Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Published: September 26, 2017 doi: 10.3791/56334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1
1BIOS Lab on a Chip group, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, MESA+ Institute for Nanotechnology and Max Planck Center for Complex Fluid Dynamics, University of Twente, 2Microsystems, Eindhoven University of Technology, 3Applied Stem Cell Technologies, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente

Summary

Denna publikation beskriver tillverkning av en orgel-on-chip-enhet med integrerad elektroder för direkt kvantifiering av transendothelial resistans (TEER). För validering, den blood - brain barriären var härmade inuti mikroflödessystem enheten och dess barriärfunktion övervakades. De presenteras metoderna för elektrod integration och direkta TEER kvantifiering är allmänt tillämpliga.

Abstract

Organ-på-chips, in vitro- modeller som omfattar kultur (mänskliga) vävnader inuti mikroflödessystem enheter, är snabbt framväxande och löfte att tillhandahålla användbar forskning verktyg för att studera människors hälsa och sjukdom. För att karaktärisera barriärfunktionen av cell lager odlade inuti enheter orgel-on-chip, mäts ofta transendothelial eller transepithelial elektriskt motstånd (TEER). I detta syfte är elektroder vanligtvis integrerade i chip av micromachining metoder att ge stabilare mätningar än uppnås med manuell infogning av elektroder i öppningarna av chip. Dock dessa elektroder ofta försvårar visuell inspektion av det studera celllagrar eller kräver dyra renrum processer för tillverkning. För att övervinna dessa begränsningar, innehåller den enhet som beskrivs här fyra enkelt integrerad elektroder som är placerade och fast utanför kulturområdet, möjliggöra visuell inspektion. Använda dessa fyra elektroder motståndet av sex mätning sökvägar kan kvantifieras, varifrån TEER kan direkt isoleras, oberoende av motståndet av odlingsmedium-fyllda mikrokanaler. På blod - hjärnbarriären duplicerades i denna enhet och dess TEER var övervakas för att visa enheten tillämpligheten. Detta chip, integrerad elektroderna och TEER bestämning metoden är allmänt tillämpliga i organ-på-chips, både att efterlikna andra organ eller införlivas befintliga organ-på-chip system.

Introduction

Organ-på-chips är snabbt växer fram som en ny och lovande klass av in vitro- vävnad modeller. 1 i dessa modeller, celler odlas inuti mikroflödessystem enheter som är konstruerad på ett sådant sätt att de härmar den fysiologiska mikromiljö av dessa celler. 1 , 2 detta resulterar i mer realistiska fysiologiska eller patologiska beteende av dessa celler än kan förväntas från konventionella in vitro- modeller av enkel design och grundläggande funktion. 3 , 5 , 6 dessutom organ-på-chips ger en bättre kontrollerbar miljö än i vivo modeller och kan införliva både frisk och sjuk vävnad från mänskligt ursprung att troget efterbilda både människans fysiologi och patologi. De nyligen summerade framsteg i utvecklingen av blod – hjärnan hinder på chips (BBBs-på-chips) visar att fältet är snabbt rör sig framåt. 7

En annan fördel med organ-på-chips är att de i realtid och kontinuerlig övervakning av vävnaden odlade inuti enheten genom mikroskopi, on-line biokemiska analyser och integrerade sensorer. 1 , 2 exempelvis mätning av transendothelial eller transepithelial elektriska resistans (TEER) är en kraftfull metod för att övervaka icke-invasivt utvecklingen och störningar av barriär-bildar vävnader. 8 , 9 , 10 TEER är det elektriska motståndet över en cellulär barriär och är därför vägledande barriär integritet och permeabilitet. 10 i organ-på-chips odlas allmänt cellulära hinder på ett membran som separerar två fluidic kanaler, som representerar den apikala och basolateral fack att barriären vävnad. I sådana marker, kan TEER mätningar utföras bekvämt med elektroder isatt i vikar och uttag av de två kanalerna. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 dock manuell infogning och återinföring av elektroderna kan lätt resultera i placering fel och således i variationer i uppmätta motståndet som t.ex. skillnaderna i motståndet av längre eller kortare vägar genom mikrokanaler betydande är jämfört med cell barriär motståndet. 16 för att eliminera återinföring fel, enheter med integrerad elektroder har föreslagits. Men de flesta av dessa integrerade elektroder blockera vyn när inspekterar de vävnadsodling17,18,19,20,21 och/eller kräver specialiserade renrum processer för tillverkning. 17 , 22

Den orgel-on-chip-enhet som beskrivs i denna publikation, först tillämpas i en tidigare publikation,16 förenar stabiliteten för integrerad elektroder med synlighet på uppmätta cellager och lätt tillverkning. Design och tillverkning av detta chip avbildas i figur 1. Kort sagt, denna enhet består av två Polydimetylsiloxan (PDMS) delar med kanal avtryck som limmas ihop läckage-fri med polykarbonat membran med 0,4 µm porer i mellan. Fyra platina trådelektroder infogas och fast på plats med en photocurable självhäftande väl utanför kulturområdet. Alla stegen fabrication kan utföras med Allmän laboratorieutrustning, utan behov av renrum. Ovanpå detta, sex impedans mätningar kan göras med dessa fyra elektroder, vilket innebär att direkta isolering av den uppmätta TEER, oberoende av motståndet av den mikrokanaler leder upp till tvärsnittet och därmed minimera påverkan av icke-biologiska variationer i systemet såsom (åter) införande fel. 16

För att Visa tillämpligheten av denna enhet och de direkta TEER-mätningarna, duplicerades på blod - hjärnbarriären (BBB) i detta chip. Denna biologiska barriär består av specialiserade endotelceller och reglerar transporter mellan blod och hjärna att ge hjärnan homeostas. 23 , 24 för att efterlikna BBB, den övre kanalen i ultrakalla enheten var kantad av mänskliga cerebral mikrovaskulära endotelceller från hCMEC/D3 cell linje (vänligen tillhandahållen av Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrike). 25 den presenterade metoden är, men mer allmänt tillämpliga på alla organ-på-chip enheter med två fack, möjliggör direkt TEER bestämning använda enkelt integrerade elektroder.

I detta manuskript beskrivs först tillverkningsprocessen av organ-på-chip enheten med integrerad elektroder. Nästa, sådd förfarandet och kultur av hjärnan endothelial celler inuti enheten förklaras, liksom på chip TEER mätningarna. I resultatavsnittet visas representativa TEER mätningar och databehandling klargöras. Slutligen presenteras barriärfunktionen av BBB-på-chip, övervakas under 3 dagar, visar tillämpligheten av presenterade enheten och metoder för att övervaka TEER.

Protocol

1. tillverkning av enhetens orgel-on-chip

  1. gör en PDMS replik av en mögel med den kanal mönster, tillverkade med hjälp av standard photolithography tekniker, och få PDMS delarna av mikroflödessystem chip.
    1. Väger cirka 27 g PDMS basera agent och 2,7 g härdare; massa förhållandet måste vara 10:1. Detta är bra för en 3 mm tjock PDMS platta på en mögel med 130 mm (5 tum) diameter. Blanda komponenterna.
    2. Lufta blandningen i exsickator under cirka 45 minuter att ta bort luftbubblor.
    3. Under tiden förbereda formen för flytande PDMS blandningen genom att sticka klart tejp runt mögel eller placera mögel i en lämplig wafer hållare.
    4. Häll avgasade PDMS blandningen på mögel. Om någon luft bubblor förblev i PDMS blandningen eller på mögel ytan, degas det igen för ca 30 min.
    5. Bota PDMS blandningen i en ugn vid 60 ° C under 4 h. Tillåt svalna.
    6. i en cross-flow huva, dra den härdade PDMS från mögel, mögel kan återanvändas omedelbart för att göra mer PDMS repliker.
    7. Skär PDMS repliken i separata övre och nedre chip delar med skärande linjerna i PDMS.
    8. Fyra hål i övre delar med en vass biopsi punch med 1 mm diameter till formuläret vikar och försäljningsställen. Punch från insidan till utsidan att förhindra PDMS skräp från samlande i chip. Täcka de chip delarna med tydliga tejp för att skydda dem mot damm.
    9. Skär polykarbonat membran från Transwell skär i fyrkanter ca 3 × 3 mm 2.
  2. Montera ett poröst membran läckage-gratis mellan två PDMS delar för att montera en två-lagers enhet gränssnitt med ett poröst membran.
    Obs: Detta protokoll är anpassad från Griep et al. 19 och Chueh et al. 26
    1. Förbered en PDMS/toluen mortel med 0,7 g av PDMS bas agent, 0,07 g härdare och 540 µL av toluen, vilket resulterar i ett förhållande med 5:3 i vikt. Vortex mortel grundligt.
    2. Spin-coat 200 µL av murbruk på ett täckglas vid 1500 rpm för 60 s (ramped vid 1000 rpm/s) att förvärva ett tunt, enhetliga lager av murbruk.
    3. Överför ett tunt lager av murbruk från täckglaset på en botten och en övre del av chip med en bläck-rollern. Sätta den nedre delen i en ugn-safe maträtt.
    4. Med en pincett, doppa kanterna av ett membran i spin-belagd mortel och placera den försiktigt i mitten av den nedre del.
    5. Noggrant placera den övre delen på den nedre delen medan uppmärksamma justeringen.
      Obs: Inte utöva påtryckningar på chipet och Skjut inte den övre delen över den nedre delen att förhindra murbruk från in kanalerna och igensättning membranet.
    6. Täcka de marker vikar med klart tejp för att förhindra damm från att komma in chipet och grädda dem vid 60 ° C för 3 h.
  3. Integrera elektroder i kanalerna som sida.
    Obs: Detta protokoll är anpassad från Griep et al. 19 och Douville et al. 18
    1. skär platina tråd i bitar ca 2 cm. rena genom att dränka dem i aceton för 30 min. Skölj med vatten och etanol och låt torka.
    2. i en cross-flow huva, sätta ett chip på en plast maträtt. Infoga fyra platina ledningar i elektroden kanaler på ett chip som använder ett par pincett och böj ner dem på plast skålen att aktivera fixering till skålen i ett efterföljande steg. Sätt i ledningarna 0,7-1 mm in i kultur kanal, förbi T-formade kanalen korsningen.
    3. Applicera en droppe UV-härdande lim på elektroden kanal ingången och låt limmet fylla kanalen runt elektroden genom kapillärkrafter.
    4. Slå på UV och bota limmet när den når slutet av kanalen elektrod.
      Varning: Titta inte in i UV-ljuskälla eftersom detta kan skada dina ögon.
    5. Fixera fyra integrerade elektroderna till plast skålen med en tvåkomponents epoxi lim. Detta tillåter enklare hantering av elektroderna vid mätningar utan risk för att dra elektroderna från chip.
    6. Täcka marker med genomskinlig tape och grädda dem i 60 ° C under 2 h. Tillåt att svalna och förvara dammfritt fram till användning. På detta sätt kan de lagras säkert för upp till en månad.

2. Kultur av brain-derived endotelceller på chip

  1. Coat marker för att främja cell fastsättning.
    1. Fylla båda kanaler med fosfat buffrad saltlösning (PBS) att väta dem innan införs reagenser. Kolla under ett Mikroskop om det finns några luftbubblor i kanalerna. Om så, ta bort dem genom att spola med extra PBS.
    2. Fylla båda kanalerna med 30 µL av 20 µg/mL mänskliga Fibronektin i PBS. Inkubera vid 37 ° C i 3 timmar. Kolla efter luftbubblor och, om det behövs, spola kanalerna med PBS och refill med Fibronektin lösning.
    3. Spola marker med endothelial odlingsmedium och inkubera dem vid 37 ° C och 5% CO 2 i en inkubator för 2 h.
    4. Mäter TEER av tomma chips som beskrivs i steg 3 för att säkerställa att alla elektroderna är i direkt kontakt med vätskan i kanalerna. I tomma chips, typiska TEER värden är 0-1 Ω cm 2.
  2. Utsäde celler i övre kanalen.
    1. Ta bort odlingssubstratet från en kultur kolv (75 cm 2 kulturområde) med en konfluenta enskiktslager av mänskliga cerebral mikrovaskulära endotelceller (hCMEC/D3).
    2. Tvätta cellerna med PBS. Tillsätt 2 mL 0,05% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 2-5 minuter tills cellerna har lossnat från kultur kolven.
    3. Inaktivera trypsin med odlingsmedium som kompletteras med 20% fetalt bovint serum (FBS). Räkna cellerna och beräkna det totala antalet celler i suspension.
    4. Under tiden Centrifugera hCMEC/D3 cellerna på 390 x g under 5 minuter och ta bort supernatanten.
    5. Återsuspendera cellpelleten i lämplig volym av endothelial odlingsmedium (EGM-2) att anlända vid en koncentration på 5 x 10 6 celler/mL. Detta resulterar i en sådd densitet för 2 x 10 5 celler/cm 2 i chipet.
    6. Långsamt Pipettera 30 µL av välblandade cellsuspensionen i den övre kanalen och bort pipetten från inloppet i en flytande rörelse medan fortfarande påtryckningsmedel.
    7. Kontrollera sådd tätheten i Mikroskop. En jämn fördelning av celler i hela den övre kanalen bör uppnås.
    8. Inkubera marker vid 37 ° C och 5% CO 2 för minst 1 h. spola ut de grupplösa cellerna med endothelial odlingsmedium.
  3. Underhåll på chip endothelial kulturen.
    1. Två gånger per dag, infoga odlingsmedium-fyllda pipettspetsar som reservoarer i öppningarna och ersätta mediet inuti chipet genom gravitation-driven flöde.
      Obs: För att undvika luftbubblor från att ange mikrokanaler och förstöra det cell-lagret, se till att göra vätska-vätska kontakt mellan pipettspetsen och vätskan ovanpå chipet innan du sätter spets i ett inlopp. Detta kan underlättas genom att lägga till en liten droppe på den i / outlet innan pipett införande.
    2. Också lägga till pipetten tip reservoarer i försäljningsställen att förhindra kanalerna från torkning.
    3. Inkubera marker vid 37 ° C och 5% CO 2.

3. TEER mätningar på chip

  1. ställa in the TEER mätning apparater, bestående av en inlåsning förstärkare och en sond kabel krets som angavs i Van der rodret et al. 16 alternativt potentiostater eller impedans analysatorer är också lämpliga för mätningarna impedans-baserade TEER.
  2. Ta chip från inkubatorn och gör det möjligt att nå rumstemperatur i minst 10 min. ta bort all vätska från plast skålen runt elektroderna att förhindra elektrod överbrygga utanför kretsen.
  3. Ta impedans spektrumet från 200 Hz till 1 MHz för varje kombination av två elektroder, vilket ger 6 impedans spectra per chip i endast 5-10 min. Kontrollera om impedans spektra har beräknade storheter och former för att validera TEER mätning, som är beskrivs i resultatavsnittet.
  4. Sätta chip tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO 2 efter avslutad mätning.
  5. Bearbeta erhållna impedans spektra för att ankomma på ett normaliserat TEER-värde.
    1. Få den uppmätta resistens Equation 1 mellan elektroderna Equation 2 och Equation 3, som betecknas i figur 2B och D, från resistiv platån vid 10 kHz i motsvarande impedans spektra.
    2. Beräkna de TEER som använder sex uppmätta motstånden motsvarar en marker på en gång pekar med hjälp av ekvation i figur 2 g 16:
      Equation 20
      i denna ekvation, Equation 4 är kulturområdet genom vilken mättes motståndet, < img alt = ” Ekvation 5 ”src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg ”/ > är motståndet av den cellulära barriären och membranet, Equation 6, Equation 7, Equation 8 och Equation 9 är motståndet värden som uppmätts genom cellulär barriären och Equation 10 och Equation 11 mäts motståndet värdena i de raka kanaler. 16 ekvationen härleds från motsvarande kretsen illustreras i figur 2 c.
  6. Subtrahera den tomma TEER från TEER vid alla tidpunkter att erhålla utvecklingen av TEER i tid.

Representative Results

Schematiska resultaten av elektrisk impedans spektroskopi genom ett chip utan celler (heldragen linje) och genom en cellulär barriär (streckad linje) visas i figur 2A. Fyra huvudsakliga regioner kan identifieras, varje domineras av en viss elektrisk komponent. Under cirka 1 kHz dominerar den dubbla lager kapacitansen i elektrod-kultur medium gränssnittet, kännetecknas av en negativ lutning för impedans magnitud och en fasförskjutning som närmar sig-90 °. Frekvensen som dominerar den dubbla lager kapacitansen beror på elektroden området utsätts för odlingsmedium. Resistiv platån ovanför 1 (utan celler) eller 100 kHz (med celler) med en fasförskjutning nära 0 °, motsvarar motståndet av odlingssubstratet inne i ultrakalla kanaler, beroende på kanal längd och tvärsnittsarea och insidan av membran, beroende på porositet och tjocklek. Vid mätning genom en cellulär barriär, ses en extra resistiv platå mellan 1 och 10 kHz samt ett lokalt maximum i arrangera gradvisdiagrammet. Denna region är av avgörande betydelse för fastställandet av TEER som en tydlig ökning av impedans resultat när celler är närvarande i de uppmätta sökvägen, och kallas därför ”regionen av intresse”. Den extra lutningen mellan 10 och 100 kHz motsvarar den cell barriär kapacitans, som uppstår från elektriskt isolerande lipid lipidens membran och är beroende av den totala arealen av det cell-lagret. 27 gränserna för dessa regioner samt impedans magnituder beror på systemet som studeras och ändra med, bland annat kanal dimensioner, odlingsmedium ledningsförmåga, elektrod placering och celltyp. För vidare läsning om teori och praktik av elektrisk impedans spektroskopi på barriär-bildar vävnader översiktsartikel av Benson et al. rekommenderas. 28

Representativa uppgifter av TEER mätningar visas för både en tom chip och ett chip med ett hCMEC/D3 hjärnan endotelceller lager i figur 2E och 2F, respektive. Kort sagt, impedans spektroskopi utfördes med hjälp av sex mätningar med fyra elektroder: två mätningar genom cell odlingsmedium-fyllda kanaler (heldragna linjer) och fyra mätningar genom kanalerna samt membranet och - i förekommande fall - den cellulära barriär (streckade linjer). Dessa sex mätning sökvägar kan identifieras i motsvarande resistiv krets av figur 2B, som härrör från Schematisk tvärsektion (figur 2 c) och ovanifrån (figur 2D). De tomma chip mätningarna (figur 2E) visar typiska formen av impedans spectra utan celler, som illustreras i figur 2A. Mätningarna genom cellulär barriären (streckade linjer i figur 2F) liknar typiska impedans spektra med celler i figur 2A. Observera att både impedans omfattningen och fas förändring ökning mot 1 MHz. Detta är den typiska Svaren av mätning vid höga frekvenser och är inte av experimentella ursprung.

För att avgöra de TEER som använder dessa experimentella impedans spectra, först bestäms uppmätta chip motstånd, vilket är det totala motståndet av cell lager, kanaler och membran. Därför en lämplig avläsning frekvens i regionen av intresse valdes, som är den lokala högsta i fas tomten med celler och nära 0 ° fasförskjutning utan celler: 10 kHz. Med sex uppmätta motstånden vid 10 kHz, mätt mellan de fyra elektroderna, beräknas TEER direkt med hjälp av ekvation i figur 2F.

För att visa att presenteras enheten är lämplig för att bestämma TEER i organ-på-chips, BBB duplicerades inuti chipet och dess TEER övervakades under 3 dagar av kultur. I figur 3A genomsnittlig TEER ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) visas för fyra BBBs-på-chips, vilket resulterar i en platå av 22 ± 1,3 Ω cm2, som är jämförbara med TEER av denna cellinje som rapporterats i litteraturen. 29 dessutom efter uppsägning av experiment och fluorescens färgning av atomkärnor, det kan ses att hjärnan endotelet bildade en kontinuerlig enskiktslager inuti enheten (figur 3B). Immunofluorescens färgning av åtsittande föreningspunkt protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) visade att hjärnan endotelceller underhålls deras BBB-specifik fenotyp och bildade snäva Junktional komplex.

Figure 1
Figur 1: Design och montering av organ-på-chip enheten med integrerad elektroder.
(A) Sprängskiss av mikroflödessystem chip, som består av en övre del som PDMS med den övre kanalen (TC), ett membran (M) och botten PDMS delen med den nedre kanalen (BC). Fyra platina trådelektroder (E1-4) infogas och fasta kanaler på sidan. I den övre kanalen och ovanpå membranet odlades hCMEC/D3 hjärnan endothelial celler replikera BBB. (B) monterade chip, fast till en plast maträtt. Omtryckt och anpassad med tillstånd från Elsevier. 16 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa impedans data och bestämning av TEER.
(A) Schematisk impedans spektrum visar impedans magnitud (Ω) och fasförskjutning (°) kontra frekvens (Hz), typisk för elektrisk impedans spektroskopi på marker utan celler (heldragen linje) och med celler (streckad linje). Det finns fyra huvudsakliga regioner, varje domineras av: den dubbla lager kapacitansen på elektroderna, odlingsmedium motståndet, cell barriär motståndet och den cellmembran kapacitansen. ”Regionen av intresse” anger där bidraget från det cell-lagret kan vara kvantifierade (röd pil). (B) motsvarande resistiv krets av chip, visar den övre kanal motstånd R1 och R3, den nedre kanal motstånd R2 och R4 och membran och EG barriär motstånd Rm. (C) Schematisk genomskärning visar endotelceller (EG) odlade i den övre kanalen. (D) Schematisk ovanifrån av BBB chip visar konfigurationen av elektroderna och kulturområdet av 0.25 mm2 genom vilken impedansen mäts. (E) representativa impedans spektra av en tom chip fylld med cellodlingsmedium. (F) representativa impedans spektra av ett chip i vilka hCMEC/D3 hjärnan endothelial celler var kultur i 3 dagar. (G) formel för att beräkna TEER från de uppmätta motstånd mellan alla sex kombinationer av fyra elektroder. Omtryckt och anpassad med tillstånd från Elsevier. 16 vänligen klicka här för att visa en större versIon av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa TEER utveckling av BBB-on-chip.
(A) genomsnittliga TEER ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av fyra BBBs-på-chips kultur under tre dagar, når en platå vid 22 ± 1,3 Ω cm2 (medelvärde ± SEM). För jämförelse ingår data av tomma chips, visar marginell variation och avvikelse från 0 Ω cm2 under samma period jämfört med variation och TEER värdet marker med celler. (B) fluorescensmikroskopi av färgade kärnor avslöjade en kontinuerlig enskiktslager av endotel, både PDMS och membranet på plats som anges i infällt. (C) immunofluorescens visade förekomst av åtsittande föreningspunkt protein Zonula Occludens-1, som anger att BBB-specifika tight junctions mellan cellerna ger upphov till den uppmätta TEER. Omtryckt och anpassad med tillstånd från Elsevier. 16 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

I detta manuskript presenterades konstruktion av en orgel-on-chip-enhet och direkt bestämning av transendothelial elektriska motstånd (TEER) en cellulär barriär som odlade i enheten. Den presenterade metoden att integrera elektroder utan renrum utrustning och direkta TEER bestämning med fyra elektroder är tillämplig på alla organ-på-chip enheter med två mikroflödessystem fack. Chip layout och geometri kan anpassas att passa kraven i de tänkt experiment, så länge som fyra elektroderna är separerade i två fack. De fyra elektroderna kan även infogas bekvämt i öppningarna på befintliga marker, förutsatt att de är fixerade på plats för varaktigheten av de sex mätningarna. Metoden läckage-fri bindning kan optimeras för olika membran och kanal geometrier genom att ändra förhållandet PDMS/toluen. En högre halt av toluen resulterar i ett tunnare spin-belagd lager av murbruk26 och kan vara mer lämplig för grundare och smalare kanaler i PDMS delar. En lägre toluen innehåll resulterar i en tjockare mortel lager26 och kan vara mer lämplig att omsluta tjockare membran mellan PDMS delar.

Som kan ses i Schematisk impedans spektra i figur 2A och de experimentella spektra i figur 2E och 2F, är impedans mätningarna influerade av den dubbla lager kapacitansen i elektrod-medium-gränssnittet. På grund av den lilla storleken på elektroderna inuti mikrokanaler, kan den dubbla lager kapacitansen dominera över resistiv platån av cellulära barriären i impedans spectra, komplicerande kvantifiering av TEER. För att övervinna detta, elektroderna kan införas längre in kultur kanalerna innan fixering. Detta kommer att öka ytan av elektroden utsatt till odlingsmediet och med det den dubbla lager kapacitansen ökar också. Detta resulterar i en förskjutning av kapacitiv lutningen till lägre frekvenser, så att den resistiva platån av cellulära barriär kan lättare igenkända och kvantifierade. Även om motståndet av den uppmätta sökvägen mellan två elektroder blir mindre, kommer detta inte att påverka TEER kvantifiering efter denna metod.

När du mäter genom cellulär barriären, är det möjligt att extra resistiv platån inte kan kännas igen. Detta kan vara resultatet av en fluidic anslutning mellan de två kanalerna, till exempel om membranet är dåligt omsluten av murbruk, leder till en uppmätt bana runt den cellulära barriären. Dessutom kan det elektriska överbrygga utanför chip om elektroderna är anslutna via en droplet som odlingssubstrat. Detta är ofta i kombination med en lägre uppmätta impedansen och kan lösas genom att ta bort denna bro som odlingssubstrat. Slutligen, om det finns ingen resistiv platå och den uppmätta impedansen är tiopotenser högre än väntat, det kan finnas en lös anslutning i den elektriska ledningar eller på strömkällan.

I framtiden, kan den fysiologiska betydelsen av det nuvarande BBB-on-chipet ökas genom att utsätta de endothelial cellerna om du vill skeva stress vid fysiologiska nivåer, vilket redovisas att främja BBB differentiering och öka barriär täthet och är svårt att uppnå i konventionella in vitro- modeller. 29 den nedre kanalen för presenterade enheten innehåller dessutom ett lämpligt fack för brain-derived celler för att tillsammans vara odlade med endotelet. Detta förväntas också öka barriärfunktionen och möjliggör också studiet av komplexa interaktioner mellan relevanta celltyper under sjukdomstillstånd. 29

Sammanfattningsvis, den orgel-on-chip-enhet som beskrivs i denna publikation kan fabriceras använder vanlig laboratorieutrustning och visas att ge direkta TEER mätningar med fyra integrerade elektroder som inte hindrar okulärbesiktning av cellen studerade skikt. Tillämpligheten av denna enhet i fältet organ-på-chips demonstrerades genom att härma BBB i detta chip och övervaka TEER under perioden kultur. En mängd andra (barriär) organ kan vara härmade av inklusive andra relevanta celltyper i detta chip. Dessutom kan metoden för mätning TEER lätt tillämpas i andra två fack-baserade orgel-on-chip-enheter att anlända vid reproducerbar och meningsfull TEER-värden som kan jämföras mellan enheter och system.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt Johan Bomer för tillverkning av mögel och Mathijs Bronkhorst för givande diskussioner och hjälp med datarepresentation.

Denna forskning har finansierats av: SRO biomedicinsk Microdevices av L.I. Segerink, MIRA Institutet för medicinsk teknik och tekniska medicin, universitetet i Twente; SRO organ-på-Chips A.D. van der Meer, MIRA-Institutet för medicinsk teknik och tekniska medicin, universitetet i Twente; och VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr 669768).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning 1673921
Scotch Magic tape 3M
Biopsy punch, 1.0 mm diameter Integra Miltex 33-31AA-P/25
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size Corning 3401 Cut from Transwell culture inserts
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Platinum wire, 200 µm diameter Alfa Aesar 10287
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol Henkel 30673
hCMEC/D3 cells Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml Gibco 33016015
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) Lonza CC-3162 Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots
Trypsin-EDTA, 0.05% Gibco 15400-054
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-079
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Oven Binder 9010-0190
Spin coater: Spin 150 Polos SPIN150-NPP
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 Manufactured in-house
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter
Incubator Binder CB E2 150
Boxense LocSense Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
  3. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  5. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  6. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  7. Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  8. Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
  9. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  12. Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
  13. Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
  14. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  15. Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
  16. Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
  17. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  18. Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
  19. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  20. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
  21. Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
  22. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  24. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  25. Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  26. Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
  27. Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
  28. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
  29. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).

Tags

Biomedical Engineering problemet 127 organ-på-chips mikrofabrikation transendothelial elektriskt motstånd transepithelial resistans blod - hjärnbarriären mikrofluidik
Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Helm, M. W., Odijk, M.,… More

van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., Segerink, L. I. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J. Vis. Exp. (127), e56334, doi:10.3791/56334 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter