Summary
Forskning om joniserande strålning (IR)-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå effekterna av IR på maligna tumörer och normal vävnad. Här, vi beskriver en one-step analys för att bedöma den stora leveranssätt IR-inducerad clonogenic celldöd baserat på Morfologi av 4', 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI)-missfärgade kärnor visualiseras genom fluorescensmikroskopi.
Abstract
Forskning om joniserande strålning (IR)-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå effekten av IR på maligna tumörer och normal vävnad. Här beskriver vi en snabb och kostnadseffektiv one-step analysen för att samtidigt bedöma den stora leveranssätt clonogenic celldöd induceras av IR, dvs, apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras. Den här metoden är celler som odlas på ett täckglas bestrålas med röntgen och färgas med 4', 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI). Använda fluorescensmikroskopi, identifieras apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras utifrån de karakteristiska morfologier av DAPI-färgade atomkärnor. Apoptos bestäms av förekomsten av apoptotiska kroppar (dvs, kondenserad och fragmenterade kärnor). Mitotisk katastrof bestäms av förekomsten av atomkärnor som uppvisar två eller flera separata lober och mikrokärnor. Cellulärt åldrande bestäms av förekomsten av åldras-associerad heterochromatic foci (dvsnuclear DNA som innehåller 30-50 ljusa, tät foci). Detta tillvägagångssätt gör att försöksledaren att enkelt skärmen för clonogenic cell death lägen med olika cellinjer, behandling inställningar eller tidpunkter, med målet att klarlägga mekanismerna för celldöd i målceller och villkor av intresse.
Introduction
Joniserande strålning (IR) inducerar flera lägen av clonogenic celldöd. Forskning om IR-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå toxicitet av IR för normala vävnader, samt för att utveckla metoder för att öka cancer strålbehandling behandlingseffekt. Apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras är den stora leveranssätt clonogenic celldöd induceras av IR1. Apoptos är en reglerad celldöd som initieras av DNA skada1. Mitotisk katastrof är celldöd som uppstår p.g.a. avvikande Mitos följd oreparerade DNA dubbel-strand raster1. Cellulära åldras definieras som ett tillstånd av irreversibel cell tillväxt gripandet2; Observera att cellulära åldras inte är celldöd per se, men det är ett clonogenic celldöd eftersom det avskaffar den senescent cellen clonogenic överlevnad.
Olika cellbaserade analyser har utvecklats för att individuellt bedöma apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras. Apoptos kan bedömas genom terminal deoxynucleotidyl transferas dUTP nick-slutet märkning (TUNEL) färgning, annexin V färgning, DNA-fragmentering analyser och sub-G1 cellcykeln fas bestämning av flöde flödescytometri1. Mitotisk katastrof kan bedömas genom immunofluorescens färgning för mitotiska markörer, inklusive MPM2, TUNEL färgning och elektronmikroskopi1. Cellulära åldras kan bedömas av åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) färgning, tillväxt-gripande analyser och elektronmikroskopi1. Ännu viktigare, det dominerande läget clonogenic celldöd skiljer sig bland cellinjer och behandling inställningar3,4. Därför, för att belysa övergripande profilen clonogenic celldöd för en viss experimentella inställning, flera analyser som omfattar alla dessa lägen dödens måste utföras tillsammans, vilket är labor - och kostnadsintensiv.
I den här artikeln beskriver vi en snabb och kostnadseffektiv one-step analysen för att samtidigt bedöma apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras induceras av IR3,4. Den här metoden är celler som odlas på ett täckglas bestrålas med röntgen och färgas med 4', 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI). Använda fluorescensmikroskopi, identifieras apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras varje utifrån de respektive karakteristiska morfologier av DAPI-färgade atomkärnor. Denna strategi kommer att vara användbart för program inklusive screening för clonogenic cell death profiler i olika cellinjer, behandling inställningar och tidpunkter, med målet att undersöka mekanismerna för celldöd i målceller och villkoren för intresse.
Protocol
1. beredning av material
- autoklav täckglas.
- Placera täckglas i en glasbägare.
- Täcker glasbägaren med folie.
- Autoklav vid 121 ° C vid 15 psi för 20 min.
- Torr vid 50 ° C. förvaras vid rumstemperatur i en kultur huva.
- Förbereda fixering lösning: 3% PARAFORMALDEHYD + 2% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Till en 1000 mL glasflaska, lägga till 700 mL PBS och 30 g PARAFORMALDEHYD.
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är frätande, Använd lämpliga skyddshandskar. - Lös PARAFORMALDEHYD helt genom uppvärmning till 80 ° C med en mikrovågsugn.
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD ångorna är giftiga, bära en mask. - Lämnar i rumstemperatur över natten.
- Lägga till 20 g sackaros.
- Lägg till PBS att göra den totala volymen 1 L.
- Alikvot i 50 mL tuber. Fixering lösning kan lagras i 3 år vid-20 ° C eller 3 månader vid 4 ° C.
- Till en 1000 mL glasflaska, lägga till 700 mL PBS och 30 g PARAFORMALDEHYD.
2. Beredning av cellodling
Obs: dessa bör utföras i en kultur huva.
- Kultur och passage U2OS mänskliga osteosarkom celler att upprätthålla logaritmisk tillväxt 5.
Obs: Andra celltyper kan användas efter bestämning av optimala bestrålning dosen. - Torka en skalpell med pappershanddukar fuktade med 70% etanol. Med hjälp av skalpell, placera ett täckglas på en 35 mm cell kultur maträtt (hädanefter bara kallad " skålen ").
Anmärkning: Antalet täckglas i en maträtt kan ökas enligt den experimentella design (se diskussion). - Add 1 mL kultur media: DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum.
Obs: Andra medier kan användas enligt den valda celltypen. - Torka pincett med pappershanddukar fuktade med 70% etanol. Med hjälp av tången, håll försiktigt i mitten av täckglaset. Aspirera kultur media från skålen helt, samtidigt som en spärr på täckglas.
Obs: detta steg främjar immobilisering av cover slip till skålen. - Lossa fastsittande odlade celler använder trypsin 5.
- Aspirera kultur media från skålen.
- Tillsätt 1 mL PBS och skaka skålen försiktigt.
- Aspirera PBS från skålen.
- Lägga i skålen 1 mL trypsin [0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA].
- Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C i en atmosfär som innehåller 5% CO 2.
- Lägga till 9 mL odlingssubstrat till skålen.
- Använder en 1000 μl mikropipett, Förbered en singel-cellsuspension.
- Räkna cellerna 5.
- i en 1,5 mL tub, lägga till 0,9 mL cellsuspension och 0,1 mL 0,4% Trypan blå lösning.
- Gäller 10 μL till en hemocytometer.
- Undersöka antalet ofärgade (dvs live) celler under en inverterad-fas Mikroskop.
- i en 15 mL tub, Förbered 3 mL cellsuspension i odlingsmedier med en täthet av 0,5 x 10 5 celler/mL.
Obs: Cell densiteten kan modifieras enligt experimentella behöver (se diskussionen). - Försiktigt och tillsätt 2 mL av cellsuspensionen till skålen.
- Inkubera över natten vid 37 ° C i en atmosfär som innehåller 5% CO 2.
3. Bestrålning
försiktighet: hantera de röntgen irradiator noggrant enligt tillverkaren ' anvisningar.
- Granska cellerna under en inverterad-fas Mikroskop. Bekräfta att cellerna är knutna till täckglaset och alive.
- Bestråla skålen med 6 Gy röntgen (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Inkubera under 72 timmar vid 37 ° C i en atmosfär som innehåller 5% CO 2.
Obs: Inkubationstiden kan modifieras enligt den experimentella design (se diskussion).
4. Fixering
- aspirera kultur media från skålen.
- Med sax, skär spetsen av en 1000 μl mikropipett spets 5 mm från slutet.
Obs: Skär spetsen hjälper till att jämnt applicera fixering lösningen. - Med skuren spets, tillsätt 1 mL fixering lösning (bereddes i steg 1.2) till skålen från skålen sidovägg.
Obs: Detta steg är känsliga och bör därför utföras utan att ändra mikropipett tips när du hanterar flera prover. Tillämpningen av fixering lösning direkt till botten av skålen kan skada cellerna. - Placera skålen i en fyrkantig kultur maträtt. Skaka fyrkantig kultur skålen försiktigt för att fördela den fixering lösning över täckglaset jämnt.
- Inkubera i 10 min i rumstemperatur.
- Aspirera fixering lösning från skålen.
- Och tillsätt 2 mL PBS till skålen från skålen sidovägg.
Obs: Tillämpning av PBS direkt till botten av skålen kan skada cellerna. - Aspirera PBS från skålen.
- Upprepa steg 4.7 och 4.8 dubbelt.
Obs: Skålen kan förvaras i 1 vecka vid 4 ° C med de täckglas som badade i 2 mL PBS.
5. DAPI färgning
- en bild glas, tillämpas 5 μL 1 μg/mL DAPI färgning reagens.
Obs: Den DAPI färgning reagens är stabil i 6 månader om den förvaras skyddat från ljus vid eller under -20 ° C. - Med en skalpell bort skålen på täckglas.
- Tappa upp överflödig PBS på cover slip genom att röra vid kanten av täckglaset med en pappershandduk.
- Montera täckglas uppochner på släpp av DAPI färgning reagens på bilden glaset så att cellerna exponeras för DAPI färgning reagens.
Obs: Detta steg är tidskänsliga. Torkning av DAPI färgning reagens kan leda till suboptimalt färgning. - Proverna kan lagras för 1 år på -20 ° C.
6. Bild förvärv
- Granska provet på fluorescens Mikroskop. Atomkärnor visualiseras med filtret DAPI.
Obs: Antingen en 20 X eller en 60 X olja lins kan användas, enligt forskaren ' s intresse. När du använder en 60 X olja lins, tillsätt en droppe olja på täckglaset. Var noga med att proverna inte rör linsen; annars linsen kan vara skadad. - Förvärva bilder av atomkärnor med en CCD-kamera och digital bild förvärv programvara med följande inställningar och parametrar: DAPI filter, enskiktslager bilder, få 1 X och automatisk exponering.
- Finish bild förvärv: torka 20 X objektiv med pappershanddukar fuktade med lins renare. Torka 60 X olja linsen med hushållspapper som fuktats med kloroform.
7. Utvärdering av Clonogenic Cell Death-läge
- i slumpmässigt utvalda bilder, räkna antalet kärnor som uppfyller kriterierna för apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras tills det totala antalet inventerade atomkärnor når 300. Genomföra detta steg i tre exemplar för varje experimentella inställning.
- Kriterier för apoptos: närvaro av apoptotiska kroppar (dvs, kondenserad och fragmenterade kärnor) 6 , 7.
- Kriterier för mitotisk katastrof: närvaro av atomkärnor som visar två eller flera distinkta loberna eller micronuclEI 8 , 9 , 10.
- Kriterier för cellulära åldras: förekomsten av åldras-associerad heterochromatic foci (SAHF) (dvs nuclear DNA som innehåller 30-50 ljusa, tät foci) 2 , 11.
Representative Results
Som ett exempel, var U2OS mänskliga osteosarkom celler behandlas med 6 Gy röntgen, inkuberas i 72 h och underkastas den DAPI färgning assay enligt protokollet. Figur 1 visar zoomade bilder för de typiska nukleära morfologier associerade med apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras erhålls med en 60 × olja lins. Se steg 7.1.1-7.1.3 för de karakteristiska morfologier för varje clonogenic celldöd. Figur 2 visar översiktsbilder av atomkärnor som erhållits med en 20 X lins. Bestrålning med 6 Gy röntgen inducerad mitotisk katastrof ofta, apoptos mindre ofta och cellulära åldras sällan. På detta sätt gör undersökning på ett låg-förstoring fält att gripa ett ögonkast helhetsbilden av clonogenic cell death profilen i en viss experimentella inställning. Figur 3 visar en grafisk representation av de kvantifierade uppgifter.
Figur 1: zoomade bilder av DAPI-färgade kärnor visar typiska morfologier apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras. U2OS celler bestrålades med 6 Gy röntgen. Efter 72 h, var cellerna fixeras och färgas med DAPI. Nukleär bilder förvärvades med en 60 X olja linsen. Skalstapeln = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: översikt översiktsbilder av DAPI-färgade kärnor av celler behandlas med röntgenstrålning. U2OS celler var bestrålas med 6 Gy röntgen eller mock-bestrålade. Efter 72 h, var cellerna fixeras och färgas med DAPI. Bilder av atomkärnor förvärvades med en 20 X objektiv. Cirklar, apoptos; pilar, mitotisk katastrof. Skalstapeln = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantifierade uppgifter för apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras inducerad i celler behandlas med röntgenstrålning. U2OS celler var bestrålas med 6 Gy röntgen eller mock-bestrålade. Efter 72 h, var cellerna fixeras och färgas med DAPI. Bilder av atomkärnor förvärvades med en 20 X objektiv. Från slumpmässiga fält utvärderades totalt 300 kärnor för apoptos (Ap), mitotisk katastrof (MC) och cellulära åldras (Sns). Utvärderingarna utfördes i tre exemplar. Genomsnittliga värden visas och felstaplar visar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kritiska steg i protokollet är följande. Det första bör celler odlas på kultur skålen som en enskiktslager eftersom genomför en morfologisk bedömning av DAPI-färgade kärnor är svårt för multilayered celler. För detta ändamål, i steg 2,9, rekommenderas noggrann överföring av kultur skålen till en inkubator. skakningar i kultur skålen genererar en virvel av suspenderade celler som leder till koncentrationen av celler i mitten av kultur skålen. Dessutom bör overconfluence som leder till multilayered celler undvikas. För detta ändamål, i steg 2,7, kan antalet celler seedade på kultur skålen ändras baserat på befolkningen fördubbling tid och intervallet mellan bestrålning och fixering. Ett sammanflöde av ungefärligt 80 vid tidpunkten för fixering rekommenderas. Andra, hastighet är viktigt i fixering och DAPI färgning (dvs, steg 4 och 5). Inter prov inkonsekvens när det gäller tiden för dessa steg kan leda till heterogenitet i DAPI signalintensitet i kärnor, som skulle dölja morfologiska bedömningen.
Antalet täckglas i en enda kultur maträtt kan ökas i steg 2.2, högst fyra täckglas kan placeras i en 35 mm maträtt, och numret kan ökas ytterligare med större rätter. Placera flera täckglas i varje kultur rätt kan den effektiva driften av tid kursen bedömning för en viss behandling (dvs, omslaget följesedlar kan samlas in från en kultur maträtt en på flera punkter av intresse).
I steg 3,2, kan bestrålning dosen modifieras enligt forskarnas intresse. Tillämpningen av en enhetlig dos på flera cellinjer möjliggör jämförelse av känsligheten för varje läge clonogenic celldöd bland cellinjer. Däremot, möjliggör användning av iso-clonogenic överlevnad doser för varje cellinje jämförelse av clonogenic cell death profiler bland cellinjer. Iso-clonogenic överlevnad dosen kan bestämmas av de clonogenic överlevnad assay12. Värdet10 D, den dos som ger 10% clonogenic överlevnad, är en gemensam slutpunkt för iso-clonogenic överlevnad dos.
I steg 3.3, kan tiden från bestrålning till fixering modifieras enligt forskarnas intresse. Detta är viktigt eftersom den topp tid för IR-inducerad apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras varierar cellinje och behandling. I denna artikel, vi använde 72 h efter bestrålning som den tidpunkt som skulle vara mest användbar för den inledande screeningen av clonogenic cell death profiler, baserat på flera studier av vår grupp och andra beskrivs enligt följande1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-stråle-inducerad apoptos i celler etablerat från solida tumörer oftast inträffar några dagar efter bestrålning. (ii) X-stråle-inducerad mitotisk katastrof i cancerceller uppstår mest framträdande på den andra eller tredje Mitos efter frisläppandet från den tillfälliga cellcykelarrest induceras av bestrålning. Release inträffar vanligtvis cirka 24 h efter bestrålning, följt av upprepade mitoser med intervall på cirka 24 h. (iii) X-ray – inducerad cellulära åldras blir uppenbart efter ett intervall som är beroende av raden för cellen i fråga: 2 dagar efter bestrålning för vissa tidiga fall och 7 dagar efter bestrålning för de flesta cellinjer. Efter att få en helhetsbild av cellen clonogenic död profiler från den inledande screeningen, tid kursen experiment kommer att ge en mer detaljerad klargörande av den topp tid för varje clonogenic celldöd i specifika cellinje eller skick ränta4.
Det bör noteras att den DAPI färgning assay och clonogenic överlevnad analysen, en guldmyntfot metod för strålning känslighet bedömning, inte är utbytbara. Apoptos och mitotisk katastrof bara pågå i timmar. Således upptäcker den DAPI färgning assay för en given tidpunkt apoptos och mitotisk katastrof som inträffar vid tidpunkten för bedömningen. Resultaten av clonogenic överlevnad assay däremot, vid en given tidpunkt punkt innehålla det totala beloppet av apoptos och mitotisk katastrof som hade inträffat under inkubationstiden för vanligtvis 10-14 dagar efter bestrålning. Olika från apoptos och mitotisk katastrof, senescent celler kvar på kultur skålen; de ackumuleras successivt över tiden efter bestrålning. Därför resultaten från både den DAPI färgning assay och clonogenic överlevnad analysen speglar den totala mängden åldras som inträffade under inkubationstiden. Ännu viktigare, andelen av apoptos, mitotisk katastrof och åldras induceras av bestrålning varierar kraftigt enligt cell linje och bestrålning dos. Sammantaget teoretiskt, resultaten av en analys inte kan översättas direkt till de andra analysens.
Den DAPI färgning assay har några begränsningar. Först, det fortfarande kontroversiellt huruvida mitotisk katastrof är en distinkt läge av celldöd. I fältet i strålningsbiologi anses mitotisk katastrof en stor läge av IR-inducerad celldöd som skiljer sig från andra mekanismer clonogenic cell death1. Däremot, hävdar andra att mitotisk katastrof inte är en distinkt läge av celldöd utan snarare en process som föregår celldöd inklusive apoptos och nekros13,14. Således, apoptos och mitotisk katastrof kan överlappa i viss utsträckning. Andra, tidigare studier tyder på att cellulära åldras kan uppstå i avsaknad av SAHF i vissa cellinjer och behandling inställningar2. På nuvarande, andra analyser som utformats speciellt för varje clonogenic cell bör death-läge användas att öka robustheten i slutsatserna från ett visst experiment. För det tredje kan inte den DAPI färgning assay bedöma lägen clonogenic celldöd än apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras (t.ex., nekros och autofagi). För det fjärde har nyttan av den DAPI färgning assay som en prediktor för tumör svar på strålbehandling inte klargjorts i kliniken. Från denna synpunkt är clonogenic överlevnad analysen, som bedömer den totala mängden clonogenic celldöd, överlägsen den DAPI färgning assay eftersom ett samband har påvisats mellan SF2, den överlevande fraktionen av celler som bestrålas med 2 Gy Röntgen, och tumör svar på strålbehandling15. Det är dock anmärkningsvärt att clonogenic överlevnad analysen inte används allmänt i kliniken, främst på grund av kravet på en hög grad av kompetens och en lång tidsperiod (dvs.14 dagar) för datainsamling. I jämförelse, förfarandet för den DAPI färgning assay är enklare och tar betydligt kortare tid, cirka 3-4 dagar, för att generera resultat. Nyttan av DAPI färgningenanalysen som en prediktor för tumör svar på strålbehandling kommer att testas i kliniken inom en snar framtid.
Sammanfattningsvis är det DAPI färgning assay en kostnadseffektiv one-step analys att samtidigt bedöma de tre stora lägen av IR-inducerad clonogenic celldöd. Detta tillvägagångssätt gör att man kan enkelt skärm för lägena av clonogenic celldöd för olika cellinjer, behandling inställningar och tidpunkter, med målet att klarlägga mekanismerna för celldöd i målceller och villkor av intresse.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar fru Akiko Shibata för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av Grants-in-Aid från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan för program för ledande forskarskolor, odla globala ledare inom tunga Ion Therapeutics och teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
