Summary
Questo articolo viene descritta una suite di tecniche in luce e la microscopia elettronica per studiare l'anatomia interna ed esterna dell'occhio degli insetti. Questi includono diverse tecniche tradizionali ottimizzate per il lavoro su occhi di formica, dettagliati risoluzione dei problemi e suggerimenti per l'ottimizzazione per diversi esemplari e aree di interesse.
Abstract
Questo articolo viene descritta una suite di tecniche in microscopia (LM) e microscopia elettronica (EM) che può essere utilizzata per studiare l'anatomia interna ed esterna dell'occhio degli insetti. Questi includono tecniche istologiche tradizionali ottimizzato per il lavoro sugli occhi di formica e adattato a lavorare di concerto con altre tecniche quali la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia elettronica a scansione (SEM). Queste tecniche, sebbene notevolmente utile, possono essere difficile per il microscopista novizio, quindi grande enfasi è stata posta in questo articolo sulla risoluzione dei problemi e ottimizzazione per diversi esemplari. Forniamo informazioni su tecniche di imaging per l'intero campione (foto-microscopia e SEM) e discutere i vantaggi e svantaggi. Evidenziamo la tecnica utilizzata nel determinare i diametri della lente per l'occhio intero e discutere nuove tecniche per il miglioramento. Infine, verranno illustrate tecniche coinvolte nella preparazione dei campioni per LM e TEM, sezionamento, colorazione e questi campioni di imaging. Discutiamo le transenne che uno potrebbe venire da altra parte quando preparare campioni e il modo migliore per navigare intorno a loro.
Introduction
Vision è una modalità sensoriale importante per la maggior parte degli animali. Visione è fondamentale soprattutto nel contesto della navigazione per individuare obiettivi, che istituisce e aderendo alle rotte e come ottenere informazioni bussola1,2. Insetti di rilevare informazioni visive usando un paio di occhi composti e, in alcuni casi, da uno a tre posti dorsalmente semplici occhi chiamato ocelli3,4,5.
Gli occhi di formiche sono di particolare interesse perché, mentre le formiche sono meravigliosamente diversificate, conservano alcune caratteristiche chiave tra le specie. Nonostante la drammatica variazione in anatomia, dimensioni e l'ecologia, la maggior parte delle specie è eusociali e vive in colonie; di conseguenza, diverse specie affrontano sfide simili visual in termini di navigazione avanti e indietro tra un posto centrale e risorse. Attraverso le formiche la stessa base occhio bauplan può essere osservata in animali che vanno da 0,5-26 mm in lunghezza del corpo, da esclusivamente diurno di specie strettamente notturne e da lento a piedi sotterraneo leaping visual predatori6,7, 8,9,10. Tutte queste differenze sconcertante in ecologia e comportamento dar luogo a innumerevoli permutazioni delle stesse strutture di base dell'occhio per adattarsi a diversi ambienti, stili di vita e dimensioni del corpo11,12. Di conseguenza, studiando l'ecologia visiva di formiche fornisce un vero e proprio tesoro di possibilità per l'investigatore risoluto.
Capire il sistema visivo degli insetti è essenziale a comprendere un loro funzionalità comportamentale. Questo è evidente da studi integrativa che ben combinano anatomia con ecologia e il comportamento di un grande successo in alcuni gruppi di insetti (per esempio, riferimenti13,14,15,16, 17). anche se il campo di navigazione di formica e il comportamento della formica, in generale, è stato molto efficace, pochissima enfasi è stata posta sulla visione di formica di fuori di alcune specie selezionate. Qui, ci soffermeremo sulle tecniche coinvolte nell'inchiesta di disegno dell'occhio di formiche. Mentre ci si concentrerà sulle formiche, queste tecniche possono essere applicate, con lievi modifiche, agli altri insetti, troppo.
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Protocol
1. preparazione
Nota: È necessario prima capire la posizione relativa dell'occhio composto e ocelli a vicenda e sulla testa. Ciò può essere ottenuto con l'acquisizione di immagini di vista dorsale della testa. Per questo, si consiglia di campioni di elaborazione per la fotomicrografia o utilizzando tecniche di SEM. Di seguito sono passaggi coinvolti in entrambi i processi.
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Raccolta dei campioni
- Raccogliere e conservare i campioni direttamente in etanolo al 70%. Raccogliere diverse caste quando possibile.
- Etichettare i campioni con ora, data e così come eventuali altre osservazioni pertinenti (ad es., raccolti durante il foraggiamento, accoppiamento aggregazione, nido all'interno di un ramoscello, ecc.)
- Raccogliere abbastanza esemplari per avere più replicati in ogni trattamento.
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Microfotografia e Z-stacking
- Aria secchi esemplari e montarli sul punto triangolare carte, utilizzando colla solubile in acqua e poi su un pin di insetto. Per informazioni dettagliate, vedere riferimento18.
- Immagine utilizzando un microscopio stereoscopico ad alto ingrandimento con un Z-stepper motor e una telecamera a colori.
- Utilizzare un diffusore per avere un'illuminazione uniforme per gli esemplari.
- Catturare immagini a diversi piani focali e salvare le immagini in un formato di file senza perdita di dati (ad esempio tiff) e stack di messa a fuoco usando il software disponibile in commercio.
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I micrografi elettronici di scansione
Nota: Pulire accuratamente tutti gli strumenti e le superfici di lavoro con etanolo per evitare la contaminazione del campione con la polvere e altre particelle.- Disidratare esemplari in etanolo durante la notte e aria secca in una capsula di Petri.
- Utilizzare una lama di rasoio affilata per separare la testa dal resto del corpo.
- Montare la testa con l'angolo di visualizzazione richiesti (ad es., dorsale rivolto verso l'alto) su alluminio Stub utilizzando nastri di carbonio conduttivo o schede. Tagliare il nastro di carbonio in strisce sottili e piegarlo per supportare la capsula testa.
- Utilizzare una macchina a polverizzazione per applicare oro sulla superficie dell'esemplare per 2 min a 20 mA con un palco rotante. Il tempo e la corrente potrebbe essere necessario essere regolata a seconda dello strumento.
- Trasferire gli esemplari a un nuovo stub di alluminio con nastri di carbonio fresco o tabulazioni.
Nota: Il carbonio non patinato fornirà uno sfondo nero, ma trasferire esemplari possono danneggiare il rivestimento in oro. - Controllare che l'orientamento del campione sia ancora corretto utilizzando un microscopio da dissezione e regolare se necessario con un paio di una pinzetta o un attrezzo simile. Fare attenzione a non per graffiare il rivestimento d'oro; manico è il meno possibile.
- Caricare i campioni sul supporto albero mozzo del SEM, prendendo nota della posizione di stub ed esemplari uno rispetto a altro.
Nota: Alcuni SEMs sono dotati di una fotocamera di fase ma molti non lo sono e può essere difficile da individuare piccoli esemplari ad alto ingrandimento. - Gli esemplari della battuta. Per evitare di ricarica ed una piccola apertura per buona profondità di campo, utilizzare una bassa tensione di accelerazione.
Nota: Le impostazioni sono ottimizzate in consultazione con un tecnico specializzato in particolare strumento in uso.
2. quantificazione Facet numeri e diametri
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Repliche di cornea
- Utilizzare le formiche conservati in etanolo o montato su un perno per questo scopo (punto 1.1.1).
- Montare l'animale su un pin di insetto o su plastilina. Se la testa è relativamente grande, le restanti parti del corpo possono essere rimosso.
- Utilizzare un pin di insetto o uno stuzzicadenti bene a prendere una piccola goccia di smalto per unghie incolore ad asciugatura rapida e si diffuse rapidamente sopra l'occhio. Assicurarsi che il perno non si graffia l'occhio. Lo smalto dovrebbe coprire tutto l'occhio e alcuni della capsula testa circostante.
Nota: È importante che lo smalto sia di spessore relativamente uniforme attraverso l'occhio. - Lasciare lo smalto di chiodo per impostare a temperatura ambiente.
- Una volta che è completamente impostato, utilizzare un pin insetto bene per sollevare delicatamente la replica dalla testa capsula che circonda l'occhio.
- Utilizzare un bel paio di pinzette pulite per sollevare la replica, afferrare la parte della replica che copre la testa e non l'occhio.
- Garantire la consapevolezza dell'orientamento dell'occhio: la regione anteriore, posteriore, dorsale e ventrale.
- Inserire la replica su un vetrino. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare la replica rimuovendo accuratamente il materiale in eccesso intorno all'occhio. Utilizzare un ago o un paio di pinze per impedire la replica di spostare.
- Se l'occhio è molto convesso, è possibile utilizzare una lama di rasoio per fare 3-4 belle incisioni radiali parziale intorno al bordo per aiutare 'appiattire' la replica. Se l'occhio è relativamente 'piatto', non esiste alcuna necessità di rendere tali incisioni.
- Appoggiare delicatamente un coprioggetto sulla replica di occhio, assicurando che l'orientamento della replica è noto. Non esercitare una pressione come questo può eliminare l'impressione cornea sullo smalto.
- Sigillare il coprioggetto utilizzando pochissimo smalto sui quattro angoli. Se lo smalto scorre tra i vetrini coprioggetto e vetrini, danneggia la replica.
- Immagine della diapositiva su un microscopio composto.
Nota: se solo alcuni aspetti sono a fuoco, quindi questo suggerisce che la replica di occhio non abbastanza semplificata. Ignorare e iniziare nuovamente dal punto 2.1.3. - Nei programmi liberamente disponibili come ImageJ/Fiji dove può essere misurati il numero di ommatidi e dimensione di ogni ommatidi, importare l'immagine.
Nota: Questo metodo può essere utilizzato per preparare le repliche di ocelli, troppo. Trattandosi di una sola lente, si consiglia di mantenere tutti gli ocelli insieme in una replica.
3. analizzare la struttura dell'occhio
Nota: Per studiare l'anatomia dell'occhio richiede nella maggior parte dei due tecniche complementari di casi di LM e TEM. Le fasi di lavorazione iniziale richiedono tecniche simili per TEM e LM. La differenza deriva dalla fase di sezionamento in poi. Trattamento dei campioni richiede l'utilizzo di sostanze chimiche pericolose che devono essere maneggiati con cura e scartati in modo responsabile. Utilizzare dispositivi di protezione individuale, lavorare in una cappa, sempre leggere il sheets(SDS) di dati di sicurezza e svolgere valutazioni del rischio prima di iniziare.
- Dissezione
- Anestetizzare gli esemplari da raffreddamento o da esposizione a gas CO2.
- CO2 anestesia è molto veloce (generalmente meno di 1 min) e la cura dovrebbe essere presa per evitare sovraesposizioni come questo può provocare la morte dell'esemplare. Se si utilizza pellets di ghiaccio secco (solido CO2) evitare il contatto diretto con esemplari come questo può causare bruciature da freddo.
- L'anestesia freddo è più lento; 4 ° C è sufficiente, e le temperature più fredde non sono raccomandate. Stabilire un tempo di raffreddamento adeguato per la specie. Fredde o grandi formiche resistenti quali le formiche Toro possono richiedere > 10 min per diventare completamente immobilizzato, mentre specie più piccole possono solo bisogno di 1-2 min eccessivo raffreddamento ucciderà l'esemplare (evitare il contatto diretto con ghiaccio). Esemplari preferibilmente dovrebbero essere tenuti in contenitori piccoli, tappo di gomma piuma, plastica e inseriti in una ghiacciaia dove possono essere osservati, invece che in un frigorifero elettrico o in freezer.
- Collocare il campione su una piastra di Petri e regolare per la visualizzazione al microscopio per dissezione. Lavorando in fretta è importante per preservare l'anestesia e per evitare la degenerazione del tessuto una volta le incisioni sono fatte (questo può) accadere in pochi secondi.
- Rimuovere antenne con le pinzette. Se si lavora con un insetto pungente, si consiglia di amputare il gaster prima per evitare di essere fregati.
- Rimuovere le parti della bocca utilizzando una lama di rasoio affilata; forcipe può essere usato per il campione tenendo premuto. Tagliare la parte anteriore dell'occhio (grandi esemplari) o più vicino possibile agli occhi come possibile (piccoli esemplari) senza strattoni sul cervello come questo possono strappare la retina.
- Preparatevi ad aprire la capsula a testa. Angolo del campione in modo che la prima incisione è rivolta verso l'alto; Questo può essere fatto sia sotto il microscopio per dissezione tenendo l'esemplare in forcipe o sotto controllo visivo mentre si tiene l'esemplare tra il dito pollice e ribalta.
- Fare un'incisione trasversale attraverso la testa di rimuovere la parte ventrale della testa; parte dell'occhio ventrale può essere rimossi in specie di grandi dimensioni per migliorare la fissazione e l'infiltrazione. La testa deve essere ancora attaccata al corpo a questo punto.
- Recidere la capsula testa dal corpo facendo un'incisione della corona appena dietro l'occhio composto.
- Inserire la capsula testa dissecata con gli occhi compound in fissativo freddo ghiaccio: 2,5% paraformaldeide glutaraldeide e 2% in tampone fosfato (pH 7.2-7.5).
Attenzione: Fissativo è corrosivo e tossico; indossare una protezione appropriata e lavorare in una cappa aspirante.
Nota: È importante lavorare rapidamente per arrestare la degenerazione del tessuto neurale. La dissezione dovrebbe essere completato in 2 min o meno (dissezione efficiente può richiedere un po' di pratica).
Nota: Se l'occhio deve essere adattato alle condizioni luminose o scure, prima esporre gli animali alla condizione di luce necessaria per poche ore. Svolgere le dissezioni nelle rispettive condizioni di luce. Dissezioni possono essere effettuate sotto luci rosse per simulare le tenebre.
- Anestetizzare gli esemplari da raffreddamento o da esposizione a gas CO2.
- Trattamento dei campioni
- Tenere gli esemplari il fissativo a temperatura ambiente con movimento su agitatore orbitale, per campioni di grandi dimensioni di 2 h. potrebbero richiedere tempi più lunghi di fissazione.
- Rimuovere il fissativo e smaltire in modo appropriato. Lavare i campioni a temperatura ambiente di tampone fosfato (3 volte, 5 minuti ciascuno) sull'agitatore.
Nota: Il tampone fosfato è composto da 8 g NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g Na2HPO4e g 0,244 KH2PO4 in 1 L di acqua distillata H2O (pH 7,2). - Rimuovere il tampone di fosfato e aggiungere 2% OsO4. Mettete il contenitore del campione sull'agitatore nella cappa fumi per 1-2 h. Si tratta di un passaggio di post-fissazione per Difficoltà grassi nonché un contrasto TEM.
Nota: I tempi di fissazione osmio sono soggette a dimensione del campione; come una regola approssimativa, calcolare 1 h di fissaggio per 1 mm3. - Rimuovere la soluzione di osmio e smaltirla in modo appropriato. Lavare gli esemplari in tampone a temperatura ambiente (3 volte, 5 minuti ciascuno) sull'agitatore.
- Disidratare gli esemplari ponendoli in aumento delle concentrazioni di etanolo o acetone; ad esempio, 50, 70, 80 e 95% per 10 minuti ciascuno e infine 100% (2 volte, 15 minuti ciascuno). Posizionare gli esemplari nell'agitatore tra i cambiamenti di soluzione.
Nota: Se necessario, campioni possono essere conservati in etanolo al 70% durante la notte. - Scolare l'etanolo e aggiungere 100% di acetone. Lasciare per 20 minuti sull'agitatore (salta questa tappa se esso disidratazione in acetone). Sostituire con acetone fresco e lasciarlo per altri 20 minuti.
- Infiltrano i tessuti con resina utilizzando i seguenti rapporti di acetone alla resina: 2:1 (3 h), 1:1 (pernottamento), 1:2 (4h) e resina pura (una notte). Ad ogni passo lasciare esemplari nell'agitatore all'interno della cappa fumi e tappo del contenitore per tutti, ma gli ultimi due passaggi.
Nota: La resina è troppo viscosa per essere svuotato così gli esemplari devono essere spostati in un nuovo contenitore usa e getta ad ogni passo. - Preparare blocchi di montare i campioni. Blocchi possono essere personalizzati realizzati da taglio vetro acrilico in piccoli blocchi rettangolari (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Blocchi possono anche essere fatta di resina epossidica colata (ci sono molti corredi commerciali disponibili) in uno stampo di silicone e quindi curarla in forno per 12-14 ore a 60 ° C.
Attenzione: La resina non polimerizzata (liquida) è cancerogena e deve essere restituita al forno fino a quando non completamente indurito. - Posizionare il blocco verticalmente nello stampo. Attentamente prendere gli esemplari dalla resina liquida, consentire l'eccesso di resina drenare e posizionare il campione sulla parte superiore del blocco. Una piccola quantità di resina aggiuntiva può essere utilizzata per associare l'esemplare al blocco.
- Etichettare il blocco. Stampare le etichette di carta e incorporarlo nel blocco o allegarlo a una faccia del blocco.
- Tenere lo stampo con i blocchi incorporati in forno per 12-14 ore a 60 ° C.
- Memorizzare il blocco di campione in una busta pulita. Questo può essere riposto in questo modo nel corso di diversi mesi o anni.
- Lasciare i contenitori usati, guanti sporchi e altre attrezzature contaminate nella cappa per consentire acetone a evaporare completamente (minimo 12 ore).
- Curare la resina nel forno prima di smaltire il materiale monouso o raschiatura resina fuori altri oggetti quali pinze.
- Sezionamento
- Osservare il blocco sotto il microscopio per dissezione per garantire che l'orientamento del campione sia appropriata per il piano di sezione.
- Se l'orientamento non è appropriato, è possibile utilizzare ha visto un gioielliere per tagliare fuori il campione e ri-orientare utilizzando frammenti di set resina e resina fresca per reinserire l'esemplare. La testa può essere anche suddiviso in due metà per sezionare i due occhi separatamente. Curare la resina ancora prima di procedere.
- Montare il blocco sul mandrino estraibile microtomo. Rimuovere il mandrino e il titolare.
- Tagliare il blocco di resina utilizzando una lama di rasoio sotto il microscopio per dissezione.
Attenzione: Non farlo quando il mandrino è montato sul braccio microtomo come può scuotere il braccio e danneggiare i cuscinetti. - Rimontare il mandrino sul braccio di un microtomo e angolo del campione.
- Montare il coltello al titolare l'angolo appropriato (0° per la lama di vetro, vedere le istruzioni del produttore per coltelli di diamante).
Nota: Coltelli di vetro possono essere fatto a buon mercato con un coltellinaio di vetro ma devono essere sostituiti periodicamente come perdono il loro bordo; coltelli di diamante di alta qualità possono essere acquistati, ma sono costosi, richiedono cure particolari e non sono adatti per i principianti. - Riempire la barca di coltello con acqua distillata usando una siringa dotata di un filtro (dimensione dei pori di 0.45 µm).
- Riempire la barca fino a quando il livello dell'acqua raggiunge il bordo del coltello; il menisco può essere convesso in altre zone della barca.
- Drenare la barca fino a quando il menisco è molto leggermente concavo, ma ancora raggiunge il bordo del coltello. Il livello dell'acqua può essere regolato in qualsiasi punto, ma sempre lontano dal bordo del coltello.
- Con attenzione portare il coltello verso il campione e allineare il blocco al coltello. Questo è meglio farlo lentamente, periodicamente controllando la vicinanza del coltello attraverso l'oculare e dal lato.
Nota: Controllare il manuale dello strumento per istruzioni specifiche come strumenti variano. - Impostare lo spessore di sezione del microtomo. Selezionare lo spessore corretto sarà dipendente dalla dimensione del campione, regione di interesse e il tipo di coltello utilizzato.
- Se usando un coltello di vetro seleziona un'impostazione superiore (ad esempio, 4 µm), se un sacco di materiale deve essere tagliati via prima di raggiungere l'area di interesse. Se viene utilizzato un coltello di diamante o se il campione è molto piccolo, 1-2 µm può essere più appropriato.
- Avviare il "taglio" (avviamento della ruota microtomo) quando il coltello è vicino ma non ancora tagliando il campione per eseguire l'ultima parte dell'approccio. Sezioni dovrebbero iniziano ad apparire all'interno di alcune rotazioni; in caso contrario, interrompere e molto attentamente portare il coltello un po' più vicino.
- Regolare la sezione raccolta spessore (1 µm per sezioni semi-sottile) quando si avvicina la regione di interesse.
- Raccogliere tutte le sezioni utilizzando uno strumento di ciglia.
Nota: Strumenti di ciglia possono essere fatta con un ciglio montato su un bastone sottile con lo smalto. - Se un sacco di materiale dovrà essere rimossi, consentire le sezioni di accumulare e rimuovere in massa rimuovendo il coltello e vampate di calore fuori con acqua. Se usando un coltello di vetro, questo potrebbe essere un momento opportuno per modificare una sezione fresca del coltello o un coltello nuovo.
- Posto una serie di piccole goccioline di acqua distillata in una diapositiva utilizzando una pipetta Pasteur o idealmente, il filtro dotato di siringa.
- Galleggiante con attenzione la sezione raccolta sul ciglio sulla gocciolina di acqua.
- Raccogliere le sezioni come questo fino a quando non è opportuno verificare la profondità di taglio.
Nota: Anche se può essere noioso, è sempre meglio controllare spesso. - Porre il vetrino su una piastra riscaldante impostata a 60 ° C. Consentire tutte le acqua di evaporare e la sezione di aderire alla diapositiva.
- Colorante blu per 10-60 s sezioni con toluidina (tempo di colorazione variano con lo spessore della sezione). Dispensare il colorante con una siringa dotata di un filtro (come sopra).
- Mettere una goccia di tintura su un'estremità del vetrino e diffonderla utilizzando il lato dell'ago senza toccare o raschiare le sezioni. Porre il vetrino sulla piastra per circa 10-20 secondi.
- Sciacquare il vetrino spruzzando con acqua distillata in una bottiglia di lavaggio e posizionarlo sulla piastra calda per asciugarlo.
- Controllare sotto il microscopio composto e la loro immagine.
- Ripetere finché non si raggiunge la regione di interesse.
- Per le sezioni ultrasottili: impostare lo spessore di taglio tra 40-60 nm per raccogliere le sezioni TEM.
- Taglio su 3-5 sezioni e controllo spessore utilizzando una tabella di colore di interferenza. Sezioni dovrebbero riflettere grigio chiaro quando hanno visto ad un angolo.
Nota: Fumi di cloroformio possono essere dispensati sopra sezioni per rilassarsi eventuali pieghe. Questo è più rilevante per gli utenti esperti e principianti non devono preoccuparsi. Troppo cloroformio rilasciato troppo vicino alla sezione possa danneggiare le sezioni. - Raccogliere una griglia di slot Formvar-rivestito, il rame, tenuta con una pinza con il lato di Formvar. Fare attenzione a non forare il rivestimento Formvar.
- Immergere la griglia in barca edgeways e lontano le sezioni, quindi portare la griglia a parallelo alla superficie sotto le sezioni. Se necessario è possibile utilizzare le ciglia per guidare le sezioni sopra la griglia.
- Tamponare con attenzione intorno alla punta della pinza con carta da filtro per assorbire acqua intrappolata tra le braccia. Se ciò non avviene, la tensione idrica può sollevare la griglia tra le braccia o farlo aderire ad un lato. Questo può causare contaminazione o danni meccanici.
- Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla griglia stessa levandosi in piedi la griglia sempre su carta da filtro.
- Posizionare la griglia in un supporto di griglia.
- Ripetere fino a quando sono stati raccolti abbastanza sezioni.
- Sezioni semi-sottile possono essere imaged direttamente con qualsiasi microscopio composto dotato di una fotocamera. Olio di immersione può essere posizionato direttamente sulle sezioni. I vetrini devono essere conservati in una scatola di diapositiva per evitare lo scolorimento.
- Ultra-sottile sezione per contrasto TEM di colorazione
Nota: La seguente procedura deve avvenire sotto copertura come le tinture sono luce e CO2 sensibili. Inoltre, EM coloranti utilizzano metalli pesanti per la produzione di contrasto e sono quindi sostanze pericolose. Cure appropriate devono essere prese maneggiare queste macchie.- Coprire alcuni grandi piatti Petri con foglio di alluminio per bloccare la luce. Lavorare sotto questi per le fasi successive. Parzialmente scoprirle per consentire lo spazio di lavoro ma posto le copertine indietro il più presto possibile.
- Tagliare un pezzo di pellicola di cera e posizionare accuratamente cinque gocce di acetato di uranile 6% saturata su di esso utilizzando una pipetta Pasteur.
- Per preparare la soluzione, mescolare 2 g di acetato di uranile con 100 mL di metanolo al 50% in acqua distillata e filtrare la soluzione prima dell'uso. La soluzione non può essere memorizzata e dovrebbe essere fatta fresca ogni tempo19.
- Attentamente pick up le griglie TEM con forcipe ed equilibrio sulla cima di gocce di tintura con il lato di sezione verso il basso. Lasciare agire per 25 min.
- Sciacquare le griglie singolarmente immergendoli rapidamente dentro e fuori di acqua distillata; progresso attraverso quattro diverse fiale di acqua distillata.
- Posizionare cinque gocce di citrato di piombo su un pezzo di pellicola fresca. Organizzare qualche pellet di NaOH intorno le gocce di tintura (questo assorbe atmosferica di CO2 per impedire la precipitazione di carbonato di piombo).
- Per rendere la soluzione di citrato di piombo, preparare l'acqua bi-distillata da acqua distillata bollente per 0,5 h. Consenti l'acqua per raffreddare ed in un recipiente ermetico, aggiungere citrato di piombo di 0,3 g per 100 mL di acqua bi-distillata. Aggiungere 1 mL 10 M NaOH, sigilla ermeticamente il contenitore e agitare fino a disciolto19.
- Posizionare le griglie sulle gocce tintura come descritto ai punti 4.3 e copertura. Macchia per 5 min.
- Sciacquare in acqua distillata come prima immergendo le griglie dentro e fuori acqua distillata 20 volte. Progresso attraverso tre vasi di acqua distillata.
- Assorbire l'acqua in eccesso con carta da filtro e consentire le griglie ad asciugare in una casella della griglia.
- Immagine in un TEM a bassa tensione di accelerazione.
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Representative Results
I metodi descritti qui abilitare studio dettagliato dei semplici e occhi composti di formiche. Vista dorsale della testa usando Z-stack fotomicrografia tecniche di imaging permette di ottenere una panoramica del layout del sistema visivo (Figura 1). Si tratta di una buona preparazione per dissezioni e per determinare l'angolo di taglio desiderato. Questa tecnica è anche utile per effettuare le misurazioni come larghezza della testa, occhio lunghezza e diametri della lente ocellare. Formazione immagine SEM dà anche immagini Panoramica dettagliata ma inoltre permette l'acquisizione di alto ingrandimento e immagini ad alta risoluzione. Particolari regioni di interesse nell'occhio possono essere esaminate in dettaglio e variazioni nella forma della lente possono essere identificato (Figura 2). Immagini al SEM sono particolarmente utili per la risoluzione di formiche con occhi piccoli e priva di ocelli. Le repliche di cornea forniscono informazioni su forma, dimensione e numero di lenti in ogni occhio (Figura 3). Sezioni semi-sottile Imaging utilizzando tecniche di LM consentono indagini dell'anatomia lorda interna dell'occhio (Figura 4 e Figura 5); Questo include lo spessore della lente, diametro del cono cristallino, la presenza di un tratto di cono cristallino, la forma, la larghezza e la lunghezza di rhabdom, mapping dell'area del cerchio dorsale e posizione delle cellule del pigmento primarie e secondarie. Questa tecnica può essere ben integrata da sezioni ultrasottili Imaging utilizzando TEM, che consente di determinare l'ultrastruttura soprattutto, l'orientamento microvillare (Figura 4) e la quantificazione più piccole strutture (ad es., larghezza di il tratto ristretto cono cristallino, Figura 5).
Figura 1: Microfotografie di Z-stack delle tre caste della formica zucchero australiano, Camponotus consobrinus. Questo fornisce una panoramica del layout del sistema visivo in tutte le tre caste. Adattato da riferimento20. Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: scansione micrografi elettronici del sistema visivo formica che dimostra le capacità di imaging di questa tecnica. Riga superiore Mostra posizioni differenti dell'occhio e occhio dimensioni in: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; e (C) Amblyopone australis (si noti la freccia di occhi molto piccoli, bianco). Immagini acquisite ad alto ingrandimento risultati: (D), i tre occhi semplici negli operai di Myrmecia nigriceps; diverse dimensioni occhio compound nella (E) Rhytidoponera metallica (Nota i diversi a forma di ommatidi in diverse regioni dell'occhio compound in giallo), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkie (mi) Pheidole specie. Scala bar = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: repliche di Cornea dell'occhio di formica e priva di ocelli. (A) Replica dell'occhio composto di un lavoratore di Myrmecia nigriceps. La replica convessa è stata appiattita facendo incisioni. L'inserto indica posteriore (p), anteriore (a) e dorsale (d), gli assi ventrale (v). (B) Replica di ocelli dell'operaio di Myrmecia tarsata. Scala bar = 0,5 mm (A), 10 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: LM ed EM immagini di sezioni trasversali rhabdom. (A) sezione di rhabdoms distale in Myrmecia nigriceps tinto blu di toluidina può essere utilizzato per distinguere i rhabdoms che sono di forma rettangolare o circolare. Visualizza i micrografi elettronici di trasmissione: (B) più orientamenti di microvilli in rhabdom circolare e i microvilli (C) orientati in direzioni opposte in rhabdom a forma rettangolare. (D) usando microscopia chiara, l'asse lungo del rhabdoms rettangolare vengono mappati per mostrare un'organizzazione ventaglio nella regione dorsale dell'occhio in una regina di Camponotus consobrinus; inserto indica posteriore (p), anteriore (a) e laterale (l), assi mediale (m). Pannello D adattato da riferimento20. Barre di scala = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: LM ed EM immagini di un ommatidium in un occhio adattato a luce di Myrmecia tarsata. (A) sezione longitudinale di un ommatidium mostrando la cornea (C), cono cristallino (CC), tratto di cono (ct), rhabdom (Rh) e primario cellule del pigmento (PPC). (B) Dashed rettangolare casella nel pannello A da una diversa sezione hanno visualizzata sotto un TEM per quantificare la larghezza stretta del tratto di cono. Adattato da riferimento21. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: problemi comuni con sezioni semi-sottile e ultra-sottile (fissazione e infiltrazione, taglio e colorazione). (A) scarsa fissazione del tessuto a causa di insufficiente penetrazione (freccia) in una sezione semi-sottile di specie Pheidole ; (B) lo strappo durante il sezionamento in Iridomyrmex calvus (semi-sottile); (C) perfetta colorazione (a sinistra) e sopra (a destra) la macchiatura con toluidina blu in Myrmecia croslandi; (D) pigmento (cerchio) e tessuto strappo durante il sezionamento (frecce) a causa di scarsa corrispondenza della densità del tessuto e resina (resina troppo morbida). Pieghevole della sezione (asterischi), può accadere quando raccoglie sezioni da barca coltello; (E) poveri di contrasto a causa di insufficiente colorazione (confronta all'inserzione), cristalli di citrato di piombo (frecce bianche) dall'esposizione al CO2e coltello verticale mark (frecce nere); (F) fori nel tessuto (frecce bianche) causato da scarsa fissazione in un occhio compound Melophorus hirsutus ; (G) resina troppo morbida, conduce a chitter durante il taglio visto come ondulazioni verticali nella sezione; (H) sezione troppo spessa (~ 100 nm) ha provocato immagine scura con scarso contrasto, piombo contaminati acqua distillata per batteri e particelle sparse per la sezione (frecce bianche) in specie Pheidole . Barra della scala = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La suite dei metodi descritti sopra consentono un'efficace indagine il sistema ottico di formiche e altri insetti. Queste tecniche di informare la nostra comprensione della risoluzione di campionamento, sensibilità ottica e potenziale sensibilità di polarizzazione dell'occhio in fase di studio. Questa conoscenza fornisce una base importante per indagini fisiologiche e comportamentali nella loro capacità visiva. Inoltre, mentre i metodi descritti qui sono concentrati su sistemi visivi formica, queste tecniche possono essere utilizzate su altri insetti, anche se con lievi modifiche nel protocollo (ad esempio, aumentando la durata della fissazione e infiltrazione nei tessuti più spessi) . Leggermente modificate protocolli sono stati usati per caratterizzare i sistemi visivi di una varietà di insetti tra cui cicale22, mosche14, API23, vespe24,25di farfalle e falene26. Anche se la maggior parte delle tecniche descritte qui sono stati in uso per qualche tempo, articolo coglie l'occasione per riunirli nel contesto di studiare il sistema ottico della formica e confrontare tecniche alternative e descrivere i problemi comuni.
Ci sono molte tecniche di imaging attualmente disponibili che hanno applicazioni di sovrapposizione e può essere difficile valutare quale tecnica è adatta per il compito a portata di mano. Un esempio pertinente qui sta scegliendo una tecnica per formazione immagine panoramica. La morfologia esterna della testa e degli occhi e il posizionamento relativo del sistema ottico sulla testa può essere fatto utilizzando SEM o fotomicrografia. Forza e debolezza di queste tecniche è state ha commentato27, tuttavia, ci sono alcune considerazioni speciali quando gli occhi di imaging. Quando la formazione immagine il posizionamento relativo e le dimensioni degli occhi, entrambe le tecniche hanno i loro vantaggi e svantaggi. Immagini al SEM mancano informazioni sul colore e quindi dove la pigmentazione è rilevante la fotomicrografia è meglio. Tuttavia, immagini di SEM possono illustrare strutture fini come peli Inter-ommatidial e confini di sfaccettatura più dettagliatamente e anche rivelare caratteristiche della superficie non visibile sotto tecniche fotomicrografia (ad es., lenti ocellare, rimodellamento della superficie occhio composto lenti). SEM è una tecnica versatile quando si tratta di imaging esplorativo e identificazione delle caratteristiche di interesse perché può operare su una vasta gamma di formati di esemplare pur mantenendo una risoluzione molto elevata in tutta la gamma. Tuttavia, non si tratta come ampiamente accessibile come un microscopio di dissezione e richiede un alto livello di competenza. Spesso non esiste nessun unico modo di ottenere le informazioni che si richiede. In tale scenario, è utile prendere in considerazione ciò che è disponibile e dove è più importante investire risorse.
Smalto repliche della cornea hanno dimostrato di essere più utile nell'ottenere la misura più accurata dei numeri di sfaccettatura e diametri di sfaccettatura. Questo ora è stato usato in una varietà di insetti11,22,28,29. Mentre la qualità delle immagini acquisite da un SEM è lontano superiore, la curvatura dell'occhio impedisce misurazioni accurate della matrice intera sfaccettatura. Mappatura la sfaccettatura dimensione e distribuzione di sfaccettatura dovrebbe anche essere fattibile da scansioni acquisite da micro-tomografia5.
Nelle tecniche il LM e il TEM, è spesso difficile sapere se il campione è stato preparato e trattato bene fino a quando la fase finale di formazione immagine. Per evitare complicazioni, è importante stabilire buone pratiche come mantenere lavoro puliti gli spazi e strumenti, preparare soluzioni fresche regolarmente e accuratamente filtraggio acqua. Contaminanti che sono invisibili ad occhio nudo possono rovinare i campioni EM. Per questo motivo, può essere utile pulire le superfici e strumenti mediante un solvente, come etanolo o acetone e un non-panno producendo wipe. Questo è più rilevante durante il taglio, colorazione sezioni EM e durante la preparazione di campioni di SEM. Allo stesso modo, fonti di acqua distillata possono presentare problemi e introdurre contaminanti quindi è sempre meglio controllare i filtri, cambiarle regolarmente e utilizzare sempre acqua fresca filtrata (non conservare). Maggior parte dei fissativi, macchie e incorporamento materiali non possono essere archiviati a tempo indeterminato ed è importante etichettare tutte le soluzioni con la data di preparazione. È importante adottare un approccio sistematico e mettere da parte abbastanza tempo per svolgere protocolli senza interruzioni.
Adattando le tecniche a specie diverse è sempre una questione di tentativi ed errori. Quando si lavora all'interno di Formicidae, le principali differenze si trovano nella dimensione dell'animale e la massa del muscolo all'interno della testa. Formiche con muscolatura più nella loro testa in genere richiederà più tempo per risolvere. Con le formiche molto grande, è meglio rimuovere i muscoli mandibolari, della trachea e ghiandole mandibolari, pur garantendo la minima interferenza con il tessuto neurale. In piccole formiche e quelli con pochi muscoli mandibolari, è possibile raggiungere un'adeguata fissazione solo rimuovendo le mandibole e esponendo la regione clipeale. In questi casi, piccoli fori con perni di minuzie possono avvenire sulla testa per migliorare la fissazione.
È importante notare che condizioni ambientali possono colpire anche i preparativi. Ambienti caldi e umidi (soprattutto le stazioni di campo nei tropici) possono rivelarsi una sfida durante la fase di infiltrazione. Condizioni di caldo possono portare resine parzialmente polimerizzare prematuramente, conseguente la resina inutilizzata, diventando sempre più più viscoso. In questo caso, l'opzione migliore è quello di conservare la resina in piccolo, monouso, contenitori in frigorifero o nel congelatore. Fissativi di raffreddamento può essere utile al decadimento del tessuto più veloce di contatore in condizioni di caldo. Tuttavia, soluzioni raffreddati si disperdono più lentamente il che significa che i tempi di trattamento dovrebbero essere esteso per garantire una corretta penetrazione.
Con queste precauzioni in mente, il sistema ottico di formiche e altri insetti: indagine può rivelarsi molto gratificante. Studiando il sistema visivo permette di stimare le dimensioni dei campi visivi, angoli interommatidial, sensibilità ottica e risoluzioni di campionamento. Comprensione dell'anatomia dell'occhio informa la nostra comprensione e interpretazione del comportamento animale. Ad esempio, anatomia ci consente di fare previsioni sulle capacità visiva degli animali ad esempio se sono diurne o notturne, che potrebbe non sono stati documentati in precedenza. Data la conoscenza attuale, il sistema visivo di manciata di formiche, speriamo che i nostri metodi ispirerà biologi e myrmecologists per indagare l'occhio composto e ocelli nelle formiche per avanzare la nostra comprensione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Siamo grati a Jochen Zeil, Paul Cooper e Birgit Greiner per condividere le loro conoscenze in anatomia degli insetti e per dimostrare alcune delle tecniche che abbiamo descritto qui. Siamo grati per il personale di talento e di supporto al centro per microscopia avanzata alle ANU e la microscopia Unit presso MQU. Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio laureato a FRE e sovvenzioni da Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
