Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand

Published: September 26, 2017 doi: 10.3791/56334

Summary

Denne publikation beskriver fabrikation af en orgel-on-chip enhed med integreret elektroder til direkte kvantificering af transendothelial elektrisk modstand (TEER). For validering, blod - hjerne barrieren var efterlignede inde denne mikrofluid enheden og dens barriere funktion blev overvåget. De præsenterede metoder til elektrode integration og direkte TEER kvantificering er generelt gældende.

Abstract

Organer på chips, in vitro- modeller der involverer kultur af (menneskelige) væv inde i mikrofluid enheder, er hurtigt opstå og løfte om at give nyttig forskning værktøjer til at studere menneskers sundhed og sygdom. For at karakterisere den barriere funktion af cellelag kulturperler inde orgel-on-chip enheder, måles ofte transendothelial eller transepithelial elektrisk modstand (TEER). Med henblik herpå integreres elektroder normalt i chippen ved micromachining metoder at give mere stabile målinger end opnås med manuel indsætning af elektroder i indløb af chippen. Men disse elektroder ofte hæmmer besigtigelse af de undersøgte cellelag eller kræver dyre renrum processer for fabrikation. For at overvinde disse begrænsninger, indeholder den enhed, der beskrives her fire nemt integreret elektroder, der er placeret og fast uden for området kultur, gør besigtigelse muligt. Brug af disse fire elektroder modstand af seks måling stier kan kvantificeres, hvorfra TEER kan være direkte isoleret, uafhængig af modstanden i dyrkningsmediet-fyldt microchannels. Blod - hjerne barrieren blev replikeret i denne enhed og dens TEER blev overvåget for at vise enhed anvendelighed. Denne chip, de integrerede elektroder og TEER bestemmelse metode er generelt gældende i organer-på-chips, både til at efterligne andre organer eller til at indgå i eksisterende orgel-on-chip systemer.

Introduction

Organer på chips hurtigt frem som en ny og lovende klasse af in vitro- væv modeller. 1 i disse modeller er celler kulturperler inde mikrofluid enheder, der er manipuleret på en sådan måde, at de efterligner de fysiologiske mikromiljø af disse celler. 1 , 2 dette resulterer i mere realistisk fysiologiske eller patologiske adfærd af disse celler end kan forventes fra konventionelle in vitro- modeller af simple design og grundlæggende funktion. 3 , 5 , 6 Derudover organer på chips giver en bedre kontrollerbare miljø end i vivo modeller og kan optage både raske og syge væv af human oprindelse trofast replikere både menneskets fysiologi og patologi. De seneste opsummerede fremskridt i udviklingen af blod - hjerne barrierer på chips (BBBs på chips) viser, at feltet er hurtigt bevæger sig fremad. 7

En anden fordel af organer på chips er, at de aktiverer real-time og kontinuerlig overvågning af væv kulturperler inde i enheden af mikroskopi, on-line biokemiske analyser og integrerede sensorer. 1 , 2 For eksempel, måling af transendothelial eller transepithelial elektrisk modstand (TEER) er en kraftfuld metode til at overvåge ikke-invasivt udvikling og afbrydelse af barriere-dannende væv. 8 , 9 , 10 TEER er den elektriske modstand på tværs af en cellulær barriere og er derfor vejledende barriere integritet og permeabilitet. 10 i organer på chips, cellulære barrierer er generelt kulturperler på en membran, der adskiller to fluidic kanaler, der repræsenterer den apikale og basolateral rum af denne barriere væv. I sådanne chips kan TEER målinger udføres bekvemt med elektroder indsat i indgange og udgange af de to kanaler. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men manuel indføring og genindførelse af elektroderne kan nemt medføre placering fejl og dermed variationer i den målte modstand som f.eks. forskelle i modstanden i længere eller kortere stier gennem microchannels væsentlig er sammenlignet med den celle barriere modstand. 16 for at eliminere genindsætter fejl, enheder med integreret elektroder er blevet foreslået. Men de fleste af disse integrerede elektroder blokere visningen Når inspicerende vævskultur17,18,19,20,21 og/eller kræver specialiseret renrummet processer for fabrikation. 17 , 22

Orgel-on-chip-enhed, der beskrives i denne publikation, først anvendte i en tidligere publikation,16 kombinerer stabilitet af integrerede elektroder med synlighed på den målte cellelag og let fabrikation. Design og fabrikation af denne chip er afbildet i figur 1. Kort sagt, denne enhed består af to dele, Polydimethylsiloxan (PDMS) med kanal aftryk, der er fæstnet sammen lækage-fri med en polycarbonat membran med 0,4 µm porer i mellem. Fire platin wire elektroder er indsat og fast på plads med et photocurable klæbestof godt uden for området kultur. Alle disse fabrikation trin kan udføres med almindelige laboratorieudstyr, uden behov for et renrum miljø. Oven i dette, seks impedans målinger kan gøres ved hjælp af disse fire elektroder, hvorved direkte isolation af de målte TEER, uafhængigt af modstanden af microchannels fører op til tværsnit og dermed minimere påvirkning af ikke-biologiske variationer i system som (re) indsættelse fejl. 16

At vise anvendeligheden af denne enhed og de direkte TEER målinger, blod - hjerne barrieren (BBB) blev replikeret i denne chip. Denne biologiske barriere består af specialiserede endotelceller og regulerer transport mellem blod og hjerne til at give hjernen homøostase. 23 , 24 for at efterligne BBB, den øverste kanal af mikrofluid enheden var foret med menneskelige cerebral mikrovaskulære endotelceller fra linjen hCMEC/D3 celle (venligst leveret af Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrig). 25 den præsenterede metode er, men mere generelt gælder for enhver orgel-on-chip enhed med to rum, gør det muligt direkte TEER bestemmelse ved hjælp af let integreret elektroder.

I dette manuskript, er først fabrikationsproces af orgel-on-chip-enhed med integreret elektroder beskrevet. Næste, seeding procedure og kultur i endothelial hjerneceller inde i enheden er forklaret, samt på chip TEER målinger. I afsnittet resultater repræsentative TEER målinger er vist og databehandling er afklaret. Endelig præsenteres den barriere funktion af den BBB-on-chip, overvåges i løbet af 3 dage, viser anvendeligheden af præsenteret enhed og metoder til at overvåge TEER.

Protocol

1. fabrikation af enhedens orgel-on-chip

  1. gøre en PDMS replika af en støbeform med kanal designs, fremstillet ved hjælp af standard fotolitografi teknikker, og få PDMS dele af mikrofluid chip.
    1. Vejer ca 27 g PDMS basere agent og 2,7 g hærder; masse forholdet skal være 10:1. Det er godt for en 3 mm tyk PDMS plade på en støbeform med 130 mm (5 tommer) diameter. Bland disse komponenter grundigt.
    2. Degas blandingen i en ekssikkator i ca 45 min. at fjerne luftbobler.
    3. i mellemtiden, forberede den flydende PDMS blanding støber ved at stikke klar tape omkring formen eller placerer formen i en egnet wafer indehaveren.
    4. Hæld afgassede PDMS blandingen på formen. Hvis luft bobler forblev i PDMS blanding eller på mold overfladen, degas det igen i ca 30 min.
    5. Helbrede PDMS blandingen i en ovn ved 60 ° C i 4 h. lad den køle ned.
    6. i et cross-flow hood, trække den hærdede PDMS fra formen; formen kan genbruges straks for at gøre flere PDMS replikaer.
    7. Skæres PDMS replika i separate top og bund chip dele ved hjælp af skæring linjer i PDMS.
    8. Punch fire huller i de øverste dele ved hjælp af en skarp biopsi punch med 1 mm i diameter til form indgange og udgange. Punch fra inde til at komme ud at forhindre PDMS snavs fra indsamling i chippen. Dække chip delene med klare tape for at beskytte dem mod støv.
    9. Skæres polycarbonat membraner fra Transwell skær i tern på ca 3 × 3 mm 2.
  2. Samle en porøse membran lækage-fri i mellem to PDMS dele for at samle en to-lags enhed interface med en porøse membran.
    Bemærk: Denne protokol er tilpasset fra Griep mfl. 19 og Chueh mfl. 26
    1. Forbered en PDMS/toluen mørtel ved hjælp af 0,7 g PDMS base agent, 0,07 g hærder og 540 µL af toluen, hvilket resulterer i forholdet 5:3 vægt. Vortex mørtel grundigt.
    2. Spin-coat 200 µL af mørtel på et glas coverslip ved 1500 rpm til 60 s (ramped på 1000 rpm/s) til at erhverve et tyndt, ensartet lag af mørtel.
    3. Overføre et tyndt lag af mørtel fra coverslip på en nederste del og en øverste del af chip med en blæk rulle. Sætte den nederste del i en ovn-safe skål.
    4. Med et sæt pincet, dyppe kanten af en membran i spin-belagt mørtel og læg den forsigtigt i midten af den nederste del
    5. Omhyggeligt placere øverst på den nederste del mens opmærksomhed på justeringen.
      Bemærk: Ikke lægge pres på chippen og ikke skubbe den øverste del over den nederste del at forhindre mørtel fra indtastning af kanaler og tilstopning af membranen.
    6. Dække chips fjorde med klare tape for at forhindre støv ind chippen og bage dem ved 60 ° C i 3 h.
  3. Integrere elektroder i side kanaler.
    Bemærk: Denne protokol er tilpasset fra Griep mfl. 19 og Douville mfl. 18
    1. cut platin wire i stykker på ca 2 cm. rene ved nedsænkning dem i acetone i 30 min. Skyl med vand og ethanol og give mulighed for at tørre.
    2. i et cross-flow hood, sætte en chip på en plastik skål. Indsætte fire platin ledninger i elektrode kanaler af en chip med en pincet og bøje dem ned på plast parabol til aktiverer fiksering til fadet i et efterfølgende skridt. Sæt ledningerne 0,7-1 mm ind i den kultur, forbi T-formet kanal junction.
    3. Påfør en dråbe af UV-helbredes lim på elektrode kanal indgangen og lad lim til at fylde kanalen omkring elektroden af kapillære kræfter.
    4. Tænd UV og kur limen når det når til slutningen af elektrode kanal.
      Forsigtighed: Ser ikke i UV-lyskilden, da dette kan skade dine øjne.
    5. Fiksere de fire integrerede elektroder til plastik skål med en to-komponent epoxy lim. Dette giver mulighed for lettere håndtering af elektroderne under målingerne uden risiko for trække elektroder fra chippen.
    6. Dækker chips med klare tape og bage dem ved 60 ° C i 2 h. lad den køle ned og gemme støvfri indtil brug. På denne måde kan de være sikkert opbevaret for op til en måned.

2. Kultur af hjerne-afledte endotelceller på chip

  1. frakke chips for at fremme celle vedhæftet fil.
    1. Fylde begge kanaler med phosphat bufferet saltvand (PBS) til våd dem før at indføre reagenser. Check under et mikroskop hvis der er nogen luftbobler i kanalerne. Hvis det er tilfældet, skal du fjerne dem ved gennemskylning med ekstra PBS.
    2. Fylde begge kanaler med 30 µL af 20 µg/mL menneskelige fibronektin i PBS. Der inkuberes ved 37 ° C i 3 timer. Check for luftbobler og kan eventuelt skylle kanaler med PBS og refill med fibronektin løsning.
    3. Skyl chips med endotel vækstmediet og inkuberes dem ved 37 ° C og 5% CO 2 i en inkubator for 2 h.
    4. Måle TEER Tom chips som beskrevet i trin 3 for at sikre, at alle elektroderne er i direkte kontakt med væske i kanalerne. I tom chips, typiske TEER værdier er 0-1 Ω cm 2.
  2. Frø celler i den øverste kanal.
    1. Fjerne næringssubstratet fra en kultur kolbe (75 cm 2 kultur område) med en sammenflydende éncellelag af menneskelige cerebral mikrovaskulære endothelial celler (hCMEC/D3).
    2. Vaske cellerne med PBS. Der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 i 2-5 minutter indtil cellerne har løsrevet fra kultur kolben.
    3. Deaktivere trypsin med næringssubstratet suppleret med 20% føtal bovint serum (FBS). Tælle cellerne og beregne det samlede antal celler i suspension.
    4. i mellemtiden centrifugeres hCMEC/D3 celler på 390 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
    5. Celle resuspenderes i den passende mængde i endothelial vækstmediet (EGM-2) at nå frem til en koncentration på 5 x 10 6 celler/mL. Dette resulterer i en seeding tæthed af 2 x 10 5 celler/cm 2 i chippen.
    6. Langsomt afpipetteres 30 µL af den godt blandede cellesuspension i den øverste kanal og fjerne pipetten fra fjorden i en flydende bevægelse mens stadig pressionsmiddel.
    7. Tjek den seeding tæthed under et mikroskop. En ensartet fordeling af celler i hele den øverste kanal bør opnås.
    8. Incubate chips på 37 ° C og 5% CO 2 for mindst 1 h. skylle ud alle løsgængere celler med endotel næringssubstratet.
  3. Vedligehold på chip endotel kultur.
    1. To gange om dagen, Indsæt næringssubstratet-fyldt pipette tips som reservoirer i fjorde og erstatte medium inde i chippen af gravity-drevet flow.
      Bemærk: For at undgå luftbobler fra indtastning af microchannels og ødelægge cellelag, Sørg for at gøre væske-væske kontakt mellem pipette tip og væske oven på chippen, før du indsætter spidsen ind i en Fjord. Dette kan fremmes ved at tilføje en lille dråbe på den i / outlet før pipette indsættelse.
    2. Også tilføje pipette tip reservoirer i forretninger til at forhindre kanalerne fra tørring.
    3. Ruger chips ved 37 ° C og 5% CO 2.

3. TEER målinger på chip

  1. sat op the TEER måling apparater, bestående af en lock-in forstærker og en sonde kabel kredsløb, som blev angivet i Van der roret mfl. 16 alternativt potentiostats eller impedans analysatorer egner sig også til disse impedans-baserede TEER målinger.
  2. Tage chippen fra rugemaskinen, og gør det muligt at nå stuetemperatur i mindst 10 min. Fjern eventuelle væske fra plastik fad rundt elektroderne for at forhindre elektrode bridging uden for chippen.
  3. Tage impedans spektrum fra 200 Hz til 1 MHz for hver kombination af to elektroder, hvilket resulterer i 6 impedans spectra pr. chip i kun 5-10 min. Tjek hvis impedans spektre har den forventede størrelser og figurer til at validere TEER måling, som er beskrevet i afsnittet resultater.
  4. Sætte chippen tilbage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO 2 efter endt måling.
  5. Behandle opnåede impedans spektrene for at nå frem til en standardiseret TEER værdi.
    1. Få den målte modstand Equation 1 mellem elektroderne Equation 2 og Equation 3, som angivet i figur 2B og D, fra den resistive plateau på 10 kHz i de tilsvarende impedans spektre.
    2. Beregn TEER ved hjælp af de seks målte modstand svarende til en chip på én gang punkt ved hjælp af ligningen i figur 2 g 16:
      Equation 20
      i denne ligning, Equation 4 er området kultur, hvorigennem modstanden blev målt, < img alt = " Ligning 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > er modstanden i den cellulære barriere og membran, Equation 6, Equation 7, Equation 8 og Equation 9 er modstand værdier målt gennem den cellulære barriere og Equation 10 og Equation 11 måles modstand værdier i den lige kanaler. 16 ligningen er afledt af de tilsvarende kredsløb illustreret i figur 2 c.
  6. Fratrække den tomme TEER fra TEER på alle tidspunkter at opnå udvikling af TEER i tide.

Representative Results

Skematisk resultaterne af elektrisk impedans spektroskopi gennem en chip uden celler (solid line) og gennem en cellulær barriere (stiplet linje) er vist i figur 2A. Fire vigtigste regioner kan identificeres, hver domineret af en specifik elektrisk komponent. Under ca 1 kHz dominerer dobbelt lag kapacitans på grænsefladen elektrode-kultur medium, karakteriseret ved en negativ hældning for impedans størrelsesorden og en faseskift nærmer sig-90 °. Den hyppighed, hvormed dobbelt lag kapacitansen dominerer, afhænger området elektrode udsat for næringssubstratet. Den resistive plateau over 1 kHz (uden celler) eller 100 kHz (med celler) med en faseskift tæt på 0 ° svarer til modstand af næringssubstratet inde i mikrofluid kanalerne, afhængigt af kanal længde og tværsnitsareal og indersiden af membran, afhængigt af porøsitet og tykkelse. Når du måler gennem en cellulær barriere, ses en ekstra resistive plateau mellem 1 og 10 kHz samt et lokalt maksimum i fase diagram. Denne region er af afgørende betydning for bestemmelse af TEER som en klar stigning i impedans resultater når cellerne er til stede i stien målte, og kaldes derfor "region af interesse". Den ekstra hældning mellem 10 og 100 kHz svarer til celle barriere kapacitans, der udspringer af elektrisk isolerende lipid tolagede membraner og er afhængig af det samlede areal af cellelag. 27 grænserne for disse regioner samt impedans omfanget afhænger af systemet ved at blive undersøgt og ændre med, blandt andre ting, kanal dimensioner, næringssubstrat ledningsevne, elektrode placering og celletype. For yderligere læsning om teori og praksis af elektrisk impedans spektroskopi på barriere-dannende væv oversigtsartikel af Benson et al. anbefales. 28

Repræsentative data TEER målinger er vist for både en tom chip og en chip med en hCMEC/D3 hjernen endotel cellelag i figur 2E og 2F, henholdsvis. Kort sagt, impedans spektroskopi blev udført ved hjælp af seks målinger med fire elektroder: to målinger gennem celle næringssubstratet-fyldt kanaler (ubrudte linjer) og fire målinger gennem kanalerne samt membranen og - hvis de findes - det cellulære barriere (stiplet linje). Disse seks måling stier kan identificeres i det tilsvarende resistive kredsløb af figur 2B, som er afledt af den skematiske tværsnit (fig. 2 c) og ovenfra (figur 2D). Tom chip målinger (figur 2E) viser den typiske form af impedans spectra uden celler, som illustreret i figur 2A. Målingerne gennem de cellulære barriere (stiplede linjer i figur 2F) ligner de typiske impedans spektre med celler i figur 2A. Bemærk at både impedans størrelsesorden og fase Skift stigning over 1 MHz. Dette er den typiske reaktion af opsætningen måling ved høje frekvenser og er ikke af eksperimentelle oprindelse.

For at bestemme TEER ved hjælp af disse eksperimentelle impedans spektre, først bestemmes målte chip modstand, som er den samlede modstand cellelag, kanaler og membran. Med henblik herpå, en egnet udlæsning frekvens i det pågældende område, blev valgt som den er på det lokale maksimum i fase plot med celler og tæt på 0 ° faseskift uden celler: 10 kHz. Med de seks målte modstand på 10 kHz, målt mellem de fire elektroder, beregnes TEER direkte ved hjælp af ligningen i figur 2F.

For at vise, at præsenteres enheden er velegnet til bestemmelse af TEER i organer på chips, BBB blev replikeret inde i chippen og dens TEER blev overvåget under 3 dage af kultur. I figur 3A den gennemsnitlige TEER ± standardfejl af middelværdien (SEM) er vist for fire BBBs på chips, hvilket resulterer i et plateau på 22 ± 1,3 Ω cm2, som er sammenlignelig med TEER af denne cellelinie, som rapporteret i litteraturen. 29 Derudover efter afslutning af forsøget og fluorescens farvningen af kerner, det kan ses at hjernen endotelet dannet en kontinuerlig éncellelag inde i enheden (figur 3B). Immunfluorescens farvning af tight junction-protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) viste, at i endothelial hjerneceller fastholdt deres BBB-specifikke fænotype og dannet stramme junctional komplekser.

Figure 1
Figur 1: Design og montering af orgel-on-chip-enhed med integreret elektroder.
(A) sprængskitse af mikrofluid chip, bestående af en top PDMS del med den øverste kanal (TC), en membran (M) og en bund PDMS del med den nederste kanal (BC). Fire platin wire elektroder (E1-4) er indsat og fast i side-kanaler. I den øverste kanal og oven på membranen, var hCMEC/D3 hjernen endotelceller kulturperler for at replikere BBB. (B) samlet chip, fastgjort til en plastik skål. Genoptrykt og tilpasset med tilladelse fra Elsevier. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative impedans data og bestemmelse af TEER.
(A) skematisk impedans spektrum viser impedans størrelsesorden (Ω) og faseskift (°) versus frekvens (Hz), typisk for elektrisk impedans spektroskopi på chips uden celler (solid line) og med celler (stiplet linje). Der er fire vigtigste regioner, hver domineret af: dobbelt lag kapacitans på elektroderne, næringssubstrat modstand, celle barriere modstand og cellemembranen kapacitans. "Region af interesse" angiver hvor bidrag af cellelag kan være kvantitative (rød pil). (B) tilsvarende resistive kredsløb på chippen, viser top channel modstande R1 og R3, den nederste kanal modstande R2 og R4 og membran og EF barriere modstand Rm. (C) der viser endotelceller (EF) kulturperler i den øverste kanal skematisk tværsnit. (D) skematisk ovenfra af BBB chip viser konfigurationen af elektroderne og kultur-området af 0,25 mm2 hvorigennem impedans er målt. (E) repræsentative impedans spektre af en tom chip fyldt med cellekulturmedium. (F) repræsentative impedans spektre af en chip i hvilken hCMEC/D3 hjerne endotelceller blev kultur i 3 dage. (G) formel til at beregne TEER fra de målte modstand mellem alle seks kombinationer af fire elektroder. Genoptrykt og tilpasset med tilladelse fra Elsevier. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentant TEER udvikling af BBB-on-chip.
(A) gennemsnitlige TEER ± standardfejl af middelværdien (SEM) fire BBBs-på-chips i en kultur periode på tre dage at nå et plateau på 22 ± 1.3 Ω cm2 (gennemsnit ± SEM). Til sammenligning er data af Tom chips inkluderet, viser marginale variation og afvigelse fra 0 Ω cm2 i samme periode sammenlignet med variation og TEER værdien af chips med celler. (B) Fluorescens mikroskopi af bejdset kerner afslørede en kontinuerlig éncellelag af endothelium, både på PDMS og membran på den lokalitet, som angives i indsatsen. (C) immunofluorescens afslørede tilstedeværelsen af tight junction-protein Zonula Occludens-1, der angiver, at BBB-specifikke stramme kryds mellem cellerne give anledning til den målte TEER. Genoptrykt og tilpasset med tilladelse fra Elsevier. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I dette manuskript, blev engineering af et orgel-on-chip enhed og direkte bestemmelse af transendothelial elektrisk modstand (TEER) af en cellulær barriere kulturperler i enheden præsenteret. Metoden præsenteres af integrere elektroder uden renrum udstyr og direkte TEER bestemmelse ved hjælp af fire elektroder er relevant for enhver orgel-on-chip enhed med to mikrofluid rum. Chip layout og geometri kan tilpasses kravene i de forestiller sig eksperimenter, så længe de fire elektroder er adskilt i to rum. De fire elektroder kan selv bekvemt indsættes i fjorde eksisterende chips, forudsat at de er fikseret i stedet for varigheden af seks målinger. Lækage-fri bonding metode kan være optimeret til forskellige membraner og kanal geometrier ved at ændre PDMS/toluen forholdet. Et højere indhold af toluen resulterer i en tyndere spin-belagt lag af mørtel26 og kan være mere egnet til mere lavvandede og smallere kanaler i PDMS dele. En lavere toluen indhold resulterer i en tykkere mørtel lag26 og kan være mere egnet til at omslutte tykkere membraner mellem PDMS dele.

Som det kan ses i de skematiske impedans spektre i figur 2A og de eksperimentelle spektre i figur 2E og 2F, påvirkes impedans målinger af dobbelt lag kapacitans på grænsefladen elektrode-medium. På grund af den lille størrelse af elektroder inde i microchannels, kan dobbelt lag kapacitans dominere over resistive plateauet i den cellulære barriere i impedans spektre, komplicerende kvantificering af TEER. For at overvinde dette, elektroderne kan indsættes yderligere i kultur-kanaler før fiksering. Dette vil øge overfladearealet af elektroden udsat til substratet og med det dobbelt lag kapacitans vil stige så godt. Dette resulterer i en forskydning af den kapacitive skråning til lavere frekvenser, således at resistive plateauet i den cellulære barriere kan være mere let anerkendte og kvantificeret. Selvom modstanden i den målte sti mellem to elektroder bliver mindre, vil dette ikke påvirke TEER kvantificering efter metoden præsenteres.

Mens måling gennem den cellulære barriere, er det muligt, at den ekstra resistive plateau ikke kan genkendes. Dette kan være resultatet af en fluidic forbindelse mellem de to kanaler, for eksempel hvis membranen er dårligt afgrænses af mørtlen, fører til et målte sti rundt den cellulære barriere. Derudover kan der elektriske bridging udenfor chippen hvis elektroderne forbindes af en dråbe af næringssubstratet. Dette er normalt kombineret med en lavere målte impedans og kan løses ved at fjerne denne bro af næringssubstratet. Endelig, hvis der er ingen resistive plateau og den målte impedans er størrelsesordener højere end forventet, kan der være en løs forbindelse i den elektriske ledninger eller på strømkilden.

I fremtiden, kan fysiologiske relevansen af de nuværende BBB-on-chip øges ved at udsætte i endothelial celler til at shear stress på fysiologiske niveauer, som er rapporteret til at fremme BBB differentiering og stigning barriere tæthed og er svært at opnå i konventionelle in vitro- modeller. 29 derudover den nederste kanal præsenteres enhedens giver et egnet rum til hjerne-afledte celler til at være co kulturperler med endotelet. Det forventes også at øge den barriere funktion og giver også mulighed for undersøgelse af det komplekse samspil mellem relevante celletyper patologiske betingelser. 29

Afslutningsvis, orgel-on-chip-enhed, der beskrives i denne publikation kan være opdigtet benytter standard laboratorieudstyr og er vist at give direkte TEER målinger ved hjælp af fire integrerede elektroder, der ikke hindrer besigtigelse af cellen studerede lag. Anvendeligheden af denne enhed i feltet organer på chips blev demonstreret ved at efterligne BBB i denne chip og overvåge TEER periode kultur. Et væld af andre (barriere) organer kan efterlignes ved at medtage andre relevante celletyper i denne chip. Derudover kan metode til måling af TEER let anvendes i andre to rum-baserede orgel-on-chip enheder til ankommer reproducerbare og meningsfuld TEER værdier, der kan sammenlignes på tværs af enheder og systemer.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi parlamentsarbejdet Johan Bomer for fabrikation af mug og Mathijs Bronkhorst for frugtbare drøftelser og bistand med data repræsentation.

Denne forskning er finansieret af: SRO biomedicinske Microdevices af L.I. Segerink, MIRA Institut for Biomedicinsk teknik og tekniske medicin, universitetet i Twente; SRO organer-på-Chips af A.D. van der Meer, MIRA Institut for Biomedicinsk teknik og tekniske medicin, universitetet i Twente; og VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr. 669768).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning 1673921
Scotch Magic tape 3M
Biopsy punch, 1.0 mm diameter Integra Miltex 33-31AA-P/25
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size Corning 3401 Cut from Transwell culture inserts
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Platinum wire, 200 µm diameter Alfa Aesar 10287
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol Henkel 30673
hCMEC/D3 cells Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml Gibco 33016015
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) Lonza CC-3162 Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots
Trypsin-EDTA, 0.05% Gibco 15400-054
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-079
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Oven Binder 9010-0190
Spin coater: Spin 150 Polos SPIN150-NPP
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 Manufactured in-house
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter
Incubator Binder CB E2 150
Boxense LocSense Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
  3. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  5. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  6. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  7. Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  8. Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
  9. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  12. Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
  13. Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
  14. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  15. Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
  16. Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
  17. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  18. Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
  19. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  20. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
  21. Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
  22. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  24. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  25. Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  26. Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
  27. Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
  28. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
  29. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).

Tags

Biomedicinsk teknik sag 127 organer på chips microfabrication transendothelial elektrisk modstand transepithelial elektrisk modstand blod - hjerne barrieren mikrofluidik
Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Helm, M. W., Odijk, M.,More

van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., Segerink, L. I. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J. Vis. Exp. (127), e56334, doi:10.3791/56334 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter