som setter inn etter 48 timer.
    Merk: Lengden på et eksperiment må optimaliseres avhengig av bestemte betingelser og celler som brukes, ved å utføre en tid-retters eksperiment der setter er samlet på ulike inkubasjon ganger.
    1. Rist av overflødig mediet og nøyaktig dra overflatebehandling med en bomull-tipped applikator fjerne celler som ikke migrerte.
    2. Flekk av skivene med metoden Wright-Giemsa.
    3. Nøye montere 3 innsettinger/glass lysbilde i en høy viskositet mikroskop neddyppingsolje, sørge for at siden av filteret med overførte makrofager vender opp..
  7. Bilde lysbildene med lys mikroskop med 20 X mål. Ta bilder av 9 felt/filter. Telle overførte makrofager i 9 felt/filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre shRNA sekvenser ble testet for den mest effektive KD PAI-1. For dette, ble shRNA sekvenser mot PAI-1 og eggerøre (tabell 1) klonet i Tet-pLKO-puro uttrykk vektor følger protokollen beskrevet ovenfor. HT-1080 fibrosarcoma celle linjen var stabilt transfekterte med genererte konstruksjoner og cellene ble behandlet med doxycycline for 3 dager. Uttrykk for PAI-1 ble bekreftet av Western blotting ()figur 2A) og intensiteten av bandene tilsvarer PAI-1 og tubulin ble analysert av densitometry. Bruke mest effektive KD sekvensen (shRNA 2), vi i tillegg generert MDA-MB-231 epithelial bryst adenocarcinoma cellene (figur 2B) og HCT116 colorectal karsinom (figur 2C) stabilt transfekterte med en tetracycline regulert pLKO-shRNA2-PAI-1 uttrykk vektor (og shRNA eggerøre som en kontroll). Vi oppnådde en 74% reduksjon av PAI-1 uttrykk i MDA-MB-231 celle linje (tallet 2B) og 17,5% nedgang i HCT116 celle linje i nærvær av doxycycline (1 µg/mL)((figur 2C)) som vurdert av vestlige blotting og densitometric analyse av bandene. Boyden kammeret analysen ble brukt om å kvantifisere migrering av monocytter mot kreftceller. Vi hypotese som kreft celle-avledet PAI-1 fremmer migrering av monocytter mot kreftceller, og derfor mindre overføring vil bli observert når PAI-1 er downregulated med tillegg av doxycycline. Kreftceller ble behandlet med doxycycline for 3 dager og ble sådd i bunnen av en 24-vel plate på 40 000 celler/godt. Renset primære menneskelige monocytter ble brukt i den øverste kammeret til analysen og etter 24 timer, monocytter festet til undersiden av membranen var farget og regnet under mikroskopet. Vi viser at i fravær av doxycycline og derfor tilstedeværelsen av PAI-1, MDA-MB-231 og HCT116 celler (både PAI-1 shRNA og eggerøre kontroller), betydelig økt migrasjon av menneskelig monocytter (Figur 3). Migrering av monocytter var så hemmet av 33% og 74% når doxycycline ble lagt til co kulturer og produksjon av PAI-1 av kreftceller var ned-regulert (figur 3A, C). Ingen hemming av monocyte migrasjon ble observert med tumorceller transduced med stekte shRNA kontrollene, som også indikert at doxycycline hadde ingen hemmende effekt på monocytt migrasjon. Lignende resultater ble oppnådd når betinget mediet av doxycycline-behandlet kreftceller ble plassert i bunnen av brønnene som en kilde til chemoattractants (figur 3B, D).

Figure 1
Figur 1 . XhoI begrensning analyse av DNA utvunnet fra 16 bakteriell koloniene. DNA ble Hentet fra 16 bakteriell koloniene og utsatt for begrensning reaksjon med XhoI enzym. De resulterende DNA-fragmentene ble analysert av agarose gel geleelektroforese. Positiv kloner (baner 3, 8 og 11) som mangler 2 kb fragmentet etter XhoI begrensning digest er merket med piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Betinget KD av PAI-1 uttrykk i kreftcelle linjer. Western blotting analyse av PAI-1 uttrykk i cellelinjer stabilt transfekterte med tetracycline regulert pLKO-shRNA-PAI-1 (shRNA 1-3) og eggerøre uttrykk vektor etter 3 dager for doxycycline behandling. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. Densitometry analyse av bandene angis under lanes av vestlige blotter som et forhold mellom PAI-1 intensiteten over tubulin band intensiteten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . PAI-1 fremmer macrophage migrasjon. Migrering av menneskelig monocytter (A) MDA-MB-231 og (C) HCT116 cellen linjer stabilt transfekterte med vektor betinget uttrykke shRNA 2 mot PAI-1 og krabbet shRNA, målt ved hjelp av Boyden kammeret analysen. Kreftceller ble behandlet med doxycycline for 3 dager og sådd i en 24-vel plate i tre eksemplarer. Menneskets primære monocytter ble brukt på innsatsen. Etter 24 timer, ble monocytter på undersiden av filteret farget og regnet under mikroskopet. Migrering av menneskelig monocytter mot betinget medium generert over 72 h ved (B) MDA-MB-231 og (D) HCT116 cellelinjer betinget uttrykke PAI-1 i tilstedeværelse og fravær av doxycycline. Dataene representerer gjennomsnittet av tekniske triplicates [+/-standardavviket (SD)]. For hver replikere, ble migrerte monocytter regnet i 9 felt på 20 X objektive forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navnet på Oligo Sekvens
shRNA 1 (anti PAI-1 sekvensen 1 - 8 ) Frem: shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3
Omvendt: shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3
shRNA 2: (sekvens 2 anti PAI-1) Frem: shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3 "
Omvendt: shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3 "
shRNA 3 (anti PAI-1 sekvensen - 3 9) Frem: shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3 "
Omvendt: shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3 "
Rykke ut (flytte rundt sekvens - 4 9) Frem: Rykke ut 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3 "
Omvendt: Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3 "

Tabell 1. shRNA sekvenser. Her 3 shRNA sekvenser mot PAI-1 ble testet for sterkeste stanse effekten: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3, og kryptert

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Består av en rekke celletyper, er TME avgjørende for utviklingen av kreft. For å fastslå optimale forhold, tiltrekke kreftceller monocytter gjennom utskillelsen av chemotactic faktorer. Her presenterer vi en protokoll for å studere mekanismen av monocyte rekruttering av tumor celler i vitro. For dette formålet brukes en kombinasjon av induserbart gene expression system, rensing av primære menneskelige monocytter og som et eksempel på en overføring analysen, Boyden kammeret analysen.

Det første kritiske trinnet presentert protokollen er å bekrefte riktig kloning av shRNA sekvenser i Tet-ON vektor, som alltid bør vurderes av sekvenser. Videre etablering av funksjonelle stabil Tet-på cellen linjene må bekreftes av tester KD i nærvær av doxycycline av vestlige blotting. Hvor mye brukt doxycycline kan variere mellom linjer, og derfor er det lurt å teste effektiv konsentrasjonen for KD og toksisitet på cellene. En kjent ulempe av tetracycline-induserbart systemer er deres leakiness6,7. Mengden av protein i tilstedeværelse og fravær av doxycycline må målt og sammenlignet med eggerøre kontrollene konto for denne effekten. I vitro eksperimenter, er lave leakiness observert med shRNA2 og shRNA3 KD, som vist i figur 2. I tillegg er det viktig å alltid bruke tetracycline-fritt serum i vitro for å unngå downregulation av protein i kontroll forhold. Systemet brukes i denne protokollen har fordeler over andre Tet-på systemer som krever en enkelt vektor kloning, tillater rask generering av flere kloner, og har svært lave nivåer av leakiness.

En avgjørende skritt å skaffe primære menneskelige monocytter fra blod er å få god gradient separasjon, som bygger på treg lagdeling utvannet blod over tetthet graderingen. Et annet viktig skritt av protokollen er riktig beregne antall celler før negative utvalg trinn fordi det vil avgjøre mengden av antistoff cocktail og magnetiske perler lagt til blod suspensjon. For å sikre reproduserbarhet eksperimenter, bør flere blodgiver brukes til å utføre Repliker eksperimenter. Denne teknikken er overlegen til eksisterende alternativer for monocytt rensing inkludert tetthet gradering og heft-basert protokoll34 og en to-trinns prosedyre med enkel graderinger21, fordi det garanterer lav lymfocytt forurensning nivå og høy renhet (> 95%) av innhentet monocytter. Siden de ikke-monocytic celletyper er fjernet fra PBMC blanding av negative utvalg, kommer monocytter ikke i direkte kontakt med antistoffer i antistoffer cocktail, og derfor risikoen av monocytter bli aktivert av interaksjon med antistoffer er minimal. Alternative programmer innhentet celler inneholder differensiering av monocytter i makrofager gjennom i vitro og vivo eksperimenter der menneskelige monocytter blir injisert i immunodeficient mus. Endringer av protokollen inkluderer vanligvis bruk av røde blodlegemer lyseringsbuffer under vask trinnene i PBMCs. Denne endringen tar sikte på flere fjerning av røde blodlegemer ved å bruke osmotisk trykk. Begrensninger av teknikken omfatter et begrenset antall makrofager som kan oppnås med en angitt mengde reagenser.

Boyden kammeret migrasjon analysen er en rask og enkel måte å analysere om en secreted protein eller en celle linje stimulerer migrering av andre celletyper. Fallgrubene denne analysen inkluderer lav følsomhet og ikke regnskap for cellene gjennomgår celledød. Måter å ta opp disse bekymringene ville være å bekrefte resultatene med en annen analysen som en microfluidic basert analyse og en tid-retters eksperiment der overføringen måles i kortere perioder. Bortsett fra små bestander, modne monocytter ikke sprer i vivo35,36; Hvis andre celler, bør imidlertid en tidslinje kortere enn deres divisjon syklus velges å unngå en økning i antall celler. Alternativt skal reagenser blokkerer celledeling brukes til å unngå å endre opprinnelig belagt celle nummer.

Protokollen presenteres her kan lett tilpasses studier av andre proteiner utskilles av kreftceller og deres paracrine funksjoner. En av de mulige anvendelser av betinget KD kreftcelle linjer studerer rollen proteiner som KD er giftig for cellene ikke bare i vitro , men også i vivo, der Tet-regulerte linjer er xenotransplanted i mus, og KD er indusert etter etableringen av svulst med tillegg av doxycycline i drikkevannet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Jacqueline Rosenberg for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av det oss Department of Health and Human Services/National Institutes of Health med et stipend for YA DeClerck (gi 5R01 CA 129377) og TJ Martell Foundation. MH Kubala er en karriere utvikling forskningsstipend pris av Saban Research Institute ved Children's Hospital Los Angeles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tet-pLKO-puro lentiviral vector Addgene 21915
FBS (Tetracycline-free) Omega Scientific FB-15
Histopaque Sigma 10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell 19059
EasySep Magnet StemCell 18002
EcoRI HF NEB R3101S
AgeI HF NEB R3552S
Cut Smart buffer NEB B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System PROMEGA A9281
psPAX vector Addgene 12260
pMD2.G vector Addgene 12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain Protocol 123-869
HEK293 cells ATCC CRL-1573
PBS Corning 21-031-CV
XhoI restriction enzyme NEB R0146S
Ligase NEB M0202S
Ligase buffer NEB M0202S
EDTA 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific R1021
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
The Big Easy" EasySep Magnet Stem Cell 18001
0.1% Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S7670
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
0.45 μM syringe filters VWR International 28145-479
NaOH Sigma-Aldrich S5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Invitrogen 15504-020
Sodium Chloride(NaCl) Sigma-Aldrich S7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-100g
dithioerythritol (DTE) Sigma-Aldrich B8255-5g
ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 792780
tryptone Amresco J859-500g
yeast extract Fluka 70161-500g
Bacto agar BD 214010
ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
puromycin Sigma-Aldrich P9620
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Corning 10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific R1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane Becton Dickinson 353097
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cotton-Tipped Applicator  Medline MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack  Fisher Scientific Company 123-869
Resolve Immersion Oil, High Viscosity Richard Allan Scientific M4004
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).

Tags

Kreftforskning problemet 129 betinget banke ned celle migrasjon doxycycline shRNA PAI-1 monocytter kreftcelle linjer
Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubala, M. H., DeClerck, Y. A.More

Kubala, M. H., DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (129), e56333, doi:10.3791/56333 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter