Summary
Denne artikel beskriver en række teknikker i lys og elektronmikroskopi at studere den indre og ydre øje anatomi af insekter. Disse omfatter adskillige traditionelle teknikker optimeret for arbejde med ant øjne, detaljeret fejlfinding, og forslag til optimering til forskellige enheder og områder af interesse.
Abstract
Denne artikel beskriver en række teknikker i lysmikroskopi (LM) og elektronmikroskopi (EM), som kan bruges til at studere den indre og ydre øje anatomi af insekter. Disse omfatter traditionelle histologiske teknikker optimeret for arbejde med ant øjne og tilpasset til at arbejde sammen med andre teknikker såsom transmissions elektronmikroskopi (TEM) og scanning elektronmikroskopi (SEM). Disse teknikker, kan selv enormt nyttigt, være vanskeligt for den uerfarne microscopist, så har lagt stor vægt i denne artikel om fejlfinding og optimering for forskellige prøver. Vi informerer om billedbehandling teknikker for hele modellen (foto-mikroskopi og SEM) og diskutere deres fordele og ulemper. Vi fremhæve den teknik, der anvendes ved fastsættelsen af linse diameter for hele øjet og diskutere nye teknikker til forbedring. Endelig vil vi diskutere teknikker involveret i forberede prøverne til LM og TEM, skæring, farvning og imaging disse prøver. Vi diskutere de forhindringer, som man kan komme på tværs af Hvornår forberede prøver og hvordan man bedst kan navigere rundt om dem.
Introduction
Vision er en vigtig sensoriske modalitet for de fleste dyr. Vision er især vigtigt i forbindelse med navigation for indkredsning mål, etablere og tilslutte sig ruter og opnå kompas oplysninger1,2. Insekter opdage visuel information ved hjælp af et par sammensatte øjne, og i nogle tilfælde, en til tre dorsalt placeret enkle øjne kaldet ocelli3,4,5.
Øjnene af myrer er af særlig interesse, fordi mens myrer er vidunderligt mangfoldig, de spare nogle Nøglekarakteristika på tværs af arter. Trods dramatisk variation i anatomi, størrelse og økologi, langt de fleste arter er eusocial og lever i kolonier; som et resultat, forskellige arter står over for lignende visuelle udfordringer navigere frem og tilbage mellem et centralt sted og ressourcer. På tværs af myrer kan den samme grundlæggende øje bauplan observeres i dyr spænder fra 0,5-26 mm i kropslængde, fra udelukkende temperaturprofil strengt natlig arter, og langsom gåafstand underjordiske leaping visuelle rovdyr6,7, 8,9,10. Alle disse overvældende forskelle i økologi og adfærd giver anledning til utallige permutationer af de samme grundlæggende øje strukturer der passer til forskellige miljøer, livsstil og krop-størrelser11,12. Som en konsekvens, giver studerer den visuelle økologi af myrer en veritabel guldgrube af muligheder til den beslutsomme investigator.
Forstå det visuelle system af insekter er afgørende for at få et indblik i deres adfærdsmæssige kapaciteter. Det fremgår af Integrativ undersøgelser, som pænt kombinerer anatomi med økologi og adfærd til en stor succes i nogle insekt grupper (f.eks.referencer13,14,15,16, 17). om ant navigation og ant adfærd i almindelighed har været ganske vellykket, har lagt meget lidt vægt på ant vision uden for et par udvalgte arter. Her vil vi redegøre for de teknikker, der er involveret i efterforskningen øje design af myrer. Mens vi vil fokusere på myrer, kan disse teknikker anvendes, med mindre ændringer til andre insekter også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøvepræparation
Bemærk: Det er nødvendigt at først forstå den relative placering af den sammensatte øje og ocelli til hinanden og på hovedet. Dette kan opnås ved at erhverve billeder af den dorsale udsigt over hovedet. For dette anbefaler vi forarbejdning prøver enten til fotomikrografi eller ved hjælp af SEM teknikker. Nedenfor er trin involveret i begge processer.
-
Prøvetagning
- Indsamle og opbevare prøver direkte i 70% ethanol. Indsamle forskellige kaster når det er muligt.
- Etiket prøver med tid, dato og sted samt andre relevante observationer (fxindsamles mens fouragering, parring sammenlægning, reden inde i en kvist, osv.)
- Indsamle nok prøver at have flere gentagelser i hver behandling.
-
Fotomikrografi og Z-stabling
- Luft tørre prøver og montere dem på trekantede pointkort, bruge vandopløselig lim, og derefter på et insekt pin. For detaljer, se reference18.
- Billedet ved hjælp af en høj forstørrelse stereomikroskop med en Z-stepper motor og en farvekamera.
- Brug en diffuser skal have ensartet belysning til prøver.
- Fange billeder med forskellige fokale planer og gemme billeder i et arkivformat (såsom tiff) og fokus stack dem ved hjælp af kommercielt tilgængelige software.
-
Scanning elektron micrographs
Bemærk: Rengøre alle værktøjer og arbejdsflader med ethanol til at undgå forurening af prøvemateriale med støv og andre partikler.- Dehydrere modellerne i ethanol natten over og lufttørre i en petriskål.
- Brug et skarpt barberblad til at skille hovedet fra resten af kroppen.
- Mount hovedet på den krævede betragtningsvinkel (fxdorsale opad) på aluminium stubs ved hjælp af ledende carbon bånd eller faner. Skære kulstof tape i tynde strimler og fold det til at understøtte den hoved kapsel.
- Brug en sputter coater for at anvende guld på overfladen af modellen for 2 min på 20 mA med en roterende scene. Tid og strøm kan skal justeres afhængigt af instrumentet.
- Overføre prøver til en ny aluminium stub med friske carbon bånd eller faner.
Bemærk: Den ubestrøget carbon vil give en sort baggrund men overførsel enheder kan skade den guld belægning. - Kontroller, at modellen orientering er stadig er korrekt ved hjælp af en dissekere mikroskop og justere efter behov med et par fine pincet eller lignende værktøj. Passe på ikke for at ridse den guld belægning; håndtag så lidt som muligt.
- Indlæse prøver med SEM stub indehaveren, at gøre opmærksom på placeringen af stubbe og prøver i forhold til hinanden.
Bemærk: Nogle SEMs er udstyret med en etape kamera, men mange er ikke og det kan være svært at finde små prøver på høj forstørrelse. - Image modellerne. Bruge en accelererende lavspændings for at undgå opladning og en lille blænde for god dybdeskarphed.
Bemærk: Indstillingerne er bedst optimeret i samråd med en tekniker med speciale i den særlige måleapparatet.
2. kvantificering Facet numre og diametre
-
Hornhinden reproduktioner
- Brug myrer konserveret i ethanol eller monteret på en PIN-kode til dette formål (trin 1.1.1).
- Montere dyret på en insekt pin eller modellervoks. Hvis hovedet er relativt store, kan de resterende dele af kroppen fjernes.
- Brug et insekt pin eller et fint tandstikker til at afhente en lille dråbe af fast-tørring farveløs neglelak og hurtigt sprede det over øjet. Sikre pinkoden ikke ridse øjet. Neglelak bør dække hele øjet og nogle af de omkringliggende hoved kapsel.
Bemærk: Det er vigtigt, at neglelak er af nogenlunde ensartet tykkelse på tværs af øjet. - Forlade neglelak til at angive ved stuetemperatur.
- Når det er fuldt ud indstillet, skal du bruge en fin insekt pin til forsigtigt løfte replikaen fra hoved kapslen omkring øjet.
- Bruge et fint par af ren pincet til at løfte replikaen, forstå del af den replika, der dækker hovedet og ikke øjet.
- Sikre kendskab til orientering af øjet: anterior, posterior, dorsal og ventral regionen.
- Sted replika i et glas dias. Bruge et barberblad til at trimme replikaen ved omhyggeligt at fjerne overskydende materiale omkring øjet. Brug en nål eller et par pincet til at forhindre replikaen i at flytte.
- Hvis øjet er meget konvekse, skal du bruge et barberblad til 3-4 fine delvis radiale incisioner rundt i kanten til at hjælpe 'flade' replikaen. Hvis øjet er relativt flad, er der ingen grund til at gøre sådanne indsnit.
- Placer en cover slip forsigtigt på øjet replika, at sikre, at orientering af replikasættet er kendt. Anvend ikke pres, som dette kan eliminere den hornhinde indtryk på neglelak.
- Forsegle coverslip bruger meget lidt neglelak på fire hjørner. Hvis neglelak flyder mellem cover slip og glas lysbilleder, vil det skade replikaen.
- Billede slide på en sammensat mikroskop.
Bemærk: Hvis kun nogle facetter er i fokus, så dette antyder øje replika ikke samkopieres nok. Slette og starte igen fra trin 2.1.3. - Importere billedet til frit tilgængelige programmer såsom ImageJ/Fiji hvor antallet af ommatidia og størrelsen af hver ommatidia kan måles.
Bemærk: Denne metode kan bruges til at forberede kopier af ocelli, også. Da det er en enkelt linse, anbefales det, at holde alle ocelli sammen i én replika.
3. analyse af strukturen i øjet
Bemærk: For at studere anatomi i øjet kræver i de fleste tilfælde to supplerende teknikker til LM og TEM. De første forarbejdningsled kræver lignende teknikker til både LM og TEM. Forskellen skyldes den skæring fase og fremefter. Behandling af prøver kræver brug af farlige kemikalier, som skal håndteres med omhu og kasseret ansvarligt. Bruge personlige værnemidler, arbejde i et stinkskab, altid læse sikkerhed data sheets(SDS) og foretage risikovurderinger før du starter.
- Dissektion
- Anaesthetize enheder, ved afkøling eller ved udsættelse for gasformige CO2.
- CO2 anæstesi er meget hurtig (generelt under 1 min) og pleje bør træffes for at undgå overeksponering, da dette kan resultere i død af modellen. Hvis ved hjælp af tøris pellets (solid CO2) undgå direkte kontakt med enheder som dette kan medføre kolde forbrændinger.
- Kolde anæstesi er langsommere; 4 ° C er tilstrækkelig, og koldere temperaturer anbefales ikke. Etablere en passende afkøling tid for arter. Store eller kolde resistente myrer som bull myrer kan kræve > 10 min at blive fuldt immobiliseret, mens mindre arter kan nøjes med 1-2 min. overdrevne køling vil dræbe modellen (undgå direkte kontakt med is). Prøver skal helst opbevares i beholdere, små, med proplåg skum, plast og placeret i en frost, hvor de kan overholdes ikke i en elektrisk køleskab eller fryser.
- Placere modellen på en petriskål, og Juster til visning under et dissekere mikroskop. Arbejde hurtigt er vigtigt at bevare anæstesi og undgå degeneration af væv, når indsnit er lavet (dette kan ske inden for få sekunder).
- Fjerne antenner med pincet. Hvis arbejder med en stikkende insekter, er det tilrådeligt at amputere gaster først for at undgå at blive stukket.
- Fjerne de mund dele ved hjælp af et skarpt barberblad; pincet kan bruges til at holde modellen. Skære igennem den forreste del af øjet (store eksemplarer) eller så tæt på øjnene som muligt (små enheder) uden tugging på hjernen som dette kan rive ud af nethinden.
- Forbered dig på at åbne hoved kapslen. Vinkel modellen, så den første indsnit peger op; Dette kan gøres enten dissekere mikroskopet mens du holder modellen i pincet eller under visuel kontrol mens du holder modellen mellem tommel- og forgrunden fingeren.
- Lave et tværgående snit gennem hovedet for at fjerne den ventrale del af hovedet; en del af den ventrale øjet kan fjernes i stor arter at forbedre fiksering og infiltration. Hovedet bør stadig være knyttet til kroppen på dette punkt.
- Sever hoved kapslen fra kroppen ved at lave en koronale snit lige posteriort for sammensatte øje.
- Placer de dissekerede hoved kapsel med renters øjne i is koldt fiksativ: 2,5% glutaraldehyd og 2% PARAFORMALDEHYD i fosfat buffer (pH 7,2-7,5).
Forsigtig: Fiksativ er ætsende og giftige; bær passende beskyttelse og arbejde i et stinkskab.
Bemærk: Det er vigtigt at arbejde hurtigt for at anholde neurale væv degeneration. Dissektion bør være afsluttet i 2 min eller mindre (effektiv dissektion kan kræve lidt øvelse).
Bemærk: Hvis øjet må tilpasses til lyse eller mørke betingelser, derefter først udsætte dyr for den nødvendige lys betingelse for et par timer. Udføre dissektioner i de respektive lysforhold. Dissektioner kan udføres under rødt lys til at simulere mørket.
- Anaesthetize enheder, ved afkøling eller ved udsættelse for gasformige CO2.
- Modellen behandling
- Holde modellerne i fiksativ ved stuetemperatur med motion på en orbitalryster for 2 h. store eksemplarer kan kræve længere optagelse gange.
- Fjerne fiksativ og bortskaffe det korrekt. Vask modellerne i stuetemperatur fosfat buffer (3 gange, 5 min hver) på shaker.
Bemærk: Fosfat-buffer består af 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4og 0.244 g KH2PO4 i 1 L destilleret H2O (pH 7,2). - Fjerner fosfat buffer og tilføje 2% OsO4. Placer modellen krukken på shaker i stinkskab for 1-2 h. Dette er en post fiksering trin til fix fedtstoffer og også give kontrast til TEM.
Bemærk: Osmium fiksering gange er underlagt modellen størrelse; Beregn 1 h af fiksering pr. 1 mm3som en grov tommelfingerregel. - Osmium-opløsning og bortskaffe det korrekt. Vask modellerne i stuetemperatur buffer (3 gange, 5 min hver) på shaker.
- Dehydrere enhederne ved at placere dem i stigende koncentrationer ethanol eller acetone; for eksempel, 50, 70, 80, og 95% for 10 min hver og endelig 100% (2 gange, 15 min hver). Placer enhederne på shaker mellem løsning ændringer.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, prøver kan opbevares i 70% ethanol natten over. - Dræn ethanol og tilføje 100% acetone. Overlade det til 20 min på shaker (Spring dette trin hvis tørring det i acetone). Erstatte med frisk acetone og overlade det til en yderligere 20 min.
- Infiltrere væv med harpiks ved hjælp af følgende koefficienter af acetone til harpiks: 2:1 (3 h), 1:1 (natten), 1:2 (4 h) og ren harpiks (natten). På hvert trin forlade prøver på shaker inde i stinkskab og cap beholderen for alle, men de sidste to trin.
Bemærk: Harpiks er for tyktflydende aflades, så prøver skal flyttes til en ny engangs beholder ved hvert trin. - Forberede blokke til at montere prøverne. Blokke kan være custom lavet ved at skære akrylglas i små rektangulære blokke (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Blokke kan også gøres ved at hælde epoxyharpiks (der er mange kommercielle kits tilgængelig) i en silicium støber og derefter helbrede det i ovnen i 12-14 timer ved 60 ° C.
Forsigtig: Uhærdet (flydende) harpiks er kræftfremkaldende og skal returneres til ovnen indtil fuldt hærdet. - Sted blok lodret i formen. Omhyggeligt tage prøver fra den flydende harpiks, tillade overskydende resin til afløb og placere modellen på toppen af blokken. En lille mængde af yderligere resin kan bruges til at binde modellen til blokken.
- Mærke blokken. Udskrive papiretiketter og integrere den i blokken eller vedhæfte det til en blok ansigt.
- Holde formen med indlejrede blokke i ovnen i 12-14 h ved 60 ° C.
- Gemme modellen blokken i en ren kuvert. Dette kan være opbevaret på denne måde i flere måneder til år.
- Forlade de anvendte beholdere, beskidte handsker og andre kontaminerede materialer i stinkskab tillade acetone til at fordampe helt (minimum 12 h).
- Helbrede harpiks i ovnen før kassering engangs udstyr eller skrabe harpiks fra andre elementer såsom pincet.
- Skæring
- Observere blok under dissekere mikroskop til at sikre, at modellen orientering er egnet til skæring flyet.
- Hvis retningen ikke er passende, bruge en guldsmed saven til at skære modellen og nyorientere ved hjælp af fragmenter af sæt harpiks og frisk harpiks til at re-sæde modellen. Hovedet kan også opdeles i to halvdele til afsnit to øjne separat. Helbrede harpiks igen før du fortsætter.
- Montere blokken på flytbare mikrotomen chuck. Fjerne chuck og pålægge indehaveren.
- Trim harpiks blok ved hjælp af et barberblad dissekere mikroskopet.
Forsigtig: Ikke gør dette når chuck er monteret på mikrotomen arm, da det kan bump armen og beskadige lejerne. - Remount chuck på mikrotomen arm og vinkel modellen.
- Montere kniven på indehaveren i den passende vinkel (0° for glasknive, se producentens vejledning til diamond knive).
Bemærk: Glasknive kan gøres billigt med et glas kniv maker men skal udskiftes med jævne mellemrum, så de mister deres kant; høj kvalitet diamant knive kan købes men er dyre, kræver særlig pleje, og er ikke egnet for begyndere. - Fyld kniv båd med destilleret vand ved hjælp af en sprøjte, der er udstyret med et filter (0,45 µm porestørrelse).
- Fylde båden indtil vandstanden når kanten af kniv; menisken kan være konvekse i andre områder af båden.
- Afløb båden, indtil menisken er meget lidt konkave men stadig når kanten af kniven. Niveauet for vandet kan justeres på ethvert tidspunkt, men altid væk fra kanten af kniven.
- Omhyggeligt bringe kniv mod modellen og Juster klodsen til kniven. Dette gøres bedst, langsomt, periodisk kontrol nærhed af kniven igennem okularet og fra siden.
Bemærk: Kontroller instrument håndbog for specifikke instruktioner som instrumenter varierer. - Indstillet snittykkelse på mikrotomen. At vælge den rigtige tykkelse vil være afhængig af model størrelse, region af interesse og slags kniv bliver brugt.
- Hvis bruger en glaskniven vælger en højere indstilling (fx, 4 µm), hvis en masse materiale skal skæres væk før nå område af interesse. Hvis der bruges en diamantkniven eller hvis modellen er meget små, 1-2 µm kan være mere hensigtsmæssigt.
- Begynde at "skære" (cranking mikrotomen hjulet) når kniven er tæt, men endnu ikke skære i modellen til at udføre den sidste del af metoden. Sektioner bør starte optræder inden for et par rotationer; Hvis ikke, stop og meget omhyggeligt tilnærme kniven lidt mere.
- Justerer afsnittet indsamling tykkelse (1 µm til semi-tynde sektioner) Hvornår nærmer sig det pågældende område.
- Indsamle alle sektioner ved hjælp af en øjenvipper værktøj.
Bemærk: Øjenvipper værktøjer kan gøres med en øjenvipper, monteret på en tynd stok med neglelak. - Hvis en masse materiale skal fjernes, tillade sektionerne for at akkumulere og fjerne massevis ved at fjerne kniven og skylle det med vand. Hvis bruger en glaskniven, kan dette være en passende tid til at skifte til en frisk sektion af kniven eller en ny kniv.
- Sted en serie af små dråber af destilleret vand på et dias ved hjælp af Pasteurs pipette eller ideelt set filteret udstyret sprøjte.
- Omhyggeligt flyde afsnittet indsamlet på øjenvipper på vanddråbe.
- Indsamle dele som denne, indtil det er passende at kontrollere dybden af skæring.
Bemærk: Selvom det kan være trættende, det er altid bedst at tjekke ofte. - Placer diasset på en kogeplade, sat til 60 ° C. Tillad alle vandet til at fordampe og afsnit at overholde diaset.
- Farvestof sektioner med toluidin blå for 10-60 s (farvning tid vil variere med snittykkelsen). Undvære farven med en sprøjte, der er udstyret med et filter (som ovenfor).
- Anbring en dråbe af farvestoffet den ene ende af diaset og sprede det med siden af nålen uden at røre eller skrabe sektionerne. Sted diaset på kogeplade for ca 10-20s.
- Skyl diasset ved at sprøjte det med destilleret vand i en vaskeflaske og placere den på varmepladen tørre det.
- Check under sammensat mikroskop og billed dem.
- Gentag indtil region af interesse er nået.
- For ultra-tynde sektioner: indstille skære tykkelse mellem 40-60 nm at indsamle TEM sektioner.
- Snit om 3-5 sektioner og check tykkelse ved hjælp af en indblanding farvekort. Sektioner bør afspejle lys grå set på en vinkel.
Bemærk: Chloroform dampe kan være pipetted over sektioner til at slappe af enhver folder. Dette er mest relevant for erfarne brugere, og nybegyndere behøver ikke bekymre dig. For meget chloroform udgivet for tæt til afsnittet kan beskadige sektioner. - Afhente en Formvar-belagt, kobber, slot gitter holdt med pincet med Formvar side op. Pas på ikke at punktere Formvar belægningen.
- Dyp gitteret i båden edgeways og fra afsnittene, så bringe gitter op parallelt med overfladen under afsnittene. Hvis det er nødvendigt bruge øjenvipper til at guide afsnittene over nettet.
- Forsigtigt dup omkring spidsen af pincet med filter papir til at opsuge vand fanget mellem armene. Hvis dette ikke sker, kan vand spænding træk nettet op mellem armene eller gøre det stick til den ene side. Dette kan medføre forurening eller mekaniske skader.
- Fjern forsigtigt overskydende vand fra nettet, selv af stående grid edgeways på filtrerpapir.
- Sted gitter i et gitter indehaveren.
- Gentag indtil nok sektioner er blevet indsamlet.
- Semi-tynde sektioner kan være afbildet direkte med et sammensat mikroskop udstyret med et kamera. Nedsænkning olie kan placeres direkte på afsnittene. Dias skal opbevares i et dias for at forhindre misfarvning.
- Farvning ultra-tynde sektion for TEM kontrast
Bemærk: Følgende trin skal udføres under dække som farvestoffer er lys og CO2 følsomme. Derudover EM farvestoffer bruge tungmetaller til at producere kontrast og er derfor farlige stoffer. Passende pleje skal tages, når du håndterer disse pletter.- Dække et par store petriskåle med aluminiumsfolie at blokere lys. Arbejde under disse for følgende trin. Delvist afdække dem for at give arbejdsplads men sted dækker tilbage på hurtigst muligt.
- Skær et stykke voks film og omhyggeligt sted fem dråber af 6% mættet uranyl acetat på det ved hjælp af Pasteurs pipette.
- For at forberede løsningen, blande 2 g uranyl acetat med 100 mL 50% methanol i destilleret vand, og opløsningen filtreres inden du bruger. Løsningen kan ikke lagres og stilles frisk hver gang19.
- Omhyggeligt afhente TEM gitre med pincet og balance på toppen af farvestof dråber med sektion side ned. Orlov i 25 min.
- Skyl gitre individuelt ved at dyppe dem hurtigt ind og ud af destilleret vand; fremskridt gennem fire forskellige hætteglas med destilleret vand.
- Placer fem dråber af bly citrat på en frisk stykke film. Arrangere et par NaOH pellets omkring farvestof dråber (dette absorberer atmosfærens CO2 for at undgå udfældning af bly karbonat).
- At gøre citratopløsning bly, forberede bi-destilleret vand af kogende destilleret vand til 0,5 h. Tillad vandet afkøles og i en sealable beholder, tilsættes 0,3 g bly citrat 100 mL bi-destilleret vand. Der tilsættes 1 mL 10 M NaOH, forsegles beholderen tæt, og ryst indtil opløst19.
- Placere gitrene på farvning af dråber, som beskrevet i 4.3 og dækning. Pletten i 5 min.
- Skyl i destilleret vand som før ved at dyppe gitre og ud af destilleret vand 20 gange. Fremskridt gennem tre fartøjer destilleret vand.
- Opsuge overskydende vand med filtrerpapir og tillade gitre til tørre i et gitter felt.
- Billedet i en TEM på lav accelererende spænding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder, der beskrives her aktiverer detaljeret undersøgelse af simpelt og sammensatte øjne af myrer. Imaging den dorsale udsigt over hovedet ved hjælp af Z-stakken fotomikrografi teknikker tillader en at få en oversigt over layout af det visuelle system (figur 1). Dette er en god forberedelse til dissektioner og til at bestemme den ønskede skæring vinkel. Denne teknik er også nyttigt for måltagning hoved bredde, øjet længde og ocellar linse diameter. SEM imaging giver også detaljerede oversigt billeder men giver mulighed for Derudover erhvervelse af høj forstørrelse og billeder i høj opløsning. Bestemte regioner af interesse i øjet kan blive grundigt undersøgt og variationer i linsen form kan være identificeret (figur 2). SEM billeder er især nyttig til at løse myrer med små øjne og ocelli. Hornhinden replikaer give oplysninger om den form, størrelse og antallet af linser i hvert øje (figur 3). Semi-tynde sektioner afbildet ved hjælp af LM teknikker tillader undersøgelse af brutto indre anatomi af øjet (figur 4 og figur 5); Dette omfatter tykkelsen af linse, diameter af den krystallinske kegle, tilstedeværelsen af en krystallinsk kegle tarmkanalen, form, bredde og længde af rhabdom, kortlægning dorsale rand område og placeringen af de primære og sekundære pigment celler. Denne teknik kan suppleres smukt af ultra-tynde sektioner afbildet ved hjælp af TEM, som giver mulighed for fastsættelse af ultrastruktur især, den microvillar orientering (figur 4) og at kvantificere mindre strukturer (f.eks., bredde den sammensnøret krystallinsk kegle tarmkanalen, figur 5).
Figur 1: Z-stak mikrofotografier af de tre kaster af den australske sukker Myren, Camponotus consobrinus. Dette giver en oversigt over layout af det visuelle system i alle tre kaster. Tilpasset fra reference20. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Scanning elektron micrographs af ant visuelle system viser denne teknik imaging funktioner. Øverste række viser forskellige øje positioner og øjet størrelser: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; og (C) Amblyopone australis (Bemærk den meget små øjne, Hvid pil). Billeder erhvervet ved høj forstørrelse viser: (D) tre simple øjne i arbejdstagere af Myrmecia nigriceps; forskellige størrelse sammensatte øje i (E) Rhytidoponera metallica (Bemærk den forskellige formet ommatidia i forskellige regioner i den sammensatte øje med gult), (F) Amblyopone australis(G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkiog (jeg) Pheidole art. Skalere barer = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm, (I). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hornhinden reproduktioner af ant øje og ocelli. (A) kopi af den sammensatte øje af en arbejdstager i Myrmecia nigriceps. Den konvekse replika var fladtrykt ved at gøre indsnit. Indsatsen angiver posterior (p), anterior (en), og dorsale (d), ventrale (v) akser. (B) kopi af ocelli på arbejder af Myrmecia tarsata. Skalere barer = 0.5 mm (A), 10 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: LM og EM billeder rhabdom tværsnit. (A) tværsnit af distale rhabdoms i Myrmecia nigriceps farves i toluidin blå kan bruges til at skelne mellem rhabdoms, der er cirkulære eller rektangulære i form. Transmissions elektron micrographs show: (B) flere retningslinjer microvilli i den cirkulære rhabdom og (C) microvilli orienteret i to modsatte retninger i den rektangulære formet rhabdom. (D) brug af lysmikroskopi, den lange akse af de rektangulære rhabdoms er knyttet til at vise en fan-lignende organisation i regionen dorsale i øjet i en dronning af Camponotus consobrinus; inset angiver posterior (p), anterior (a) og lateral (l), medial (m) akser. Panelet D tilpasset fra reference20. Skalere barer = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: LM og EM billeder af en ommatidium i en lys-tilpasset øjet af Myrmecia tarsata. (A) længdesnit af en ommatidium viser hornhinden (C), krystallinsk kegle (CC), kegle tarmkanalen (ct), rhabdom (Rh) og primære pigment celler (PPC). (B) stiplet rektangulær kasse i panelet A fra en anden sektion set under et TEM at kvantificere den smalle bredde af kegle-tarmkanalen. Tilpasset fra reference21. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: almindelige problemer med semi-tynd og ultra-tynde sektioner (fiksering og infiltration, klipning og farvning). (A) fattige fiksering af væv på grund af utilstrækkelig penetration (pil) i en semi-tynd sektion af Pheidole arter; (B) ripping ved skæring i Iridomyrmex calvus (semi-tynd); (C) perfekt farvning (venstre) og over farvning (til højre) med toluidin blå i Myrmecia croslandi; (D) pigment (cirkel) og væv ripping ved skæring (pile) på grund af dårlig matchning af harpiks og væv massefylde (harpiks for blød). Foldning af afsnittet (stjerner), kan ske når du samler sektioner fra kniv båd; (E) dårlig kontrast på grund af utilstrækkelig farvning (sammenlignet med inset), bly citrat krystaller (hvide pile) fra eksponering til CO2og lodret kniv mark (sorte pile); (F) huller i væv (hvide pile) forårsaget af dårlig fiksering i en Melophorus hirsutus sammensatte øje; (G) harpiks for blød, fører til chitter ved skæring ses som vertikale krusninger i afsnittet; (H) sektion for tyk (~ 100 nm) resulterede i mørkt billede med dårlig kontrast, forurenet destilleret vand fører til bakterier og partikler spredt over hele afsnittet (hvide pile) i Pheidole arter. Skalalinjen = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suiten af metoder ovenfor skitserede mulighed for en effektiv undersøgelse af det optiske system af myrer og andre insekter. Disse teknikker informere vores forståelse af samplingopløsning, optisk følsomhed og potentielle polarisering følsomhed i øjet ved at blive undersøgt. Denne viden giver et vigtigt fundament for fysiologiske og adfærdsmæssige undersøgelse af deres visuelle evner. Endvidere, mens metoderne detaljeret her har fokuseret på ant visuelle systemer, disse teknikker kan bruges på andre insekter, omend med mindre ændringer i protokol (f.eks.øget varighed af fiksering og infiltration i tykkere væv) . Lidt ændret protokoller har været brugt til at karakterisere de visuelle systemer for en lang række insekter herunder cikader22, fluer14, bier23, hvepse24, sommerfugle25og møl26. Selv om de fleste af teknikkerne, der er skitseret her har været i brug i et stykke tid, denne artikel tager mulighed for at samle dem i forbindelse med at studere myrens optiske system og sammenligne alternative teknikker og beskrive fælles faldgruber.
Der er mange Billeddannende teknikker i øjeblikket tilgængelige der har overlappende applikationer og det kan være svært at vurdere, hvilken teknik der passer til opgaven ved hånden. Et relevant eksempel her er at vælge en teknik til oversigt billeddannelse. Den ydre morfologi af hoved og øjne og relativ placering af det optiske system på hovedet kan gøres ved hjælp af SEM eller fotomikrografi. Styrker og svagheder af disse teknikker har været gennemgik27, men der er nogle særlige overvejelser når imaging øjne. Når imaging relativ placering og størrelse af øjnene, har begge metoder deres fordele og ulemper. SEM billeder mangler farveinformation og dermed hvor pigmentering er relevante fotomikrografi er bedre. Dog kan SEM billeder illustrere fine strukturer som Inter ommatidial hår og facet grænser nærmere og selv afsløre overflade funktioner ikke synlig under fotomikrografi teknikker (fx, ocellar linser, overflade modellering af sammensatte øje linser). SEM er en alsidig teknik når det kommer til sonderende imaging og identificere funktioner af interesse, fordi det kan operere på en lang række modellen størrelser samtidig stadig bevare meget høj opløsning i hele dette interval. Men det er ikke så bredt tilgængelig som en dissektion mikroskop og kræver en højere grad af ekspertise. Der er ofte ingen enkelt måde til at opnå oplysninger kræver. I et sådant scenario er det nyttigt at overveje, hvad der er tilgængeligt og hvor det er mest vigtigt at investere ressourcer.
Neglelak reproduktioner af hornhinden har vist sig for at være mest nyttige i at opnå den mest nøjagtige måling af facet numre og facet diametre. Dette er nu blevet brugt i en lang række insekter11,22,28,29. Selv om kvaliteten af de billeder, der er erhvervet fra en SEM er langt overlegen, forhindrer krumning af øjet nøjagtige målinger af matrixen hele facet. Kortlægning facet størrelse og facet fordeling bør også være muligt fra scanninger erhvervet fra mikro-beregnet tomografi5.
I både LM og TEM teknikker er det ofte svært at vide om prøven er blevet udarbejdet og behandlet godt, indtil den sidste fase af imaging. For at undgå komplikationer, er det vigtigt at fastlægge god praksis såsom vedligeholdelse af ren arbejder rum og redskaber, forberede nye løsninger regelmæssigt, og grundigt filtrering vand. Forurenende stoffer, der er usynlige for det blotte øje kan ødelægge EM prøver. Derfor kan det være nyttigt til at tørre ned overflader og instrumenter ved hjælp af et opløsningsmiddel, såsom ethanol eller acetone, og en ikke-fnugfri producerer tørre. Dette er mest relevant ved skæring, farvning EM sektioner, og når SEM prøver. Tilsvarende destilleret vandkilder kan præsentere problemer og indføre forurenende stoffer, så det er altid bedst at tjekke filtre, ændre dem jævnligt og brug altid frisk filtreret vand (ikke butik). De fleste fikseringsmidler, pletter og indlejring materialer kan ikke gemmes på ubestemt tid og det er vigtigt at mærke alle løsninger med datoen for forberedelse. Det er vigtigt at tage en systematisk tilgang og der er afsat tid nok til at udføre protokoller uden afbrydelser.
Tilpasse teknikker til forskellige arter er altid et spørgsmål om trial and error. Når du arbejder inden for Formicidae, ligger de vigtigste forskelle i størrelsen på dyret og muskelmasse i hovedet. Myrer med flere muskulatur i deres hoved vil typisk tage længere tid at lave. Med meget store myrer er det bedst at fjerne mandibular muskler, luftrør og mandibular kirtler, samtidig sikre minimal interferens med det neurale væv. I små myrer og dem med par mandibular muskler er det muligt at opnå tilstrækkelig fiksation ved blot at fjerne hvaltænder og udsætter den clypeal region. I disse tilfælde kan små huller ved hjælp af bagateller pins gøres på hovedet at forbedre fiksering.
Det er vigtigt at bemærke, at miljømæssige forhold kan også påvirke præparater. Varme og fugtige omgivelser (især felt stationer i troperne) kan vise sig for at være en udfordring på stadiet infiltration. Varme forhold kan føre harpiks til delvist polymerisere tidligt resulterer i ubrugt harpiks, der bliver stadig mere tyktflydende. I dette tilfælde er den bedste løsning at gemme harpiks i lille, enkelt brug, containere i køleskab eller fryser. Køling fikseringsmidler kan være nyttigt at counter hurtigere væv forfald under varme forhold. Dog vil afkølede løsninger sprede langsommere hvilket betyder, at behandling gange bør udvides til også for at sikre ordentlig penetration.
Med disse advarsler i tankerne, kan undersøgelse af det optiske system af myrer og andre insekter være meget givende. At studere det visuelle system giver os mulighed at anslå størrelsen af visuelle felter, interommatidial vinkler, optisk følsomhed og prøveudtagning resolutioner. Forståelse anatomi i øjet informerer vores forståelse og fortolkning af dyrs adfærd. For eksempel, anatomi tillader os at gøre forudsigelser om de visuelle kapaciteter af dyr som om de er temperaturprofil eller natlig, som måske ikke har tidligere dokumenteret. I betragtning af den nuværende viden om det visuelle system af håndfuld myrer, håber vi vores metoder vil inspirere biologer og myrmecologists til at undersøge den sammensatte øje og ocelli i myrer til at fremme vores forståelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Jochen Zeil, Paul Cooper og Birgit Greiner for at dele deres viden i insekt anatomi og for at vise flere af teknikkerne, vi har beskrevet her. Vi er taknemmelige for det talentfulde og støttende personalet på centret avancerede mikroskopi på ANU og The mikroskopi enhed på MQU. Dette arbejde blev støttet af en graduate stipendium til FRE og tilskud fra det australske Forskningsråd (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
