Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Et-trins protokol til evaluering af tilstanden af stråling-induceret Clonogenic celledød af Fluorescens mikroskopi

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56338

Summary

Forskning på ioniserende stråling (IR)-induceret clonogenic celledød er vigtigt for at forstå virkningerne af IR på Maligne tumorer og normale væv. Her, vi beskriver en et-trins analyse til vurdering af de vigtigste former for IR-induceret clonogenic celledød baseret på morfologi af 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI)-farves kerner visualiseret ved Fluorescens mikroskopi.

Abstract

Forskning på ioniserende stråling (IR)-induceret clonogenic celledød er vigtigt for at forstå effekten af IR på Maligne tumorer og normale væv. Her beskriver vi en hurtig og omkostningseffektiv one-step assay for samtidig vurdere de store transportformer clonogenic celledød induceret af IR, dvs, apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning. I denne metode, er celler dyrkes på et cover slip bestråles med røntgenstråler og farves med 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI). Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, er apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne identificeret baseret på de karakteristiske morfologier af DAPI-farvede kerner. Apoptose er bestemt af tilstedeværelsen af apoptotiske organer (dvs., kondenseret og fragmenterede kerner). Mitotiske katastrofe er bestemt af tilstedeværelsen af kerner, der udviser to eller flere adskilte kamre og mikronukleus. Cellulære gulne bestemmes ved tilstedeværelsen af gulne-associerede heterochromatic foci (dvs., nukleare DNA med 30-50 lyse, tætte foci). Denne tilgang gør det muligt for eksperimentatoren at nemt skærm for clonogenic celle død tilstande ved hjælp af forskellige cellelinjer, indstillinger for behandling og tidspunkter, med formålet at belyse mekanismerne for celledød i target-cellerne og betingelser af interesse.

Introduction

Ioniserende stråling (IR) inducerer flere former for clonogenic celledød. Forskning på IR-induceret clonogenic celledød er vigtig for at forstå IR toksicitet til normale væv, samt til at udvikle metoder til at øge behandling effekten af kræft strålebehandling. Apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning er de store transportformer clonogenic celledød induceret af IR1. Apoptose er en reguleret tilstand af celledød, der er initieret af DNA skade1. Mitotiske katastrofe er celledød, der opstår på grund af afvigende mitosen skyldes unrepaired DNA dobbelt-strenget pauser1. Cellulære gulne er defineret som en tilstand af irreversibel celle vækst anholdelse2; Bemærk at cellulære gulne er ikke celledød per se, men det er en tilstand af clonogenic celledød fordi det afskaffer clonogenic overlevelse af cellen senescent.

Forskellige cellebaserede assays er udviklet individuelt vurdere apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning. Apoptose kan vurderes ved terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-ende mærkning (TUNEL) farvning, annexin V farvning, DNA fragmentering assays og sub-G1 cellecyklus fase bestemmelse af flow flowcytometri1. Mitotiske katastrofe kan vurderes ved immunfluorescens farvning for mitotiske markører, herunder MPM2, TUNEL farvning og elektronmikroskopi1. Cellulære gulne kan vurderes af gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) farvning, vækst-anholdelse assays og elektronmikroskopi1. Vigtigere er, den dominerende transportform clonogenic celledød adskiller sig blandt cellelinjer og behandling indstillinger3,4. Derfor, for at belyse den overordnede profil af clonogenic celledød for en given eksperimentelle indstilling, flere assays dækker alle disse tilstande af død skal føres sammen, hvilket er omkostningerne- og arbejdskrævende.

I denne artikel vil beskrive vi en hurtig og omkostningseffektiv one-step assay samtidig vurdere apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne induceret af IR3,4. I denne metode, er celler dyrkes på et cover slip bestråles med røntgenstråler og farves med 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI). Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, identificeres apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne hver baseret på de respektive karakteristiske morfologier af DAPI-farvede kerner. Denne tilgang vil være nyttigt for programmer, herunder screening for clonogenic celle død profiler i forskellige cellelinier, behandling indstillinger og tidspunkter, med mål at undersøge mekanismerne af celledød i target-cellerne og betingelserne for interesse.

Protocol

1. forberedelse af materialer

  1. autoklave dække underkjoler.
    1. Placere dæksel glider i et glas bægerglas.
    2. Dække glas bægerglas med folie.
    3. Autoklavering ved 121 ° C i 15 psi for 20 min.
    4. Tørre på 50 ° C. opbevares ved stuetemperatur i en kultur hætte.
  2. Forberede fiksering løsning: 3% PARAFORMALDEHYD + 2% saccharose i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    1. Til en 1000 mL glasflaske, tilføje 700 mL PBS og 30 g PARAFORMALDEHYD.
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er ætsende, bære passende handsker.
    2. Opløses PARAFORMALDEHYD fuldstændigt ved opvarmning til 80 ° C ved hjælp af en mikroovn.
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD dampe er giftige, bære en maske.
    3. Forlade ved rumtemperatur natten.
    4. Tilføje 20 g saccharose.
    5. Tilføje PBS til at gøre det samlede rumfang 1 L.
    6. Alikvot i 50 mL rør. Fiksering løsning kan lagres i 3 år ved-20 ° C eller til 3 måneder ved 4 ° C.

2. Forberedelse af cellekultur

NOTE: disse procedurer bør udføres i en kultur hætte.

  1. Kultur og passage U2OS menneskelige osteosarkom celler til at opretholde logaritmisk vækst 5.
    Bemærk: Andre celletyper kan bruges efter bestemmelse af den optimale bestråling dosis.
  2. Tørre en skalpel med papirservietter fugtet med 70% ethanol. Ved hjælp af en skalpel, placere en cover slip på et 35 mm celle kultur parabol (herefter blot omtales som " skålen ").
    Bemærk: Antallet af cover smutter i én skål kan øges efter de eksperimentelle design (Se diskussion).
  3. Tilføje 1 mL kultur medier: DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum.
    Bemærk: Andre medier kan bruges efter den valgte celletype.
  4. Tør pincet med papirservietter fugtet med 70% ethanol. Brug af pincet, hold forsigtigt midten af dækslet slip. Opsug dyrkningsmedier fra fadet helt, samtidig med at et hold på cover slip.
    ​ Bemærk: dette trin fremmer immobilisering af cover slip til fadet.
  5. Frigør vedhængende kulturperler celler ved hjælp af trypsin 5.
    1. Opsug kultur medier fra fadet.
    2. Tilsættes 1 mL PBS og ryst fadet forsigtigt.
    3. Opsug PBS fra fadet.
    4. Tilføje 1 mL trypsin [0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA] til fadet.
    5. Incubate i 5 min ved 37 ° C i en atmosfære, der indeholder 5% CO 2.
    6. Tilføje 9 mL dyrkningsmedier til fadet.
    7. Ved hjælp af en 1000 μL mikropipette, forberede en enkelt celle suspension.
  6. Tælle celler 5.
    1. i en 1,5 mL tube, tilføje 0,9 mL cellesuspension og 0,1 mL 0,4% Trypan blå løsning.
    2. Anvendes 10 μl til en hemocytometer.
    3. Undersøge, hvor mange af unstained (dvs., live) celler under en omvendt-fase mikroskop.
  7. i en 15 mL tube, forberede 3 mL cellesuspension i kultur medier med en tæthed på 0,5 x 10 5 celler/mL.
    Bemærk: Celle tæthed kan ændres efter eksperimentel brug (Se diskussion).
  8. Forsigtigt tilsættes 2 mL af cellesuspension til fadet.
  9. Incubate natten over ved 37 ° C i en atmosfære, der indeholder 5% CO 2.

3. Bestråling

forsigtighed: håndtere X-ray irradiator omhyggeligt ifølge producenten ' s instruktioner.

  1. Undersøge celler under en omvendt-fase mikroskop. Bekræfte, at cellerne er knyttet til at dække glide og levende.
  2. Bestråle parabol med 6 Gy x-stråler (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
  3. Incubate i 72 timer ved 37 ° C i en atmosfære, der indeholder 5% CO 2.
    Bemærk: Inkubationstiden kan ændres efter den eksperimentelle design (Se diskussion).

4. Fiksering

  1. Opsug kultur medier fra fadet.
  2. Ved hjælp af saks, skåret spidsen af en 1000 μL mikropipette tip 5 mm fra enden.
    Bemærk: Skåret spidsen hjælper problemfrit anvende fiksering løsning.
  3. Ved hjælp af klippe spidsen, tilsættes 1 mL fiksering løsning (udarbejdet i trin 1.2) til fadet fra sidevæg af fadet.
    Bemærk: Dette trin er tid-følsomme og bør derfor udføres uden at ændre mikropipette tips, når du håndterer flere prøver. Anvendelse af fiksering løsning direkte på bunden af fadet kan skade cellerne.
  4. Placer fadet i en firkantet kultur parabol. Ryst firkantede kultur parabol forsigtigt for at distribuere fiksering løsning over dække slip jævnt.
  5. Incubate i 10 min ved stuetemperatur.
  6. Opsug fiksering løsning fra fadet.
  7. Tilsættes 2 mL PBS til fadet fra sidevæg af fadet.
    Bemærk: Anvendelse af PBS direkte til bunden af fadet kan skade cellerne.
  8. Opsug PBS fra fadet.
  9. Gentag trin 4.7 og 4.8 dobbelt.
    Bemærk: Skålen kan opbevares i 1 uge på 4 ° C med dæksel glider badet i 2 mL PBS.

5. DAPI farvning

  1. til et dias glas, anvende 5 μl 1 μg/mL DAPI farvning reagens.
    Bemærk: DAPI farvning reagens er stabil i 6 måneder, når den opbevares beskyttet mod lys ved eller under -20 ° C.
  2. Ved hjælp af en skalpel, fjerne dækslet slip fra fadet.
  3. Trække off overskydende PBS på cover slip ved at røre ved kanten af dækslet slip med et stykke køkkenrulle.
  4. Montere dække glide op og ned på dråbe af DAPI farvning reagens på dias glas, således at cellerne er udsat for DAPI farvning reagens.
    Bemærk: Dette trin er tid-følsomme. Tørring af DAPI farvning reagens kan føre til suboptimale farvning.
  5. Prøver kan opbevares i 1 år på -20 ° C.

6. Billed tilegnelse

  1. undersøge prøve på et fluorescens mikroskop. Kerner er visualiseret ved hjælp af filteret DAPI.
    Bemærk: Enten en 20 X eller en 60 X olie linse kan bruges ifølge forskeren ' interesse. Når du bruger en 60 X olie linse, tilføje en dråbe olie på slip cover. Pas på, at prøverne ikke røre linsen; ellers, linsen kan blive beskadiget.
  2. Opnå billeder af kerner ved hjælp af en CCD kamera og digital image erhvervelse software med følgende indstillinger og parametre: DAPI filter, éncellelag billeder, få 1 X og automatisk eksponering.
  3. Finish billed tilegnelse: tørre 20 X linse med papirservietter fugtet med linse renere. Tørre 60 X olie linse med papirservietter fugtet med chloroform.

7. Evaluering af Clonogenic celle død tilstand

  1. i tilfældigt valgte billeder, tælle antallet af kerner, der opfylder kriterierne for apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne, indtil det samlede antal optalte kerner når 300. Udføre dette trin i tre eksemplarer for hver eksperimentelle indstilling.
    1. Kriterier for apoptose: tilstedeværelse af apoptotiske organer (dvs., kondenseret og fragmenterede kerner) 6 , 7.
    2. Kriterier for mitotiske katastrofe: tilstedeværelse af kerner viser to eller flere særskilte lapper eller micronuclei 8 , 9 , 10.
    3. Kriterier for cellulære gulne: tilstedeværelse af gulne-associerede heterochromatic foci (SAHF) (dvs., nukleare DNA med 30-50 lyse, tætte foci) 2 , 11.

Representative Results

Som et eksempel, var U2OS menneskelige osteosarkom celler behandles med 6 Gy x-stråler, inkuberes i 72 h og udsat for DAPI farvning assay efter protokol. Fig. 1 viser zoomede billeder for de typiske nukleare morfologier tilknyttet apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne fremstillet ved hjælp af en 60 × olie linse. Henvise til trin 7.1.1-7.1.3 for de karakteristiske morfologier for hver tilstand af clonogenic celledød. Figur 2 viser oversigt billeder af kerner fremstillet ved hjælp af en 20 X linse. Bestråling med 6 Gy x-stråler induceret mitotiske katastrofe ofte, apoptose mindre hyppigt og cellulære gulne sjældent. På denne måde giver undersøgelse på en lav forstørrelse felt en til at pågribe en overblik over det samlede billede af clonogenic celle death profil i en given eksperimentelle indstilling. Figur 3 viser en grafisk repræsentation af de kvantitative data.

Figure 1
Figur 1: zoomet billeder af DAPI-farvede kerner viser typiske morfologier apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne. U2OS celler var bestrålet med 6 Gy x-stråler. Efter 72 h, blev cellerne fast og farves med DAPI. Nukleart billeder blev erhvervet ved hjælp af en 60 X olie linse. Skalalinjen = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: oversigt over billeder af DAPI-farvede kerner af celler behandles med røntgenstråler. U2OS celler blev bestrålet med 6 Gy x-stråler eller mock-bestrålet. Efter 72 h, blev cellerne fast og farves med DAPI. Billeder af kerner er anskaffet ved hjælp af en 20 X linse. Cirkler, apoptose; pile, mitotiske katastrofe. Skalalinjen = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificerede data for apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne induceret i celler behandles med røntgenstråler. U2OS celler blev bestrålet med 6 Gy x-stråler eller mock-bestrålet. Efter 72 h, blev cellerne fast og farves med DAPI. Billeder af kerner er anskaffet ved hjælp af en 20 X linse. Fra tilfældige felter, ialt 300 kerner blev evalueret for apoptose (Ap), mitotiske katastrofe (MC) og cellulære gulne (Sns). Evalueringerne blev udført i tre eksemplarer. Middelværdierne er vist, og fejllinjer angive standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De kritiske trin i protokollen er som følger. Først, skal celler dyrkes på kultur parabol som en éncellelag fordi en morfologisk bedømmelse af DAPI-farvede kerner er vanskeligt for flere lag celler. Til dette formål, taktfast 2.9, anbefales omhyggelig overførsel af kultur parabol til en inkubator; ryste af kultur parabol genererer en hvirvel af suspenderede celler, der fører til koncentrationen af celler i midten af kultur parabol. Derudover bør overconfluence fører til flere lag celler undgås. Herpå, taktfast 2.7, kan antallet af celler seedede på kultur parabol ændres baseret på befolkningens fordobling tid og intervallet mellem bestråling og fiksering. En sammenløb af omkring 80 på tidspunktet for fiksering anbefales. Andet, hastighed er vigtig i optagelsen og DAPI farvning (dvs., trin 4 og 5). Inter prøve uoverensstemmelse med hensyn til den tid, det tager for disse trin kan føre til forskelligartethed i DAPI signal intensitet i kerner, hvilket ville forvanske den morfologiske vurdering.

Taktfast 2.2 kan antallet af cover smutter i en enkelt kultur parabol øges; et maksimum på fire dæksel glider kan placeres i en 35 mm parabol, og antallet kan blive øget yderligere ved hjælp af større retter. Placere flere cover underkjoler i hver kultur parabol gør det muligt for den effektive drift af tid kursus vurdering af en given behandling (dvs., dækslet til følgesedler kan indsamles fra en kultur parabol én efter én på flere tidspunkter af interesse).

Taktfast 3.2 kan bestråling dosis ændres ifølge forskernes interesse. Anvendelse af en ensartet dosis på flere cellelinjer muliggør sammenligning af følsomhed over for hver tilstand af clonogenic celledød blandt cellelinjer. På den anden side de iso-clonogenic overlevelse doser for hver cellelinje giver mulighed for sammenligning af clonogenic celle død profiler blandt cellelinjer. Iso-clonogenic overlevelse dosis kan bestemmes ved clonogenic overlevelse assay12. D10 værdi, den dosis, der giver 10% clonogenic overlevelse, er en fælles slutpunkt til iso-clonogenic overlevelse dosis.

Taktfast 3.3 kan tiden fra bestråling til fiksation ændres ifølge forskernes interesse; Dette er vigtigt fordi spidsbelastningen for IR-induceret apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne varierer efter cellelinie og behandling. I denne artikel, vi brugt 72 h efter bestråling som det tidspunkt, der ville være mest nyttig for den indledende screening af clonogenic celle død profiler, baseret på flere undersøgelser af vores gruppe og andre beskrevet som følger1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-stråle-induceret apoptose i celler etableret fra solide tumorer oftest opstår et par dage efter bestråling. (ii) X-stråle-induceret mitotiske katastrofe i kræftceller opstår mest fremtrædende på den anden eller tredje mitosen efter overgang fra midlertidig celle-cyklus anholdelse induceres ved bestråling. Udgivelsen sker normalt ca 24 timer efter bestråling, efterfulgt af gentagne mitoses i intervaller på ca 24 h. (iii) X-stråle-induceret cellulære gulne bliver tydeligt efter et interval afhængig af den pågældende cellelinie: 2 dage efter bestråling for nogle tidlig tilfælde, og 7 dage efter bestråling for de fleste cellelinjer. Efter at opnå et overordnet billede af cellen clonogenic død profiler fra den indledende screening, tid kursus eksperimenter vil give en mere detaljeret forklaring af spidsbelastningen for hver tilstand af clonogenic celledød i specifikke cellelinie og/eller tilstand renter4.

Det skal bemærkes, at DAPI farvning assay og clonogenic overlevelse assay, en guld-standard metode for stråling følsomhed vurdering, ikke der udskiftelige. Apoptose og mitotiske katastrofe kun vare timer. Således registrerer DAPI farvning assay for en given tidspunkt apoptose og mitotiske katastrofe, der opstår for tidspunkt for vurderingen. På den anden side assay resultaterne af clonogenic overlevelse på et givet tidspunkt punkt omfatter det samlede beløb af apoptose og mitotiske katastrofe, der var sket under inkubationstiden for typisk 10-14 dage efter bestråling. Forskellig fra apoptose og mitotiske katastrofe, senescent celler forbliver på kultur fadet; de ophobes gradvist over tid efter bestråling. Derfor, resultaterne af begge DAPI farvning assay og clonogenic overlevelse analyse afspejler det samlede beløb for ældning, som opstod under inkubationstiden. Vigtigere, andelen af apoptose, mitotiske katastrofe og gulne induceres ved bestråling varierer meget efter celle linje og bestråling dosis. Tilsammen, teoretisk, resultaterne af en analyse ikke kan oversættes direkte til dem af andre analysen.

DAPI farvning assay har nogle begrænsninger. Først, det er fortsat kontroversielt, om mitotiske katastrofe er en særskilt transportform celledød. Inden for stråling biologi anses mitotiske katastrofe en større tilstand af IR-induceret celledød, der adskiller sig fra andre mekanismer clonogenic celle død1. På den anden side hævder andre at mitotiske katastrofe ikke er en særskilt transportform celledød, men snarere en proces, der går forud for celledød herunder apoptose og nekrose13,14. Således apoptose og mitotiske katastrofe kan overlappe hinanden til en vis grad. Andet, tidligere undersøgelser tyder på, at cellulære gulne kan forekomme i fravær af SAHF i nogle cellelinjer og behandling indstillinger2. På nuværende, andre assays specialdesignet til hver clonogenic celle bør død tilstand anvendes til at øge robustheden af konklusionerne i en given eksperiment. For det tredje kan ikke DAPI farvning assay vurdere tilstande af clonogenic celledød end apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne (fx, nekrose og autophagy). For det fjerde har nytte af DAPI farvning assay som en prædiktor for tumor respons på strålebehandling ikke blevet belyst i klinikken. Fra dette synspunkt er clonogenic overlevelse analyse, som vurderer den samlede clonogenic celledød, overlegen i forhold til DAPI farvning assay, fordi en sammenhæng er blevet etableret mellem SF2, de overlevende brøkdel af celler bestråles med 2 Gy X-stråler, og strålebehandling15tumor svaret. Det er dog værd at bemærke, at clonogenic overlevelse analyse ikke udnyttes bredt i klinikken, hovedsagelig på grund af kravet om en høj grad af ekspertise og en lang periode (dvs., 14 dage) for dataopsamling. Til sammenligning, proceduren for DAPI farvning assay er enklere og tager betydeligt kortere tid, ca. 3-4 dage, til at skabe resultater. Nytten af DAPI farvninganalysen som en prædiktor for tumor respons på strålebehandling vil blive testet i klinikken i den nærmeste fremtid.

Sammenfattende er DAPI farvning assay en omkostningseffektiv one-step assay samtidig vurdere de tre store tilstande af IR-induceret clonogenic celledød. Denne tilgang gør det muligt at nemt skærm for tilstande af clonogenic celledød for forskellige cellelinjer, indstillinger for behandling og tidspunkter, med formålet at belyse mekanismerne for celledød i target-cellerne og betingelser af interesse.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker fru Akiko Shibata for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan for programmer for førende kandidat skoler, dyrke globale ledere i tunge Ion Therapeutics og teknik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cover slip Matsunami C013001
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG
sucrose Sigma-Aldrich 84097-250G
phosphate-buffered saline Cosmo Bio 16232000
scalpel Kai Medical No.20, 520-A
35 mm cell culture dish Falcon 353001
trypsin Wako 201-16945
inverted phase microscope Shimazu 114-909
X-ray irradiator Faxitron Bioptics Faxitron RX-650
square culture dish Corning 431110
slide glass Matsunami Pro-11
DAPI staining reagent Cell Signaling 8961S
fluorescence microscope Nikon ECLIPSE Ni
fluorescence microscope DAPI filter Nikon U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
fluorescence microscope lens (20×) Nikon Plan Apo λ 20X/0.75
fluorescence microscope lens (60×, oil) Nikon Plan Apo λ 60X/1.40 oil
oil Olympus N5218600
CCD camera Nikon DS-Qi2
digital image acquisition software Nikon NIS-Elements Document
lens cleaner Olympus OT0552
chloroform Wako 035-02616

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 128 stråling biologi ioniserende stråling clonogenic celledød apoptose mitotiske katastrofe cellulære gulne Fluorescens mikroskopi DAPI farvning
Et-trins protokol til evaluering af tilstanden af stråling-induceret Clonogenic celledød af Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, D., Shibata, A., Oike,More

Kobayashi, D., Shibata, A., Oike, T., Nakano, T. One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56338, doi:10.3791/56338 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter