Summary
이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.
Abstract
이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, IR, 즉, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드를 동시에 평가 대 한 신속 하 고 비용 효율적인 단계 분석 결과 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화 식별 됩니다 DAPI 스테인드 핵의 특징적인 형태학에 따라. Apoptosis는 apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵)의 존재에 의해 결정 됩니다. Mitotic 재앙은 두 개 이상의 고유한 돌출부 및 micronuclei 핵의 존재에 의해 결정 됩니다. 세포 노화 노화 관련 heterochromatic foci (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 쉽게 clonogenic 세포 죽음 모드 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 또는 시간 포인트를 사용 하 여 화면을 실험 수 있습니다.
Introduction
이온화 방사선 (IR) clonogenic 세포 죽음의 여러 모드를 유도합니다. Clonogenic IR 유도 된 세포 죽음에 대 한 연구는 암 방사선 요법의 치료 효능을 증가 하는 방법을 개발 뿐만 아니라 정상 조직에 IR의 독성을 이해 하기 위한 중요 합니다. Apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 IR1에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드. Apoptosis는 DNA 손상1에 의해 시작 된 세포 죽음의 통제 모드입니다. Mitotic 재앙은 배달된 DNA 이중 가닥 나누기1에서 발생 하는 탈 선 유사 분열으로 인해 발생 하는 세포 죽음 이다. 세포 노화는 돌이킬 수 없는 세포 성장 체포2;의 상태로 정의 됩니다. 세포 노화 세포 죽음 본질적 아니다, 하지만 그것은 clonogenic 세포 죽음의 모드 때문에 노화 세포의 clonogenic 생존 곧 note.
다양 한 세포 기반 분석 실험 개별적으로 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화를 평가 하기 위해 개발 되었습니다. Apoptosis 흐름 cytometry1터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉-끝 레이블 (TUNEL) 얼룩, annexin V 얼룩, DNA 파편 분석 실험, 그리고 하위-G1 세포 주기 단계 결정으로 평가 될 수 있다. Mitotic 재앙 면역 형광 mitotic 마커, MPM2, TUNEL 염색, 전자 현미경1등에 대 한 얼룩에 의해 평가 될 수 있다. 세포 노화 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 얼룩, 성장 검거 분석 실험, 및 전자 현미경1에 의해 평가 될 수 있다. 중요 한 것은, clonogenic 세포 죽음의 우세 모드 셀 라인 및 치료 설정3,4마다 다릅니다. 따라서, 주어진된 실험 설정에 대 한 clonogenic 세포 죽음의 전반적인 프로필, 명료 하 모든 죽음의 이러한 모드를 포함 분석 하는 여러 실험 해야 합니다 실시 함께, 노동 및 비용 집중입니다.
이 문서에서 우리는 apoptosis, mitotic 혁명과 IR3,4에 의해 유도 된 세포 노화를 동시에 평가 대 한 분석 결과 신속 하 고 비용 효율적인 단계를 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 각각 식별 DAPI 스테인드 핵의 각각 특징적인 형태학에 기반. 이 방법은 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 조사 대상 세포 조건에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 시간 포인트에서 clonogenic 세포 죽음 프로필에 대 한 심사를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 도움이 될 것입니다. 관심입니다.
Protocol
1. 재료의 준비
- 압력솥 커버 전표.
- 유리 비 커에 커버 전표 장소.
- 호 유리 비 커를 커버.
- 20 분에 대 한 15 psi에서 121 ° C에 고압
- 문화 후드에 실 온에서 50 ° c.가 게에서 건조.
- 고정 솔루션 준비: 3 %paraformaldehyde + 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 자당.
- 1000 mL 유리병 700 mL PBS와 30 g paraformaldehyde 추가.
주의: Paraformaldehyde 부식성, 적절 한 장갑을 착용 하십시오. - 전자 레인지를 사용 하 여 80 ° C에가 열 하 여 완전히 분해 paraformaldehyde.
주의: Paraformaldehyde 연기 독성, 마스크를 착용. - 하룻밤 실 온에 둡니다.
- 추가 20 g 자당.
- 1 총 볼륨을 추가 PBS L.
- 약 수 50 ml에서 튜브입니다. -20 ° C에서 3 년 또는 4에서 3 개월간 고정 솔루션 저장 될 수 있다 ° c.
- 1000 mL 유리병 700 mL PBS와 30 g paraformaldehyde 추가.
2. 세포 배양의 준비
참고:이 절차는 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
로그 성장 5를 유지 하기 위해- 문화와 통로 U2OS 인간의 다리 셀.
참고: 다른 세포 유형 최적의 방사선 복용량을 결정 한 후에 사용할 수 있습니다. - 70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 닦으십시오. 35 mm 셀 문화 접시에 커버 슬립을 배치, 메스를 사용 하 여 (이 단순히 라고도 " 접시 ").
참고: 한 접시에 커버 실수할 수는 실험에 따라 늘릴 수 있습니다 (토론 참조) 디자인. - 추가 1 mL 문화 미디어: 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 DMEM.
참고: 다른 미디어는 선택한 셀 형식을 사용할 수 있습니다.
종이 수건으로 닦아 - 겸 70% 에탄올과 습. 커버 슬립의 중심을 잡고 부드럽게는 집게를 사용 하 여. 커버 슬립에 보류를 유지 하면서 접시에서 배양을 완전히 발음.
참고:이 단계는 접시 커버 슬립의 동원 정지 촉진. - 부착 배양된 세포를 트립 신 5를 사용 하 여 분리.
- 배양 접시에서 발음.
- 1 mL PBS를 추가 하 고 요리를 부드럽게 흔들어.
- 접시에서 PBS 발음.
- 1 mL의 트립 신 [0.25w/v% 트립 신-1mmol/L EDTA] 요리 추가.
- 품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 5 분.
- 9 mL 문화 미디어 요리를 추가.
- 1000 μ micropipette를 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션 준비.
- 계산 셀 5.
- 1.5 mL 튜브에 더하고 0.9 mL 세포 현 탁 액 0.1 mL 0.4 %Trypan 블루 솔루션.
- 는 hemocytometer 적용 10 μ.
- 검사의 수는 반전 단계 현미경 셀 (즉, 라이브) 흠 없는.
- 15ml 튜브에서 3 mL 세포 현 탁 액 0.5 x 10 5 셀/mL의 조밀도에 문화 미디어에서 준비.
참고: 셀 밀도 실험에 따라 수정할 수 있습니다 필요 (내용 참조). - 부드럽게 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가.
- 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 품.
3. 방사선
주의: 신중 하 게 제조 업체에 따라 x 선 irradiator 처리 ' s 지침.
- 거꾸로 위상 현미경 세포 검사. 커버 슬립 하 고 살아있는 셀 연결 되어 있는지 확인 하십시오.
- 6 Gy 엑스레이와 접시를 비추는 (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- 품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ℃에서 72 h.
참고: 보육 시간 실험에 따라 변경 될 수 있다 (토론 참조) 디자인.
4. 고정
- 배양 접시에서 발음.
- 사용이 위, 1000 μ micropipette의 끝을 잘라 팁 끝에서 5 mm.
참고: 컷된 팁 부드럽게 고정 솔루션을 적용 하는 데 도움이. - 접시의 측면 벽에서 접시에 1 mL (단계 1.2 준비) 고정 솔루션 컷된 팁을 사용 하 여 추가.
참고:이 단계 시간적 이며, 따라서 여러 샘플을 처리할 때 micropipette 팁을 변경 하지 않고 수행 되어야 한다. 접시의 바닥에 직접 고정 솔루션의 응용 프로그램은 세포를 손상 시킬 수 있습니다. - 광장 문화 접시에 접시를 놓습니다. 흔들어 균등 하 게 커버 슬립 고정 솔루션 배포를 부드럽게 광장 문화 접시.
- 실 온에서 10 분 동안 품.
- 접시에서 고정 솔루션 발음.
- 접시의 측 벽에서 접시에 PBS의 2 개 mL를 추가.
참고: 응용 프로그램 PBS의 접시의 바닥을 직접 세포를 손상 시킬 수 있습니다. - 접시에서 PBS 발음.
- 4.7-4.8 두 번 반복 단계.
참고: 접시 저장 될 수 있다 4 ° C에서 1 주 동안 2 mL PBS에에서 목욕 커버 미끄러져와.
5. DAPI 얼룩
- 슬라이드 유리, 5 μ 1 μ g/mL DAPI 얼룩 적용 시 약.
참고: 시 약 얼룩 DAPI는 6 개월에 대 한 안정적인 저장 될 때-20 이하로 빛 으로부터 보호 ° c. - 접시에서 커버 슬립을 제거, 메스를 사용 하 여.
- 종이 타월 커버 슬립의 가장자리를 만져 커버 슬립에 초과 PBS에서 그릴.
- 마운트 커버 슬립 DAPI 셀 DAPI 얼룩 시 약에 노출 되는 있도록 슬라이드 유리에 시 약을 얼룩의 드롭에 거꾸로.
참고:이 단계는 시간적. DAPI에서의 건조 시 약 얼룩 이어질 수 있는 차선의 얼룩. - 샘플-20에서 1 년 동안 저장 될 수 있다 ° c.
6. 이미지 수집
- 검사에는 형광 현미경 샘플. 핵 DAPI 필터를 사용 하 여 시각화 됩니다.
참고: 중 하나는 20 X 또는 60 X 오일 렌즈를 사용할 수 있습니다, 연구원에 따르면 ' s 관심. 60 X 오일 렌즈를 사용할 때 커버 슬립에 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플; 렌즈를 만지지 마십시오 조심 그렇지 않으면, 렌즈 손상 될 수 있습니다. - 다음 설정 및 매개 변수는 CCD 카메라와 디지털 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 핵의 이미지: DAPI 필터, 단층 이미지, 1 X, 및 자동 노출의 이득.
- 완료 이미지 수집: 20 X 렌즈 렌즈 클리너 적신 종이 타월로 닦아. 클로 프롬을 적신 종이 타월로 기름 렌즈 X 60을 닦아.
7. Clonogenic 세포 죽음 모드의 평가
- 계산된 핵의 총 수는 300에 도달할 때까지 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 기준을 충족 하는 핵의 수를 계산 하는 무작위로 선택 된 이미지에서. 각 실험 설정에 대 한 3 중에이 단계를 수행.
- Apoptosis에 대 한 기준: apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵) 6 , 7의 존재.
- 기준 mitotic 재앙: 두 개 이상의 고유한 돌출부 또는 micronucl를 보여주는 핵의 존재이 8 , , 9 10.
- 세포 노화에 대 한 기준: 노화 관련 heterochromatic foci (SAHF) (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재 2 , 11.
Representative Results
예를 들어, U2OS 인간 다리 셀 6 Gy 엑스레이와 치료, 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 DAPI 얼룩이 지는 프로토콜에 따라 분석 결과를 받게. 그림 1 apoptosis, mitotic 혁명과 60 × 오일 렌즈를 사용 하 여 얻은 세포 노화와 관련 된 일반적인 핵 형태학에 대 한 확대 된 이미지를 보여줍니다. Clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 대 한 특성 형태학에 대 한 단계 7.1.1-7.1.3를 참조 하십시오. 그림 2 20 X 렌즈를 사용 하 여 얻은 핵의 개요 이미지를 보여줍니다. 6 Gy 엑스레이와 방사선 유발 mitotic 재앙 자주, 자주, apoptosis와 세포 노화 거의. 이러한 방식으로, 낮은 배율 필드에서 검사는 주어진된 실험 설정에서 clonogenic 세포 죽음 프로필의 전체 그림을 한 눈에 파악 하 하나 수 있습니다. 그림 3 은 정량된 데이터의 그래픽 표현.
그림 1: DAPI 스테인드 핵 보여주는 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화의 일반적인 형태학의 이미지를 확대. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이 함께 조사 했다. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵 이미지 오일 렌즈 X 60을 사용 하 여 인수 했다. 눈금 막대 20 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 개요 이미지 셀의 핵 DAPI 스테인드의 x-레이로 치료. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 원, apoptosis; 화살표, mitotic 재앙입니다. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: x-레이로 치료 하는 세포에서 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 정량된 데이터. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 무작위 분야에서 총 300 핵 apoptosis (Ap), mitotic (MC), 혁명과 세포 노화 (Sns)에 대 한 평가 했다. 평가 3 중에서 수행 했다. 평균 값이 표시 됩니다, 그리고 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 세포 해야 될 성장 문화 접시에는 단층으로 다층 셀 어렵습니다 DAPI 스테인드 핵의 형태 평가 실시 하기 때문에. 2.9, 단계에서이 끝에 인큐베이터에 문화 접시의 주의 전송 것이 좋습니다; 문화 접시의 동요 문화 접시의 중앙에 세포의 농도에 이르게 중단된 셀의 소용돌이 생성 합니다. 또한, overconfluence 다층 셀 선도 피해 야 한다. 이 위해, 단계, 2.7에서에서 문화 접시에 시드 셀 수 시간과 방사선 및 고정 사이의 간격을 두 배로 하는 인구에 따라 수정할 수 있습니다. 고정 시간에 약 80의 합류는 것이 좋습니다. 둘째, 속도 고정 및 DAPI 얼룩 (즉, 4-5 단계)에서 중요 하다. 이러한 단계에 대 한 시간에 관한 간 샘플 불일치가 형태학 평가 애매 한 것이 핵에 DAPI 신호 강도 발생할 수 있습니다.
2.2 단계에서 단일 문화 접시에 커버 슬립의 수를 증가 수 있습니다; 4 덮개 미 끄 러 짐의 최대 35 mm 접시에 놓일 수 있다 그리고 더 큰 접시를 사용 하 여 수를 더 증가 될 수 있다. 여러 표지 전표 각 문화 접시에 배치 (즉, 커버 전표 관심의 여러 시간 점에서 문화 접시 하나 하나에서에서 수집 될 수 있습니다) 특정된 치료에 대 한 시간 코스 평가의 효율적인 운영 수 있습니다.
3.2 단계에서 방사선 복용량은 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 여러 셀 라인에 일관 된 복용량의 응용 프로그램에는 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 감도의 비교 수 있습니다. 다른 한편으로, 각 셀 라인에 대 한 iso clonogenic 생존 복용량의 사용 비교를 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음 프로필의 있습니다. Iso clonogenic 생존 복용량 clonogenic 생존 분석 결과12에의해 결정 될 수 있습니다. D10 값 10 %clonogenic 생존을 제공 하는 복용량 iso clonogenic 생존 복용량에 대 한 일반적인 끝점입니다.
3.3 단계에서 고정 하는 방사선에서 시간; 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 적외선 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 피크 시간 셀 라인 및 치료에 따라 다르기 때문에 이것이 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 clonogenic 세포 죽음 프로필, 우리의 그룹에 의해 여러 연구에 따라의 초기 심사에 가장 유용할 것 이다 시간 지점으로 방사선 조사 후 72 h를 사용 하 고 다른 설명 다음과 같습니다1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-레이-유도 된 apoptosis 단단한 종양에서 주로 설립 셀에 발생 하는 방사선 조사 후 몇 일. (두 번째 또는 세 번째에서 가장 눈에 띄게 발생 하는 암 세포에 mitotic 재앙 ii) X-레이-유도 방사선에 의해 유도 된 임시 세포 주기 검거에서 출시 후 유사 분열. 릴리스는 일반적으로 다음, 방사선 조사 후 약 24 시간 발생 반복된 mitoses 약 24 h. (iii)의 간격에 의해 X-레이-유도 세포 노화 된다 분명 후 셀 라인에 의존 간격: 2 일 후 일부 초기 사례 및 대부분의 셀 라인에 대 한 방사선 조사 후 7 일에 대 한 조사. 취득 후 clonogenic 셀의 전반적인 그림 죽음 프로필 초기 심사, 시간 과정 실험 clonogenic 세포 죽음의 상태 또는 특정 셀 라인의 각 모드에 대 한 피크 타임의 자세한 설명을 제공할 것입니다 이자4.
그 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 방사선 민감도 평가 대 한 표준 메서드는 주목 한다. Apoptosis와 mitotic 재앙만 시간 지속. 따라서, 주어진된 시간 지점에 대 한 분석 결과 얼룩 DAPI apoptosis와 평가의 시간 지점에 mitotic 재앙을 감지 합니다. 다른 한편으로, clonogenic 생존의 결과 포인트 apoptosis와 mitotic 재앙 발생 했다 잠복기 동안 일반적으로 방사선 조사 후 10-14 일의 총 금액을 포함 하는 주어진된 시간에 시험. Apoptosis와 mitotic 재앙, 노화 세포에서 다른 문화 접시;에 남아 그들은 방사선 조사 후 시간이 지남에 따라 점차적으로 축적. 따라서, 둘 다의 결과 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 반영 인큐베이션 기간 동안 발생 한 노화의 총 금액. 중요 한 것은, apoptosis, mitotic 혁명과 방사선에 의해 유도 된 노화의 비율이 다릅니다 널리 셀 선 및 방사선 복용량. 함께 찍은, 이론적으로, 한 시험의 결과 변환할 수 없습니다 그 다른 분석 결과에 직접.
DAPI 시험을 얼룩이 지는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, mitotic 재앙 세포 죽음의 다른 모드 인지 논란이 남아 있습니다. 방사선 생물학의 분야, mitotic 재앙은 clonogenic 세포 죽음1의 다른 장치에서 IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 간주 됩니다. 다른 한편으로, 다른 그 mitotic 재앙은 세포 죽음 그러나 apoptosis와 괴 사13,14를 포함 하 여 세포 죽음 앞에 오히려 프로세스의 고유 모드 논쟁. 따라서, apoptosis와 mitotic 재앙은 어느 정도 겹칠 수 있습니다. 둘째, 이전 연구는 세포 노화 일부 세포 치료 설정2에서 SAHF의 부재에서 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 각 clonogenic 셀을 위해 설계 된 현재, 다른 분석 실험에서 죽음 모드는 주어진된 실험의 결론의 견고성을 높이기 위해 사용 되어야 한다. 셋째, 시험을 얼룩이 DAPI apoptosis, mitotic 재앙, 세포 노화 (예, 괴 사 및 autophagy) 이외의 clonogenic 세포 죽음의 모드 평가 수 없습니다. 넷째, 분석 결과 종양 방사선 치료 반응의 예측으로 얼룩 DAPI 유틸리티 하지 병원에 해명 되었습니다. 이 관점에서 clonogenic 세포 죽음의 총 금액을 평가, clonogenic 생존 분석 결과 상관 관계 SF2, 셀 2 Gy와 반구의 살아남은 분수 간에 설정 된 때문에 시험을 얼룩이 DAPI에 우수한 X-레이, 그리고 방사선 치료15종양 응답. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 데이터 수집을 위한 clonogenic 생존 분석 결과 주로 전문성의 높은 학위와는 오랜 기간 (즉, 14 일)에 대 한 요구 사항으로 인해 병원에 널리 활용 되지가 주목 된다. 비교 함으로써, DAPI 얼룩 분석 결과 대 한 절차 간단 하 고 시간이 크게 단축, 약 3-4 일, 결과를 생성. DAPI 얼룩의 유틸리티방사선 치료 종양 응답의 예언자로 서 분석 결과 가까운 장래에 병원에서 테스트 됩니다.
요약 하자면, 분석 결과 얼룩 DAPI clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 세 가지 주요 모드를 동시에 평가 하는 비용 효율적인 단계 분석 결과 이다. 이 이렇게 쉽게 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 시간 포인트, clonogenic 세포 죽음의 모드에 있습니다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원에 대 한 부인 아키코 시바타를 감사합니다. 이 작품 최고의 졸업 학교, 무거운 이온 치료제와 공학에 글로벌 리더 양성을 위한 프로그램에 대 한 교육, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술에서 연구비 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
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