Summary
이 간행물 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접 정량화에 대 한 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제작을 설명합니다. 유효성 검사, 혈액-뇌 장벽 안쪽이 미세 장치 유사 했다 및 장벽 기능 모니터링 했습니다. 전극 통합 및 직접 TEER 정량화에 대 한 제시 방법 일반적으로 적용 됩니다.
Abstract
장기에 칩, 생체 외에서 모델 미세 장치 내부 (인간의) 조직 문화를 포함는 급속 하 게 신흥 및 유용한 제공 하기 위해 약속 연구 공부 하는 인간의 건강 및 질병에 대 한 도구. 기관-온-칩 장치 안으로 경작 하는 세포 층의 장벽 기능 특성, 종종 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 됩니다. 이 위해, 전극 보통 칩의 후미에 전극의 수동 삽입 달성 보다 더 안정적인 측정을 제공 하 여 미세 칩에 통합 됩니다. 그러나, 이러한 전극 자주 공부 셀 층의 육안 검사를 방해 하거나 비싼 클린 프로세스 제작에 대 한 필요. 이러한 한계를 극복 하기 위해 여기에 설명 된 장치 배치 하 고 시각적 검사를 가능 하 게 하는 문화 영역 외부 고정 4 쉽게 통합된 전극을 포함 되어 있습니다. TEER 고립 될 수 있다 직접, 문화 매체 가득 microchannels 저항의 독립적인 6 측정 경로 저항 양이 정해질 수 있다,이 4 개의 전극에 사용 하 여. 혈액-뇌 장벽 했다이 장치에 복제 하 고 그 TEER 표시 장치 적용을 모니터링 했습니다. 이 칩, 통합된 전극 및 TEER 결정 방법 장기에 칩, 다른 장기를 모방 하거나 기존의 기관-온-칩 시스템에 통합 될 수 있는 일반적으로 적용 됩니다.
Introduction
장기에 칩 빠르게 새로운 급부상 하 고 유망한 생체 외에서 의 클래스 조직 모델. 1 이러한 모델에서 셀 교양 그들은 그 세포의 생리 적인 microenvironment을 모방 하는 방식으로 설계 하는 미세 장치 내부. 1 , 2 결과 그 셀의 현실적 생리 적 또는 병 적인 동작 보다 기존의 생체 외에서 모델의 단순한 설계 및 기본적인 기능에서 예상 될 수 있다. 3 , 5 , 6 또한, 장기에 칩 비보에 모델 보다 더 나은 제어 환경을 제공 하 고 인간의 생리와 병 리를 충실 하 게 복제 인간의 기원에서 모두 건강 하 고 병에 걸린 조직을 통합할 수 있습니다. 칩 (BBBs에 칩)에 혈액-뇌 장벽을 개발에 최근 요약된 발전 분야는 신속 하 게 이동 앞으로 보여줍니다. 7
장기에 칩의 또 다른 장점은 조직 현미경 검사 법, 온라인 생 화 확 적인 분석 그리고 통합된 센서 장치 내부에 교양의 실시간 연속 모니터링 수 있다는. 1 , 2 예, 비 접촉 개발 모니터링을 위한 강력한 방법 이다 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 및 장벽 형성의 조직. 8 , 9 , 10 TEER 전기 저항 세포 장벽을 가로질러 이며 따라서 장벽 무결성 및 침투성을 나타내는 있습니다. 10 장기에 칩, 세포 장벽 일반적으로 교양 두 대표는 꼭대기 유체 채널 및 그 장벽 조직의 basolateral 구획을 구분 하는 막에. 이러한 칩 TEER 측정 후미와 2 채널의 콘센트에 삽입 된 전극으로 편리 하 게 수행할 수 있습니다. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 수동 삽입 및 전극의 재 투입 될 수 있습니다 쉽게 배치 오류에 따라서 예를 들면 으로 측정 된 저항 변화에 microchannels 통해 긴 또는 짧은 경로 저항 차이 중요 한에 비해 셀 장벽 저항. 16 reinsertion 오류를 제거 하려면 통합된 전극 장치 제안 되었습니다. 그러나,이 통합 된 전극의 대부분 조직 문화17,,1819,20,21 을 검사 하는 경우는 보기 차단 및 필요 전문 클린 룸 제작에 대 한 처리합니다. 17 , 22
이전 간행물,16 에 처음 적용 하는이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 측정된 셀 레이어 및 쉬운 제작에 시정 통합된 전극의 안정성을 결합 합니다. 설계 및이 칩의 제조는 그림 1에 묘사 된다. 즉,이 장치 부품 이루어져 있다 2입니다 (PDMS) 함께 결합 채널 인쇄물과 0.4와 폴 리 카보 네이트 막으로 누설 무료 µ m 모 공 사이. 4 개의 백 금 철사 전극 삽입 되 고는 photocurable와 함께 제자리에 고정 문화 영역 외부에 잘 접착. 모든 제작 단계 일반 실험실 장비, 클린 룸 환경에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. 또한, 6 임피던스 측정을 수행할 수 있습니다 microchannels 횡단면을 고의 영향을 최소화의 저항의 독립적인 측정된 TEER의 직접 격리 하므로 이러한 4 개의 전극를 사용 하 여 (재) 삽입 오류와 같은 시스템에서 비 생물 유사. 16
이 장치와 직접 TEER 측정의 적용을 보여, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이이 칩에서 복제 되었다. 이 생물 학적 장벽이 전문된 내 피 세포의 구성 되어 있으며 혈액과 뇌 항상성 제공 하는 뇌 간의 전송 규제. 23 , 24 BBB 모방, 미세 소자의 맨 위 채널은 줄지어 (친절 하 게 제공 박사 P. o. hCMEC/D3 셀 라인에서 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 Couraud, INSERM, 파리, 프랑스). 그러나 25 제시 방법은,, 더 일반적으로 두 개의 구획 어떤 기관-온-칩을 적용, 직접 TEER 결정을 쉽게 사용 하 여 활성화 통합 전극.
이 원고에서 먼저 통합된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제조 과정은 설명 되어 있습니다. 온 칩 TEER 측정 뿐만 아니라 다음, 시드 절차와 장치 내부에 뇌 내 피 세포의 문화 설명 된다. 결과 섹션에서 대표 TEER 측정 표시 하 고 데이터 처리를 명확히. 마지막으로,는 BBB-온-칩, 3 일 동안 모니터링의 장벽 기능 제공 됩니다, 표시 장치 및 TEER 모니터링 하는 방법의 적용을 보여주는.
Protocol
1. 기관-온-칩 소자의 제조
- 채널 디자인, 표준 포토 리소 그래피 기술을 사용 하 여 조작 형의 PDMS 복제를 확인 하 고 미세 칩의 PDMS 부분을 얻을.
- 무게 약 27 g PDMS 기본 에이전트 및 2.7 g 경화제; 대량 비율 10: 1을 해야 합니다. 이것은 3 m m 두꺼운 PDMS 슬 래 브 형 130 m m (5 인치) 직경에 대 한 좋은입니다. 이러한 구성 요소를 철저 하 게 혼합.
- 기포를 제거 하는 약 45 분 동안 desiccator에 섞어 드.
- 한편, 금형 주위에 명확한 테이프 여 액체 PDMS 혼합물에 대 한 금형을 준비 하거나 금형에 적합 한 웨이퍼 홀더.
- 금형에 degassed PDMS 혼합물을 붓는 다. 만약 거품이 남아 PDMS 혼합물 또는 금형 표면에 공기 드 그것은 다시 약 30 분에 대 한
- 오븐 4 헤를 허용에 대 한 60 ° C에서 PDMS 혼합물을 치료.
- 교류 후드에서 형에서 치료 PDMS를 당겨, 금형 더 PDMS 복제본을 즉시 다시 사용할 수 있습니다.
- 별도 상단 및 하단 칩 부품은 PDMS에 절단 라인을 사용 하 여 잘라 PDMS 복제.
- 양식 인 레트와 출구를 1 m m 직경을 가진 날카로운 생 검 펀치를 사용 하 여 상단 부분에 4 개의 구멍을 펀치. 내부에서 펀치를 칩에 수집에서 PDMS 파편을 방지 하기 위해 외부. 먼지에 대하여 그들을 보호 하기 위해 명확한 테이프와 칩 부분을 커버.
- Transwell 삽입에서 폴 리카 보 네이트 막 약 3 × 3 m m의 사각형으로 잘라 2.
- 다공성 막 2 층 장치를 조립 하기 위해서는 두 PDMS 부분 사이 누설 없는 인터페이스는 다공성 막으로 어셈블.
참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. 19 그리고 Chueh 외. 26- 준비 PDMS/톨루엔 박격포 PDMS 기본 에이전트, 경화제의 0.07 g과 톨루엔의 540 µ L의 0.7 g을 사용 하 여 결과 5:3 무게 비율에. 소용돌이 박격포 철저 하 게.
- 60 1500 rpm에서 유리 coverslip에 박격포의 스핀 코트 200 µ L s (1000 rpm/s에서 ramped) 박격포의 얇은, 유니폼 레이어를 얻으려고.
- 하단 부분 그리고 잉크 롤러 칩의 상단 부분에 coverslip에서 박격포의 얇은 층을 전송합니다. 맨 아래 부분 오븐 안전 접시에 넣어.
- 핀셋, 집합으로 스핀 코팅 박격포에 막의 가장자리와 하단 부분에 중간에 신중 하 게 배치
- 신중 하 게 배치 상단 부분 아래쪽에 정렬에 신경을 쓰는 동안.
참고: 칩에 압력을가 하지 마십시오 그리고 박격포는 채널을 입력 하 고 막 막힘을 방지 하기 위해 아래 부분 상단 부분을 슬라이드 할. - 명확한 테이프 칩 입력에서 먼지를 방지 하 고 60 ° C 3 h.에서 그들을 구워와 칩 후미를 커버
- 전극 측 채널로 통합.
참고:이 프로토콜은 Griep 외에서 적응. 19와 Douville 외. 18- 30 분 린스 물과 에탄올에 아세톤에 그들을 잠수 하 여 조각의 약 2 cm. 클린으로 백 금 철사를 잘라 건조 허용.
- 교류 후드, 플라스틱 접시에 칩을 넣어. 핀셋의 쌍을 사용 하 여 칩의 전극 채널에 4 개의 백 금 철사를 삽입 하 고 단계에서 접시에 고정 수 있도록 플라스틱 접시에 그들을 구 부. T-모양의 채널 접합 과거 문화 채널에 m m 0.7-1 전선 삽입.
- 전극 채널 입구에서 UV 경화 접착제의 방울을 적용 하 고 모 세관 힘에 의해 전극 주위 채널을 채우기 위해 접착제 허용.
- 전극 채널의 끝에 도달 하면 자외선 치료 접착제에 전환.
주의: 보이지 않는 UV 광원으로로이 당신의 눈을 손상 할 수 있다. - 흥분 2 분 에폭시 접착제와 플라스틱 접시를 4 개의 통합 된 전극. 이로써 전극의 전극 칩에서 당기의 위험 없이 측정 하는 동안 쉽게 처리.
- 명확한 테이프와 칩을 커버 하 고 2 h. 진정 하 고 먼지 무료 사용까지 저장 허용에 대 한 60 ° C에서 구워. 이 방법으로 그들은 수는 달에 대 한 안전 하 게 저장.
2. 온 칩 두뇌 파생 된 내 피 세포의 문화
- 코트 셀 첨부 파일 홍보 칩.
와 성
- 채우기 두 채널 버퍼링 식 염 수 (PBS) 시 약을 도입 하기 전에 젖은. 확인 현미경 경우 채널에 모든 공기 거품. 그렇다면, 여분의 PBS를 가진 홍 조 하 여 그들을 제거.
- 두 채널의 PBS에서 20 µ g/mL 인간의 fibronectin 30 µ L 입력합니다. 3 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 공기 방울에 대 한 확인 하 고, 필요한 경우 플러시 PBS 가진 채널 및 fibronectin 솔루션 리필.
- 내 피 성장 매체와 칩을 제거 하 고 37 ° C와 5% CO 2 2 헤 대 한 인큐베이터에 그들을 품 어
- 채널에 유체와 직접 접촉에 있는 전극의 모든 보장 하기 위해 3 단계에 설명 된 대로 빈 칩의 TEER를 측정 합니다. 빈 칩, 일반적인 TEER 값은 0-1 Ω cm 2.
- 셀 맨 위 채널에 씨앗.
- 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 (hCMEC/D3)의 confluent 단층으로 문화 플라스 크 (75 cm 2 문화 영역)에서 문화 매체를 제거.
- 는 PBS로 세포 세척. 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 셀 문화 플라스 크에서 분리가 될 때까지 2-5 분 동안 37 ° C, 5% CO 2에서 품 어.
- 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 하는 문화 매체는 트립 신을 비활성화 합니다. 계산 셀과 셀 서 스 펜 션의 총 수를 계산.
- 한편, 원심 390 x g 5 분에서 hCMEC/D3 셀 하 고 상쾌한 제거.
- 적절 한 양의 내 피 성장 매체 (EGM-2) 5 x 10 6 셀/mL의 농도에 도착에 셀 펠 릿을 resuspend. 이 칩에 2 x 10 5 셀/c m 2의 시드 밀도 결과.
- 천천히 맨 위 채널에 잘 혼합된 세포 현 탁 액의 30 µ L 플라스틱 하 고 여전히 압력을 발휘 하면서 유창 모션에 입구에서 피펫으로 제거.
- 현미경 시드 밀도 확인합니다. 맨 위 채널에 걸쳐 세포의 균일 한 분포를 달성 해야 합니다.
- 적어도 1 h. 위해 37 ° C, 5% CO 2 칩 내 피 문화 매체와 연결 되지 않은 셀 밖으로 플러시 품.
- 칩에 내 피 문화를 유지.
- 두 번, 하루는 후미에서 저수지로 문화 매체 가득 피 펫 팁을 삽입 하 고 중력 기반 흐름에 의해 칩 내부 매체를 대체.
참고:는 microchannels 입력 하 고 셀 계층 파괴에서 공기 방울을 피하기 위해, 입력부에 끝을 삽입 하기 전에 피 펫 팁과 칩 위에 액체 액체-액체 접촉 하 게 있는지 확인 합니다. 이에 작은 방울을 추가 하 여 촉진 될 수 있다는에 / 피 펫 삽입 전에 콘센트. - 채널 건조 하지 않도록 매장에서 피 펫 팁 저수지를 추가할 수도.
- 37 ° C, 5% CO 2 칩을 품 어.
- 두 번, 하루는 후미에서 저수지로 문화 매체 가득 피 펫 팁을 삽입 하 고 중력 기반 흐름에 의해 칩 내부 매체를 대체.
3. 온 칩 TEER 측정
- 일 설정e TEER 측정 장치, 잠금 증폭기 및 프로브 케이블 회로 반 데르 조 타 외에 지정 된 구성. 16 또는 potentiostats 또는 임피던스 분석기는 또한 이러한 임피던스 기반 TEER 측정에 적합.
- 인큐베이터에서 칩을가지고 고 어떤 액체 전극 칩의 외부 연결을 방지 하기 위해 전극 주위 플라스틱 접시에서 적어도 10 분 제거에 대 한 실내 온도 도달 하도록.
- 200 Hz에서 임피던스 스펙트럼 예상된 크기와 모양의 TEER 측정으로 유효성을 검사 하는 경우만 5-10 분 확인에에서 칩 당 6 임피던스 스펙트럼의 결과로 2 개의 전극의 각 조합에 대 한 1 MHz 임피던스 스펙트럼을 걸릴 결과 섹션에 설명 된.
- 측정을 완료 한 후 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 칩을 넣어.
- 정규화 TEER 값을 얻은 임피던스 스펙트럼 처리 합니다.
- Get은 측정된 저항
전극 사이 
와 
, 그림 2B에서 D, 해당 임피던스 스펙트럼에 10 kHz에서 저항 원에서 표시. - 계산 사용 하 여 한 번에 하나의 칩에 해당 하는 6 측정된 저항 TEER 그림 2G 16의 방정식을 사용 하 여 포인트:
이 방정식에서
는 저항 측정, 문화 영역 < img alt = " 방정식 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ >은 세포 벽과 멤브레인, 저항 
, 
, 
및 
는 저항 세포 장벽을 통해 값 측정 및 
및 
저항 값 측정 되는 스트레이트 채널입니다. 16 방정식에서에서 파생 된 등가 회로 그림 2C에.
- Get은 측정된 저항
- 는 TEER의 개발 시간에서을 얻기 위해 모든 시간 포인트에서 TEER에서 빈 TEER 빼기.
전극 사이 
와 
, 그림 2B에서 D, 해당 임피던스 스펙트럼에 10 kHz에서 저항 원에서 표시.
는 저항 측정, 문화 영역 < img alt = " 방정식 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ >은 세포 벽과 멤브레인, 저항 
, 
, 
및 
는 저항 세포 장벽을 통해 값 측정 및 
및 
저항 값 측정 되는 스트레이트 채널입니다. 16 방정식에서에서 파생 된 등가 회로 그림 2C에.Representative Results
셀 (실선) 없이 칩을 통해와 세포 장벽 (파선)을 통해 전기 임피던스 분광학의 도식 결과 그림 2A에 표시 됩니다. 4 개의 주요 영역을 확인할 수 있습니다, 그리고 각각 특정 전기 구성 요소에 의해 지배. 약 1khz 아래 전극 문화 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스 지배, 임피던스 크기와 접근 하는-90 ° 위상 변화에 대 한 부정적인 사면이 특징. 주파수는 더블 레이어 커패시턴스 지배, 문화 매체에 노출 전극 영역에 따라 달라 집니다. 미세 채널의 채널 길이 및 단면적, 내부에 따라 내부 문화 매체의 저항에 해당 하는 0 °에 가까운 위상 변화를 1khz (셀) 없이 또는 100 kHz (셀)와 위에 저항 고원은 막, 다공성 및 두께 따라 세포 장벽을 통해 측정, 1, 10 kHz 사이 여분 저항 고원 단계 다이어그램에서 현지 최대 뿐만 아니라 볼 수 있다. 이 때 임피던스 결과에 명확한 증가 TEER의 결정에 대 한 중요 한 중요성의 셀 측정된 경로에 존재 하 고 따라서 "관심 영역" 이라고 불린다. 10, 100 kHz 사이 추가 슬로프 셀 장벽 커패시턴스는 전기적으로 절연 지질 bilayer 막에서 발생 하 고 셀 층의 총 면적에 따라 달라 집니다에 해당 합니다. 27 임피던스 크기 뿐 아니라 이러한 지역 경계 공부 되 고 시스템에 의존 하 고, 채널 차원, 문화 매체 전도성, 전극 위치 및 셀 형식, 변경. 장벽 형성에 전기 임피던스 분광학의 연습과 이론에 대 한 추가 읽기를 위해 조직 벤슨 외. 여 검토 문서 것이 좋습니다. 28
TEER 측정의 대표적인 데이터 빈 칩과 칩 그림 2E 와 2F, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 층으로 각각 표시 됩니다. 즉, 임피던스 분광학 4 개의 전극을 가진 6 측정을 사용 하 여 수행 되었다: 세포 배양 매체 가득 채널 (실선)을 통해 두 측정 및 4 개의 측정 채널 막 통해 및--존재 하는 경우는 세포 장벽 (파선) 했다입니다. 6 측정 경로 그림 2B, 도식 단면도 (그림 2C) 및 평면도 (그림 2D)에서 파생 되는 등가 저항 회로에서 확인할 수 있습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 빈 칩 측정 (그림 2E) 셀 없이 임피던스 스펙트럼의 전형적인 형태를 보여. 세포 벽 ( 그림 2F에 파선)을 통해 측정 닮은 그림 2A에 셀 일반적인 임피던스 스펙트럼. 참고 임피던스 크기와 위상 이동 증가 1 MHz로. 높은 주파수에서 측정 설정의 전형적인 응답 이며 실험적인 근원의 아니다.
확인 하려면 TEER 이러한 실험 임피던스 스펙트럼을 사용 하 여, 먼저 측정된 칩 저항 결정 됩니다, 셀 레이어, 채널 및 막의 총 저항입니다. 이 위해, 관심 영역에 적합 한 판독 주파수 선정 되었다, 세포와 세포 없이 0 ° 위상 변화에 가까운 단계 음모에 현지 최대에: 10 kHz. 10 kHz에서 6 측정된 저항, 함께 4 개의 전극 사이 측정으로 TEER 직접 계산 됩니다 그림 2 층에 방정식을 사용 하 여.
제시 장치 기관에 칩 TEER 결정 적합 표시, BBB는 칩 내부 복제 했다 하 고 그 TEER 문화의 3 일 동안 모니터링 했습니다. 그림 3A 평균 TEER ± 표준 오차 (SEM) 의미의 칩에 대 한 4 개의 BBBs-에-, 표시는 22 ± 1.3 Ω c m2의 대 지에 결과에 있는 문학에서 보고 된이 세포 선의 TEER 비교입니다. 29 또한, 실험 종료 후 형광 핵의 얼룩, 그것은 볼 수 있습니다 두뇌 endothelium 장치 (그림 3B) 내부 연속 단층을 형성. 면역 형광 염색 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1 (조로-1)의 뇌 내 피 세포의 BBB-특정 표현 형을 유지 하 고 꽉 접합 복합물을 형성 했다.
그림 1: 디자인 및 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 조립.
최고 채널 (TC), 막 (M)와 아래쪽 하단 채널 (BC) PDMS 부분 PDMS 윗부분의 구성 된 미세 칩의 (A) 분해 보기. 4 개의 백 금 철사 전극 (E1 ~ 4) 삽입 하 고 옆 채널에 고정 됩니다. 맨 위 채널에 막 위에, hCMEC/D3 뇌 내 피 세포 BBB 복제를 경작 했다. (B) 플라스틱 접시에 고정 칩 조립. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 임피던스 데이터 및 TEER의 결정.
(A) 회로도 임피던스 스펙트럼 표시 임피던스 크기 (Ω) 및 주파수 (Hz), 셀 (파선) 없이 셀 (실선)와 칩에 전기 임피던스 분광학에 대 한 일반적인 대 위상 변화 (°) 4 개 주요 지역, 각각에 의해 지배: 전극, 문화 매체 저항, 셀 장벽 저항 및 셀 막 커패시턴스에 더블 레이어 커패시턴스. "관심 영역" 셀 계층의 기여 정량된 (빨간색 화살표)을 수 있습니다 나타냅니다. (B) 상위 채널 저항 R1 과 R3, 하단 채널 저항 R2 와 R4 와 막 및 EC 장벽 저항 Rm칩의 등가 저항 회로. (C) 도식 크로스 섹션 맨 위 채널에 경작 된 내 피 세포 (EC)를 보여주는. (D) BBB의 도식 평면도 칩 전극의 구성과 0.25 m m2 는 임피던스 측정의 문화 영역을 보여주는. (E) 빈 칩의 대표적인 임피던스 스펙트럼 세포 배양으로 가득합니다. (F) 대표 임피던스 스펙트럼을 hCMEC/d 3에서 칩의 뇌 내 피 세포 3 일에 대 한 문화를 했다. (G) 4 전극의 모든 6 개의 조합 사이 측정 된 저항에서 TEER 계산 공식. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 제발 더 큰 적이 있는 보려면 여기를 클릭 하십시오.이 그림의 한 이온
그림 3: 대표 TEER BBB-온-칩 개발.
4 BBBs-에-칩의 3 일의 문화 기간 동안 22 ± 1.3 Ω cm2 (평균 ± SEM) 고원 도달 의미 (SEM)의 (A) 평균 TEER ± 표준 오차 비교를 위해, 빈 칩의 데이터 포함, 세포 변형 및 칩의 TEER 값에 비해 같은 기간에 한계 편차와 편차 0 Ω c m2 에서 표시 됩니다. (B) 형광 현미경 검사 법의 스테인드 핵 endothelium, PDMS와는 삽입에 표시 된 위치에 막에의 지속적인 단층을 밝혔다. (C) 면역 형광 꽉 접합 단백질 Zonula Occludens-1, BBB-특정 꽉 접속점 세포 사이 측정된 TEER을 야기할 나타내는의 존재를 공개 했다. Elsevier에서 재발급된와 적용할된 권한입니다. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 원고는 기관-온-칩 소자의 엔지니어링 및 장치에 배양 세포 방 벽의 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접적인 결정 발표 됐다. 크린 룸 장비 및 4 개의 전극을 사용 하 여 직접 TEER 결정 없이 전극 통합의 제시 방법 두 미세 구획 어떤 기관-온-칩 장치에 적용 됩니다. 2 개의 구획에 4 개의 전극 분리로 칩 레이아웃 및 형상이 상상된 실험의 요구 사항에 맞게 적용할 수 있습니다. 4 전극 수도 편리 하 게 삽입 기존 칩의 후미에는 그들은 6 측정 기간에 대 한 장소에 집착 하 고 있다. 누설 없는 접합 방법은 PDMS/톨루엔 비율을 변경 하 여 다른 세포 막 및 채널 형상에 대 한 최적화할 수 있습니다. 더 높은 톨루엔 콘텐츠 박격포26 의 얇은 스핀 코팅 층에 결과 및 더 얕은 및 좁은 채널 PDMS 부품에 적합 있을 수 있습니다. 더 두꺼운 박격포의 낮은 톨루엔 콘텐츠 결과26 레이어 고 PDMS 부품 사이의 두꺼운 막을 묶는 데 더 적합할 수 있습니다.
그림 2A 에서 도식 임피던스 스펙트럼 및 그림 2E 와 2F에실험 스펙트럼에서 볼 수 있듯이 임피던스 측정 전극 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스에 의해 영향을 받습니다. microchannels 내부 전극의 작은 크기로 인해 더블 레이어 커패시턴스는 TEER의 정량화를 복잡 하 게 임피던스 스펙트럼에 세포 벽의 저항 고원 위에 지배할 수 있습니다. 이 극복 하기 위해 전극 삽입 될 수 있다 고정 하기 전에 문화 채널에 추가. 이것은 노출 하는 전극의 표면적을 증가 더블 레이어 커패시턴스 뿐만 증가 문화 매체와 그. 이 결과 용량 성 기울기의 변화에 더 낮은 주파수, 세포 벽의 저항 고원 보다 쉽게 인식 하 고 정량 될 수 있도록 었 어 요. 두 개의 전극 사이 측정된 경로의 저항 작은 될 것입니다, 하지만이 하지 제시 방법을 TEER 정량화를 좌우할 것 이다.
세포 장벽을 통해 측정 하는 동안 추가 저항 고원 인식 될 수 없다 가능 하다. 이 예 막 제대로 묶인는 박격포에 의해 세포 장벽 주위에 측정 된 경로에 지도 하는 경우 두 채널 사이의 유체 연결의 결과일 수 있습니다. 또한, 거기 수 전극 문화 매체의 물방울에 의해 연결 되어 있는 경우 칩 외부 전기 브리징. 이것은 일반적으로 낮은 측정 된 임피던스와 결합 하 고 문화 매체의이 다리를 제거 하 여 해결할 수 있습니다. 마지막으로, 거기는 아무 저항 측정 된 임피던스의 크기 순서는 예상 보다 높은 경우 또는 전원에 전기 배선에서 느슨한 연결 수 있습니다.
미래에 현재 BBB-온-칩의 생리 적인 관련성 전단 BBB 차별화 및 증가 장벽 압박감을 증진에 보고 하 고 달성 하기 어렵다 생리 적 수준에서 스트레스를 내 피 세포를 노출 하 여 증가 될 수 있다 기존의 생체 외에서 모델. 29 또한, 제시 장치의 하단 채널 endothelium와 공동 경작 수를 두뇌 파생 셀에 대 한 적합 한 구획을 제공 합니다. 이것 또한 장벽 기능을 증가할 것으로 예상 하 고 또한 병 적인 조건 하에서 관련 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 29
결론적으로,이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 표준 실험실 장비를 사용 하 여 날조 될 수 있다 고 공부 셀의 시각적 검사를 방해 하지 않는 4 개의 통합 된 전극을 사용 하 여 직접 TEER 측정을 제공 하는 표시 됩니다. 레이어입니다. 이 장치 기관에 칩 분야에서의 적용이이 칩에 BBB를 흉내 낸는 TEER 문화 기간 동안 모니터링을 시연 했다. 다른 (장벽) 장기의 호스트는이 칩에 다른 관련 셀 종류를 포함 하 여 유사 수 있습니다. 또한, TEER 측정 하는 방법은 다른 두 구획 기반 기관-온-칩 장치를 장치 및 시스템에 비해 사용할 수 있는 재현 하 고 의미 있는 TEER 값에 도착에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 유익한 토론 및 지원 데이터 표현에 대 한 금형 및 Mathijs 브 롱 호스트의 제조에 Johan Bomer 인정합니다.
이 연구에 의해 투자 되었다: SRO 의치 렌 L.I. Segerink, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; SRO 기관-에-칩 광고 판 데르 Meer, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; 그리고 VESCEL, ERC 고급 부여 A. 반 덴 베 르 그 (보조금 번호 669768).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Scotch Magic tape | 3M | ||
| Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
| UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
| hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
| Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Oven | Binder | 9010-0190 | |
| Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
| UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
| Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Incubator | Binder | CB E2 150 | |
| Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
- Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
- Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
- Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
- Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
