Summary
Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.
Abstract
Der Zebrafisch-Larven ist ein wichtiger Modellorganismus für Entwicklungsbiologie und Wundheilung. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Larven ein wertvolles System für live hochauflösende mikroskopische Aufnahmen von dynamischen biologischen Phänomene in Raum und Zeit mit zellulären Auflösung. Jedoch kann die traditionelle Methode der Agarose Kapselung für live Imaging Larvalentwicklung und Gewebe nachwachsen behindern. Daher beschreibt die Handschrift der zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die wurde entworfen und hergestellt als funktional unterteilte Gerät Larven für hochauflösende Mikroskopie und erlaubt zu orientieren Schwanzflosse Durchtrennung im Gerät und anschließende hemmungslos Schweif Entwicklung und nachwachsen. Dieses Gerät ermöglicht eine Verwundung und langfristige Bildgebung unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Angesichts der Tatsache, dass die zWEDGI Form 3D gedruckt, die Anpassbarkeit der Geometrien machen es leicht modifiziert für diverse Zebrafisch-imaging-Anwendungen. Darüber hinaus bietet die zWEDGI zahlreiche Vorteile, wie z. B. Zugriff auf die Larve während Experimente für verletzte oder für die Anwendung von Reagenzien, Ausrichtung der mehrere Larven für optimierte Bildgebung und Wiederverwendbarkeit des Geräts parallel geschaltet.
Introduction
Die Regenerationsfähigkeit der Zebrafischlarven Danio Rerio machen sie eine ideale Modellorganismus für Wunde Reaktion sowie Heilung und nachwachsen1,2,3,4zu prüfen. Zugriff auf ein Array von transgenen Zebrafisch Linien und Zebrafisch anatomische Transparenz weiter erhöhen ihre Nützlichkeit für in Vivo Studien der Wunde Antwort Veranstaltungen sowie längerfristige Regenerationsprozesse4. Studie dieser biologischen Prozesse mit Hilfe hochauflösender Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie daher verlangt ein live imaging Zebrafisch-Gerät, das ermöglicht eine hohe Stabilität und nur minimale Bewegungen von Zebrafisch-Larven unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Es ist wichtig, dass das Gerät ermöglicht eine effektive Verwundung und Heilung und Regeneration stattfinden unberührt vom Gerät.
Die standard live imaging Stabilisierungsmethode der Einbettung der Larve in Agarose während der live Aufnahme schränkt Wachstum und Regeneration5 gewickelt und Sterberaten erhöhen kann, da Larven beginnen, um Zeichen der kardiale Stress und Gewebe Nekrose nach vier Stunden-4. Daher entfernen von Agarose aus Regionen von Interesse ist oft notwendig um normale Entwicklung zu ermöglichen und Regeneration6, Freilegung der Larven, um mögliche Schäden als die Agarose wird weggeschnitten. Darüber hinaus muss die Agarose Einbettung Technik, der Benutzer orientieren die Larven in der kurzen Zeit bevor die Agarose5,6,7erstarrt. Schnell manipulieren die Larve erfordert nicht nur Geschick des Benutzers, damit riskiert auch Schäden an der Larve. Obwohl Methoden zur Stabilisierung der Larve für live Imaging beschrieben worden sind, um diese Nachteile, wie z. B. geriffelte Agar Brunnen3 oder Unebenheiten8, umgehen die Verwendung von Silikon Vakuum einfetten erstelle ich eine bildgebende Kammer mit PVC-Rohre oder andere Materialien6und rotatorischen Schlauch9, viele dieser Methoden sind intensive, unordentlich, oft Einweg-labor und Umwelt Manipulation ermöglichen nicht (medikamentöse Behandlungen, verwunden etc..) nach der Montage der Fische.
Deshalb wurde das zWEDGI-Gerät (Abbildung 1) entworfen, um einige der Nachteile des Nährbodens für langfristige live Aufnahmen von Zebrafischlarven während der Manipulation der Probe bei schönem Montage zu überwinden. Die zWEDGI besteht aus drei halboffene unterteilte Kammern (Abbildung 1A) erlauben zum Laden, Zurückhaltung, Verwundung und Bildgebung von 2 bis 4 Tage nach Befruchtung Zebrafisch-Larven. Das Gerät ist hergestellt aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und auf das Deckglas ein 60 mm unten bildgebenden Glasschale gelegt. Der hier vorgestellte Entwurf für heilende Wunde Studien bestimmt war, jedoch die Verwendung eines modularen Design und standard Fertigungstechnologien machen das zWEDGI Design veränderbar und offen für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, vor allem für Verfahren, die erfordert minimale Zurückhaltung mit experimentelle Manipulation und langfristige Bildgebung.
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Protocol
Hinweis: das base zWEDGI Design für Zebrafischlarven, die 2 bis 4 Tage nach Befruchtung (Dpf) und befolgen Sie die Richtlinien der Universität von Wisconsin-Madison Forschung Tiere Resource Center formuliert wurde.
1. Design und 3D Druck von Formen
- Modell der PDMS-Komponente des Gerätes mit gewünschten Geometrien und Attribute in einem 3D modeling Software 5. Erstellen Sie eine Assembly eine leere Form und der PDMS-Teil und generieren Sie eine Negativform für PDMS-Teil durch die Schaffung eines Hohlraums in der Form entsprechend der PDSM Teil. Speichern Sie die Form als STL-Datei für den 3D-Druck ( Abbildung 2, Schritt 1.1).
Hinweis: Eine Stereolithographie (STL) Formatdatei der hier vorgestellten Werkzeugkonstruktion ( Abbildung 1) steht zum Download unter https://morgridge.org/designs/. - Print-Formen mit einem Photopolymer 3D-Drucker ( Bild 2, Schritt 1.2). Machen mehrere Formen in einem einzigen Druck, wenn möglich, also mehr als ein Gerät kann mit einem Batch von PDMS geformt werden.
Hinweis: Das gezeigte Beispiel wurde mit einer 0,075 mm Breite Durchmesser und 0,05 mm Schichtdicke, mittels Photopolymer Harz 5 in Hi-Res Modus gedruckt.- Sauber Formen mit einem feinen Pinsel Spiritus in eine Sprühflasche und Druckluft zu sanft schrubben und ungehärtetem Harz zu entfernen. Entfernen Sie jegliches Material aus den Regionen Microchannel.
- Post-heilen die Formen in einem UV Post Heilung Apparat für 60 min. auf jeder Seite, wie noch nicht ausgehärteten Rücktritt giftig für Zebrafisch-Larven- 10 ist.
- Sand die Kavitätsseite der Form mit 200 Schleifpapier auf eine Ebene Fläche, bis die Dichtflächen in Kontakt mit dem Schleifpapier (Laden von Kanal-Geometrien und Schimmel Perimeter) sind. Versanden Sie mit 400 bis 600 Grit Sand Papier, schrittweise, um glatte Oberflächen bündig über alle Geometrie-Deckschichten ( Bild 2, Schritt 1.3) zu produzieren. Messen Sie die Tiefe der Kavität nach dem Schleifen mit einer Messuhr zu überprüfen, ob es in der Nähe der gestalteten Tiefe ist.
- Reinigen Sie Formen und Scheiben (1 ¾ Zoll Durchmesser x ¼ Zoll dicken Borosilikat-Glas oder Acryl, ein Glas pro Form decken) zu decken, indem man in ein Ultraschall Reiniger mit Wasser für 30 min gefüllt oder durch Spülen unter fließendem Wasser.
- Mit Druckluft Trockenblasen und reinigen Sie beide Formen und deckt mit Isopropyl-Alkohol und gefilterte Druckluft. Verwenden Sie einen sauberen Werkbank als einen Ort, um die Geräte zur Minimierung von Verunreinigungen in der Luft Schutt zu fabrizieren. Lassen Sie das gereinigte Formen und das Glas erstreckt sich in der sauberen Werkbank oder einer überdachten Petrischale bis benötigt.
2. PDMS-Herstellung von zWEDGI Gerät
- machen die PDMS durch strömenden 184 Silikon Elastomer Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem Verhältnis von 5:1 (Basis, Aktivator) in einem Plastikbecher. Mischen Sie 2 min. lang mit einem Holz Handwerk Stock, das Gel über auf sich selbst, wie Brot kneten rühren. Verwenden Sie für 5 Werkzeuge 10 g Base und 2 g des Aktivators.
- De-Gas-Gemisch in einem Vakuum Exsikkator für 25-45 min bis alle Bläschen verschwunden sind.
- Füllen Sie den Hohlraum der einzelnen 3D gedruckten Formen mit etwa 0,75 mL PDMS mit einer 10mL Spritze, bis die Form leicht mit einem Meniskus ( Bild 2, Schritt 2.1) überläuft.
- De-Gas gefüllten Formen für 45 min um zusätzliche Luftblasen zu entfernen, die beim Befüllen gebildet haben kann.
- Anwenden einer Glasscheibe Abdeckung oben auf dem PDMS-gefüllte Schimmel, die Disc in einem Winkel zu verhindern, dass Luftblasen drücken ( Abbildung 2, Schritt 2.2) gefangen. Können überschüssige PDMS vertrieben werden, wie die Glasabdeckung der Scheibe anliegt.
- Einsatz kleine Ratsche Klammer an die Cover-CD mit der Form festzuhalten.
Hinweis: Dies erstellt eine flache Oberfläche, sobald die PDMS geheilt ist und durch Löcher produziert, wo die gedruckten 3D-Geometrien bündig mit dem Glas-Deckglas sind. Alternativ, um die Anzahl der Geräte zu erhöhen, die gleichzeitig geheilt werden kann, Erstellen einer Multi-Clamp-Gerät (zB. Abbildung 2, Schritt 2.3). - Heilen das PDMS-Gerät in den eingespannten Formen bei 100 o C in einem Ofen für 90 min ( Bild 2, Schritt 2.4). Nehmen Sie die Formen aus dem Ofen und abkühlen lassen bis sie leicht gehandhabt werden können. Wenn die Klemmvorrichtung Metall ist, entfernen die Schimmel und Abdeckung Disc-Montage aus der Klemme zu verhindern, dass das Metall weiterhin die PDMS durch Restwärme zu heilen.
Hinweis: Das Gerät ist am einfachsten, aus der Form entfernen, während noch leicht warm und nicht vollständig ausgehärtet. Jedoch sobald die Form aus dem Ofen entfernt ist und die Cover-CD entfernt, kann das Gerät für ein paar Tage vor der Entformung sitzen. Wenn das Gerät kurz nach dem Entfernen aus dem Räucherofen auszuschmelzen ist, legen Sie sie in einer bedeckten Petrischale, Verunreinigungen zu minimieren und ermöglicht es, vollständig zu heilen.
3. Plasma-Bonding zWEDGI, Glasschale
- Klemme die Form mit dem PDMS-Gerät in einen Schraubstock so dass die Form ' s Geometrien stehen oben, parallel zum Bahnhof Arbeitstisch.
- Start, PDMS-Gerät durch die Freigabe der PDMS-Lasche aus der Form mit flachen Spitzen Pinzette zu entfernen. Arbeit rund um den Rand der Form mit der Pinzette (wie einen Kuchen aus der Pfanne ( Abb. 2, Schritt 3.1) entfernen).
- Gefiltert verwenden Druckluft und Pinzette, um das Gerät aus der Form ziehen vorsichtig durch Festhalten an der Lasche und Einblasen von Luft unter das Gerät. Arbeiten Sie langsam, so dass die Luft dazu separate PDMS aus der Form, die besondere Pflege mit den Spitzen der Pinzette rund um den dünnen Tunnelabschnitte.
- Stellen Sie das Gerät PDMS kopfüber auf der Innenseite des Deckels eine Glasschale Talsohle, so dass die zurückhaltende Tunnel Keile Kunststoff ( Abbildung 2, Schritt 3.2) berührt werden.
- Deckel Schale mit Kopf zWEDGI und den entsprechenden Boden Glasschale in ein Plasma Reiniger mit dem inneren Glas nach oben ( Bild 2, Schritt 3.3).
- Evakuieren das Plasma Reinigung Kammer, bis der Druck 500 mTorr erreicht.
- Set Radiofrequenz (RF) Leistung zu hoch. Setzen Sie das Gerät und das Gericht für RF-Frequenz für ca. 2 min. langsam de-Kammer unter Druck zu setzen und ein Reinraum-Haube das Gerät und die Schale wieder.
- Das PDMS-Gerät aus Gericht Abdeckung entfernen. Umdrehen Sie der PDMS-zWEDGI auf die richtige Orientierung auf dem Glas positioniert es vorsichtig auf das Zentrum auch der untere Glasschale ( Abbildung 2, Schritt 3.4)
- mit dem Back-End der Pinzette, drücken Sie leicht auf die PDMS Gerät, um Luftblasen zu gewährleisten sind nicht unter gefangen. Üben Sie Druck auf die Minuten Geometrien der Mikrokanäle und glätten die PDMS an den Rändern ( Abbildung 5).
Hinweis: Vollständige Kontakt zwischen dem PDMS und Glas sorgt für bessere Einhaltung von Plasma kleben. Das zWEDGI Gerät kann Plasma auf andere Glasboden Schale Formate, wie ein Glasboden 6-Well Plat verklebt sein.e ( Abbildung 2). - Legen Sie eine Abdeckung über das Gerät Gericht vor dem Entfernen von der Reinraum-Motorhaube.
Hinweis: Nachdem die Geräte auf Glas befestigt wurde, das Protokoll kann angehalten werden bis sie einsatzbereit sind.
- mit dem Back-End der Pinzette, drücken Sie leicht auf die PDMS Gerät, um Luftblasen zu gewährleisten sind nicht unter gefangen. Üben Sie Druck auf die Minuten Geometrien der Mikrokanäle und glätten die PDMS an den Rändern ( Abbildung 5).
4. Channel-Vorbereitung und laden Larven
Hinweis: General Zebrafish Tierhaltung war pro The Zebrafish Buch online bei http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html durchgeführt. Erwachsenen Zebrafisch und Embryonen wurden beibehalten, wie zuvor beschrieben 1. Verwendet wurde der Wildtyp AB Stamm. Folgen Sie die Institution ’ s Animal Care Protokoll für Besonderheiten in Bezug auf Anforderungen für imaging-live Larven.
- Spülen tunnel die Kanäle mit einem Minimum von 100 µL 70 % Ethanol pro Kanal, mit einer Mikropipette, um durch die einstweilige Verfügung zu spülen. Entfernen Sie Ethanol und 2 oder 3 Mal mit doppelt destilliertem Wasser spülen. An der Luft trocknen.
- Füllen Sie die Kanäle mit Magermilch (in einer Konzentration von 1 % mit Wasser verdünnt) für 10 min bei Raumtemperatur, Einhaltung der Larven der Glas-Deckglas des Gerichtes zu minimieren. Dann tauchen Sie sanft das Gerät mehrmals in doppelt destilliertem Wasser zu spülen. Lassen Sie an der Luft trocknen kopfüber.
Hinweis: Protokoll kann hier angehalten werden. Diese Vorbereitung der zWEDGI Gerät kann mehrere Tage vor dem Gebrauch erfolgen. Shop bei Raumtemperatur abgedeckt. - Vorbereiten 1 % niedrig schmelzenden Punkt (LMP) Agarose durch die Kombination von 100 µL 2 % geschmolzen LMP Agarose mit 100 µL 2 X Tricaine (0,4 mg/mL Tricaine - Ethyl-3-Aminobenzoate) in E3 Puffer 11, 38 o c vorgewärmt halten die 1 % Agarose/Tricaine Lösung bei 38 o C in einem heißen Block verhindern gelling.
Hinweis: Für multiphoton Mikroskopie 11, benutzen Sie entweder UN-pigmentierten Zebrafisch-Varianten (z. B. Casper 12) oder pflegen Sie Larven in E3 mit 0,2 mM N-Phenylthiocarbamid Pigmentbildung verhindern 11, Aufnahme der in der Nähe von Infrarot-Wellenlängen durch das Pigment zu minimieren.
Achtung: N-Phenylthiocarbamid ist giftig. Folgen Sie die Institution ' s Regeln zur Verfügung. - Anesthetize Larven in E3 Puffern mit 0,2 mg/mL Tricaine (Tricaine/E3) 11. Warten Sie, bis die Larven unbeweglich und nicht mehr reagiert auf einen Reiz Touch sind.
- Vornässen der Kanäle mit wenige Mikroliter der Tricaine/E3.
- Pick up eine einzelne Larve mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze. Hinterlegen Sie die Larven in den Laden-Kanal ( Abb. 3A). Mit einer Pipettenspitze oder ähnliches Werkzeug, die Larve in den Füllraum orientieren, so dass die dorsalen Seitenflächen geraderen Rand der Füllraum und die Rute Flächen in Richtung der zurückhaltende Tunnel ( Abb. 3 b).
- Hat die Verwundung Kammer, so dass die Larve in den dämpfenden Tunnel ( Abbildung 3) fließen sorgfältig Flüssigkeit entziehen. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit und gleichzeitig Feuchtigkeit rund um die Larve ( Abbildung 3D). Dieser Prozess kann durch Kippen der Schale leicht in Richtung der Verwundung Kammer unterstützt werden.
- Tricaine/E3 1 % LMP Agarose entgegenbringen (~ 38 o C) über die Larve ' Kopf, füllen die Ladekammer ( Abbildung 3E). Lassen Sie Agarose mit der Larve in der richtigen Position zu festigen. Der verletzte Kammer fügen Sie Tricaine/E3 wie notwendig, um die Flüssigkeitszufuhr zu halten hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen 2 Kanäle laden.
- Mit Hilfe einer Spritzennadel entfernen Sie vorsichtig alle Agarose, die sickerte durch die zurückhaltende Tunnel in der Verwundung Kammer ( Abbildung 3F). Fügen Sie zusätzliche Tricaine/E3 entweder nur über die Agarose (für Verwundung, kurzfristige Bildgebung oder Wunde Behandlung Isolation) oder der Kulturschale (für langfristige Imaging) zu füllen. Den Deckel Kultur Gericht um Verdunstung zu verhindern. Larven können an dieser Stelle (unverletzt) abgebildet oder verletzt.
5. Verletzte und Imaging Larven
- mit einem sterilen Skalpellklinge Transekt der Schwanzflosse posterior der Chorda- 11 in der Verwundung Kammer ( Abbildung 3 G, H). Bei Bedarf zusätzliche Tricaine/E3 hinzufügen und den Kultur-Schüssel Deckel.
Hinweis: Alternativ je nach Fenster Entwicklungszeit von Interesse, Larven können werden verwundet, durfte in E3 zu erholen und in einem Inkubator (28,5 o C) beibehalten, bis die gewünschte bildgebenden Zeit, an welcher, die Stelle sie in Kanäle als geladen werden können oben beschriebene. - Installieren Sie das zWEDGI-Gerät mit narkotisierten Larven auf einem inversen Mikroskop in einem Stadium-Einsatz, der die Glasschale unten 60 mm beherbergen wird. Suchen Sie Ende der Larve in den obersten Kanal, die Schüssel drehen, wie notwendig, um das Heck in die gewünschte Position zu bekommen. Je nach Bedarf für das spezifische Experiment Bild.
Hinweis: Die zWEDGI ist breit anwendbar für hochauflösenden Lichtmikroskopie, einschließlich Weitfeld Fluoreszenz und Laser-scanning-Mikroskopie. Gibt es eine Reihe von Überlegungen der Parameter beim Zebrafischlarven abbilden, sondern spezifisch imaging-Parameter sind Instrument, Probe und Experiment angewiesen. Hier war das Larvenstadium Heck auf eine benutzerdefinierte Build multiphoton Mikroskop 5 , 11 unter Verwendung der folgenden Parameter abgebildet: 40 X lange arbeiten Abstand Wasser eintauchen Ziel, 890 nm Laseranregung 445/20 nm Emission Filter und Auflösung von 512 x 512.
6. Ende des Experiments
- entfernen das zWEDGI Gericht aus Mikroskop. Einschläfern der Larven durch die Platzierung der zWEDGI, ein Eis-Wasserbad oder auf 4 o C für mindestens 20 Minuten und für das Fehlen von Herzschlag und Kreislauf beurteilen.
Hinweis: Da die Larven in getrennten Fächern gepflegt werden, können die Larven einzeln wiederhergestellt werden durch leichtes Ziehen auf Agar mit Zange oder Pipette. Agar aus den Kopfbereich und die Larve für zusätzliche Verfahren, wie z. B. Fixierung für Antikörper Färbung verwendet oder verarbeitet für RNS oder Protein Extraktion entfernt werden kann. - Nach Entfernen der Larven und Agar, reinigen Sie die zWEDGI mit Ethanol und destilliertem Wasser, wie unter Punkt 4.1 beschrieben und kopfüber an der Luft trocken. Geschäft abgedeckt an einem kühlen, trockenen Ort. Neu beschichten mit Magermilch (Schritt 4.2) vor dem nächsten Gebrauch Bedarf.
Hinweis: zWEDGIs können wiederverwendet werden mehrere Male, bis die PDMS fängt an, Weg von dem Glas kommen.
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Representative Results
Die zWEDGI PDMS mikrofluidischen Gerät ist funktionell unterteilte entwickelt, um vier Hauptfunktionen (siehe unten) verbunden mit live-Bildgebung der Schwanzflosse Verwundung heilen und nachwachsen im Zebrafischlarven aufnehmen. PDMS wurde für die Fertigung von zWEDGI gewählt, weil es nicht nur leicht zugänglich ist und eine Industrie-standard für Biokompatibilität, sondern auch in Formen gut funktioniert. Darüber hinaus macht PDMS das Gerät wieder verwendbare und leer von harten oder scharfen Kanten, sobald das Gerät gebildet wird. Die zWEDGI ermöglicht speziell (1) das Laden der Larven in das Gerät, 2) Zurückhaltung bei richtigen Orientierung für imaging, (3) verletzt der Schwanzflosse, und (4) mikroskopische Bildgebung im Detail unten beschrieben.
Laden
Das zWEDGI-Design besteht aus 3 Kanäle, jeweils eine Larve (Abbildung 1 b) zurückhalten soll. Be- und erste Orientierungshilfen für die Larve ist die offene Ladekammer 3 mm breit (Abbildung 1A), eine große Öffnung Pipettenspitze für die Hinterlegung einer Larve (Abbildung 3A) unterzubringen. Darüber hinaus bieten die Länge und Breite ausreichend Platz um nachträgliche Manipulation der Larve in die richtige Ausrichtung, Schwanz in Richtung der zurückhaltende Tunnel und Dorsalseite nach oben (Abb. 3 b) zu ermöglichen.
Zurückhaltung
Sobald die Larve in den Kanal geladen wurde, kann gezeichnete Heck-zuerst in den dämpfenden Tunnel durch Entfernen von Flüssigkeit aus der Verwundung Kammer oder sanft schubsen mit einer Pipettenspitze oder ähnliches Werkzeug (Abbildung 3) einrasten. Die trichterförmigen Geometrie der Füllraum (Abbildung 1A), von 3 mm bis 0,45 mm führt die Larve in seitliche Ausrichtung (Abbildung 3). Die Ausrichtung der Larve auf seiner Seite hemmt die Rute etwa parallel zu den Glasboden des Gerichtes für verbesserte Bildgebung. Im Gegensatz zu mikrofluidischen Geräten mit Silizium-Wafer hergestellt erforderlich die Geometrien der 3D gedruckten Formen nicht konsistent in Z-Richtung. Daher ist der zurückhaltende Tunnel bedeckt und konisch in der z-Achse, so dass die Einstiegshöhe größer als die Ausfahrt von 0,5 mm bis 0,3 mm Höhe (Abb. 1 b, isometrische Ansicht des Tunnels ist). Diese Verjüngung erleichtert die Leitung von der Larve und Abflachung der Schwanz auf dem Deckglas imaging Oberfläche. Diese Funktionalität eliminiert die Notwendigkeit für den Benutzer, das Präparat zu orientieren, während Agarose Härten ist.
Flüssigkeit wird aus dem Füllraum (Abbildung 3D) entfernt und wird ersetzt mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose, stabilisieren den Kopf in den Kanal, während das Heck hemmungslos im Puffer in der Verwundung Kammer (Abbildung 3E) beibehalten wird. Die minimale Agarose, die durch den mäßigenden Tunnel austreten kann kann der verletzte Kammer (Abbildung 3F) leicht entfernt werden. Das Fehlen von Agarose in der Verwundung Kammer ermöglicht hemmungslos nachwachsen und Entwicklung der Schwanzflosse5.
Verwundung
Sobald die Larve durch den Tunnel und den Kopf von Agarose zurückgehalten geladen wurde, steht die Schwanzflosse Durchtrennung weil es in die Verwundung Kammer ragt. Die Halbkreis verletzte Kammer ist 1,9 mm horizontale Symmetrie versetzt. Dies ermöglicht der Skalpellklinge oberhalb der Schwanzflosse, so dass ausreichend Platz für die Klinge nach unten über den Schweif, vor der Schwanzflosse (Abbildung 3) gezeichnet werden eingefügt werden soll. Der breiteste Teil des Halbkreises 7 mm Durchmesser tritt auf, wo die Rute verwundet ist, diesen Antrag unterzubringen. Zusätzlich ermöglicht dem Benutzer, die Larve Wunde, bietet dieses unterteilte Design die Möglichkeit für regionale Anwendung der Verbindungen zu den Schweif Region5. Diese einzigartige Eigenschaft der semi-Isolation würde ermöglichen lokalisierte Prüfung der Auswirkungen von verschiedenen Drogen, Chemikalien oder biologische Arbeitsstoffe auf die Wundheilung.
Bildgebung
Das zWEDGI-Gerät soll hohen Auflösung ermöglichen Licht Mikroskopie Bildgebung der Zebrafisch Schwanzflosse, ungehindert durch das Einbetten von Agarose. Aus diesem Grund ist das PDMS-Gerät mit einer handelsüblichen unten Glasschale, um eine optische Qualität Oberfläche für die Mikroskopie mit hohen NA-Objektive verbunden. Hier präsentieren wir Ihnen Bilder mit multiphoton Mikroskopie für die zweite harmonische (SHG) Bildgebung der Kollagenfasern in der Schwanzflosse um zu imaging-Funktionen von der zWEDGI zu veranschaulichen. Allerdings kann die zWEDGI zu anderen Methoden der Lichtmikroskopie, wie konfokale Mikroskopie, unter Verwendung einer inversen Mikroskop Bühne Konfiguration angewendet werden. Mit der zWEDGI, im Gegensatz zur Methode der Agarose Einbettung mit nachträgliche Entfernung kann der Schwanzflosse leicht in das Gerät vor Verwundung (Abb. 4A), verwundet im Inneren des Gerätes, dann sofort zurück an das Mikroskop für Post-Wunde abgebildet werden Bildgebung (Abbildung 4 b-E). Bisherige Arbeit identifiziert, Änderungen in der Kollagen Fasern Organisation während des Heilungsprozesses der Wunde mit SHG. 13 SHG kann verwendet werden, um bestimmte Arten von geordneten Strukturen, einschließlich fibrillären Kollagen, ohne den Einsatz von exogenen Etiketten zu erkennen. 14 Bild Qualität der lebenden kaudalen flossen in die zWEDGI abgebildet ähnlich zu denen war, die in festen Gewebe5 aber die zWEDGI bietet eine Reihe von Vorteilen. Vor allem können die Schwanzflosse Heilung und nachwachsen ungehindert durch Agarose Einbettung mit Larven Überleben ähnlich wie Larven gewachsen hemmungslos5fortfahren. Weiter, da die Verwundung durchgeführt werden, kann während der Larve im Gerät befindet, können Pre- und Post-verletzte Bilder auf der gleichen Schwanzflosse (Abb. 4A) gesammelt werden. Die zWEDGI ermöglicht die Sammlung von 3 dimensionalen Daten im Laufe der Zeit bietet eine umfassendere Sicht der dynamischen Veränderungen in der Struktur der extrazellulären Matrix (Abbildung 4 b). Das hier abgebildete folgt der SHG Faser gewickelt Entspannung in 3 Dimensionen, Verwundung innerhalb der zWEDGI. Vor Verwundung, erkannten die SHG Kollagenfasern strahlenförmig nach außen von der Chorda bis zur Fin-Spitze (Abbildung 4A). Kurz nach der Verwundung der Abstand zwischen Spitze der vertraglich vereinbarten Flosse und Zentrum der the Fin steigt mit der Wunde Entspannung. Die 3D Art der Datenerhebung erlaubt die räumliche Rekonstruktion mit Rendering-Software wie Imaris. Diese Rekonstruktionen und die anschließende Drehung Optionen veranschaulichen die Kontraktion und Entspannung der Finne tritt nicht nur in der X-y-Ebene des Bild-Sammlung (Abbildung 4 B, C, D), sondern auch in der Z-Achse (Abbildung 4 G-J, L-O, Q-T; Zusätzliche Filme 1, 2) Da das Heck aus der nach oben locken von den vertraglich vereinbarten Zustand abflacht. Die zWEDGI kann mit anderen bildgebenden Modalitäten über längere Zeiträume, wie z. B. die Verwendung der konfokalen Mikroskopie Bild Neuronen während der Schwanzflosse Entwicklung über 24 h5verwendet werden. Weil gleichzeitig zurückhaltende Geräteeinheiten somit entfällt die Notwendigkeit aufgereiht sind, das Gerät zu drehen, wenn die Larven suchen das Mikroskop einrichten und wechseln zwischen mehreren Probe für die Bildgebung ist unkompliziert und kann automatisiert werden, um zu sammeln Time-Lapse Bilddaten von mehreren Larven. Erweitern Sie die Anzahl der Samples, die abgebildet werden können, kann das PDMS zWEDGI Gerät in andere Glasboden-Formate, wie z. B. eine 6-Well-Platte (Abbildung 2) platziert werden.
Abbildung 1 : Endgültige Design Schaltplan (A) Schaltplan zeigt allgemeine Layout und Messungen des zWEDGI Gerätes, Hervorhebung Terminologie der funktional unterteilte Kammern. (B) isometrische Ansicht der PDMS-Gerät aus der Form genommen. (C) sehen Sie Tunnel, Hervorhebung der Änderung im Eingang und Ausgang Höhen. (D) Modell der Larve im Gerät zurückgehalten. Abbildung modifiziert aus einer zuvor veröffentlichen Artikel5 mit Nachdruck Erlaubnis von Zebrafisch -Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Fertigung Schaltplan (A) Schritt 1 beginnt beim Design der Form Gerät in ein 3D Modellierungssoftware (1.1), der dann 3D gedruckte (1.2). Die Formen sind UV-Licht ausgehärtet und dann geschliffen und gereinigt, so dass die erhöhten Geometrien auch Höhe (1.3). Schritt 2 wird gemischt und entgast PDMS (2.1) die Formen einfüllen und das Anwenden einer Glasscheibe über den Schimmel an einer Schräge, Trapping Luftblasen in das Gerät PDMS (2.2) zu verhindern. Das Glas und Werkzeug eingespannt sind zusammen (2.3) für die Heilung im Ofen bei 100oC für mindestens eine Stunde (2,4). Schritt 3 verwendet gefilterte Luft und flachen Spitzen Pinzette entfernen des PDMS-Geräts aus der Form (3.1). Das Gerät befindet sich dann auf der Oberseite der bildgebenden Schüssel Deckel (3.2) und Plasma behandelt (3.3), zusammen mit der Glasboden ermöglicht die PDMS, untere Glasschale (3.4) einzuhalten ist. (B) das fertige zWEDGI Gerät gebunden in eine Glasschale unten und bildgebenden einsatzbereit. (C) mehrere zWEDGI Geräte können in einem Glas unten 6-Well-Platte platziert werden, um viele Larven im gleichen Experiment Bild. Abbildung modifiziert aus einer zuvor veröffentlichen Artikel5 mit Nachdruck Erlaubnis von Zebrafisch -Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Be- und Verwundung der Larve in zWEDGI (A) Eine Larve wird in den Füllraum mit einer weiten Öffnung Pipette geladen. (B) die Larve orientiert sich mit der dorsalen Seite gegen den flachen Teil des Ladens Kammer-Trichter und Rute in Richtung der zurückhaltende Tunnel. (C) mit Absaugung aus der Pipettenspitze statt am Eingang der Verwundung Kammer, die Larve in den Tunnel, indem sie in der richtigen Orientierung für die Bildgebung gezeichnet wird. (D) die Ladekammer zu ermöglichen (E) die Zugabe von Agarose rund um den Kopfbereich, die Larve zu stabilisieren wird Flüssigkeit entzogen. Agarose ist rot gefärbt hier nur zu Demonstrationszwecken. Minimale Agarose Lecks in die Verwundung Kammer und kann leicht entfernt werden, wie in (F) dargestellt. (G) um Wunde sobald die Larve in den Kanal zurückgehalten wird, einer Skalpellklinge eingefügt über die Larve und schrammte nach unten über die Schwanzflosse, posterior, der Chorda. (H) die Larve ist nun bereit für die Post-Wunde Bildgebung. Skala bar (A-H) = 1 mm; Skalieren Sie Bügel (F) = 1 mm; Skala bar (G) = 1 mm. Abbildung modifiziert aus: ein zuvor veröffentlichen Artikel5 mit Nachdruck Erlaubnis von Zebrafisch -Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : 3D multiphoton Zeitraffer imaging der SHG Fasern in der Zebrafisch Schwanzflosse, Pre- und Post-Verwundung, in der zWEDGI. Das zWEDGI Design bietet die Möglichkeit für hochauflösende Bildgebung, in diesem Fall der SHG-Faser-Organisation vor (Pre-Wunde) und kaudalen nach fin Durchtrennung (Post-Wunde). Daten wurden als Z-Stapel in 4 min Abständen erhoben. (A-E) zeigt die SHG der Fasern in der Schwanzflosse als Projektion der Z-Stapel, vor und bei vier Intervalle nach Durchtrennung. Z-Projektion erfolgte mittels ImageJ-Software. 15 t = 0 war der Beginn der Bildgebung, ca. 20 min nach Durchtrennung. Die doppelte Pfeile zeigen die Zunahme der Abstand von der Spitze der Wunde Schneide (kurze weiße Linie) relativ zum Speicherort der Chorda (lange weiße Linie) während der Entspannung der Wunde nach der ersten Kontraktion. (F-J). Geneigte 3D-Rekonstruktion der Originaldaten. (K-O). Oberfläche Rendern der gekippten 3D Rekonstruktion gezeigt in F-J. (P-T). Seitenansicht des 3D-Rekonstruktion Oberfläche Rendering, illustrieren, wie die Kontraktion und Entspannung im 3-dimensionalen Raum auftreten, die mit diesen Daten beurteilt werden kann mittels der zWEDGI wo die Schwanzflosse nicht durch Agarose eingeschränkt erhoben. Skala bar (A-E) = 100 µm; Skala bar (F-T) =100 µm. 3D Renderings wurden mit imaging-Software durchgeführt. Siehe auch ergänzende Filme 1 und 2. Abbildung modifiziert aus einer zuvor veröffentlichen Artikel5 mit Nachdruck Erlaubnis von Zebrafisch -Journal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Wichtige Schritte der Herstellung (A) zWEDGI Um sicherzustellen keinerlei Bläschen oder gefangen in das Gerät beim Spannen auf die Glasscheibe, Entgasen, nachdem PDMS in die Formen gefüllt worden ist und das Spannmittel Glas schräg, wenn Sie es auf die PDMS in der Form anwenden. Darüber hinaus sind die Oberflächen der Geometrien "Flashen" PDMS verhindern, über den Laden und Verwundung Kammern, stellen Sie sicher, auf der Oberseite des Gerätes gründlich darauf sand bündig, beim Spannen auf dem Glas. (B) wenn das Gerät ausreichend im Ofen ausgehärtet ist, zeigen Lufteinschlüsse zwischen dem PDMS und Schimmel, dass das Gerät leicht zu entfernen sein wird. Wenn das Gerät nicht einfach entfernen, es ist sehr wahrscheinlich durch unzureichende Heilung Zeit oder Temperatur oder der Form selbst war nicht ausreichend UV-härtenden, wodurch restliche Harz Kontamination von der PDMS. Üben Sie (C) wenn das Gerät auf die untere Glasschale nach Plasmabehandlung anwenden, leichten Druck mit dem Backend Pinzette, beginnend bei den Tunnel-Regionen und arbeiten nach außen zum Rand des Geräts. Wenn das Gerät nicht gut, wie durch Lufteinschlüsse zwischen dem Gerät und dem Glas Verklebung verlängern Sie den Zeitraum in der Plasma-Bonder und sicherzustellen Sie, dass kein Staub zwischen die PDMS und Glas-Oberfläche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Film 1: Tilted Oberfläche 3D-Rendering multiphoton Zeit Zeitraffer Bilder der SHG Fasern in der Schwanzflosse während Entspannung nach Verwundung. Die SHG der Fasern in der Schwanzflosse abgebildet als Zstacks im Laufe der Zeit nach der Verwundung (Beginn der Film ist etwa 20 min nach Verwundung) in der zWEDGI. Z-Stacks wurden rekonstruiert und Oberfläche mit imaging-Software gerendert. Heck gekippt, um Dreidimensionalität zu zeigen. Anterior ist auf der linken Seite. Film entspricht Standbildern in Abbildung 4 (K-O). Maßstabsleiste = 50 Mikrometer. Bitte klicken Sie hier um den Film herunterzuladen.
Ergänzende Movie 2: Seitenansicht der Oberfläche 3D-Rendering multiphoton Zeit Zeitraffer Bilder der SHG Fasern in der Schwanzflosse während Entspannung nach Verwundung. Die SHG der Fasern in der Schwanzflosse abgebildet als Zstacks im Laufe der Zeit nach der Verwundung (Beginn der Film ist etwa 20 min nach Verwundung) in der zWEDGI. Z-Stacks wurden rekonstruiert und Oberfläche mit imaging-Software gerendert. Seitenansicht gezeigt, um die Erfassung von dynamischen Veränderungen in der z-Achse zu betonen. Anterior ist auf der linken Seite. Film entspricht Standbildern in Abbildung 4 (P-T). Maßstabsleiste = 40 Mikrometer. Bitte klicken Sie hier um den Film herunterzuladen.
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Discussion
Das zWEDGI-Gerät soll 3D Zeitraffer imaging zu stabilisieren und den Fisch in kleine Arbeitsabstand von einem hochauflösenden Mikroskop Ziel orientieren zu erfassen. Während diese Designspezifikationen erfüllt, ist es auch eine Verbesserung gegenüber traditionellen Agar-Basis Vorbereitung für live Imaging. Es gibt drei wichtige Schritte (siehe unten) bei der Herstellung von zWEDGI, die, wenn man nicht richtig Defekte Geräte führen kann:
PDMS-Vorbereitung (Abb. 5A)
Um Luftblasen zu vermeiden, Entgasen Sie die Formen nach PDMS hinzugefügt wurde. Überprüfen Sie, dass alle Luftblasen nach Entgasung beseitigt und Sie besonders auf die Anwendung von der Glasscheibe achten. Die Glasscheibe muss angewendet werden, schräg um sicherzustellen, dass die Luft nicht unter und innerhalb der PDMS eingeschlossen ist. Staub kann ein Problem während die meisten Schritte des Prozesses sein. Um Staub zu verhindern, schließen Sie einen Reinigung Schritt gründlich und lagern Sie Teile in eine cleane Motorhaube zwischen den einzelnen Schritten. Überprüfen Sie Formen für überschüssiges Harz, das eine raue Oberfläche vor der UV-Härtung erstellen kann. Beim Schleifen, achten Sie darauf, dass Schleifpapier Kontakte an, die alle Geometrien um sicherzustellen, dass alle Oberflächen sind (Bild 2, Schritt 1.3) spülen. Immer sauber mit Isopropyl-Alkohol und direkt vor dem Füllen der Formen mit PDMS. Wenn die zusätzliche PDMS aus der Form zu quetschen, zu gewährleisten, die Klammern fest halten die Form und Glas-Abdeckung zusammen (Abb. 2, Schritt 2.3).
Entfernen von Gerät aus Form (Abb. 5 b)
Achten Sie darauf den Ofen beträgt mindestens 100 o C und die Aushärtungszeit beträgt mindestens 1-1,5 h. Wenn die PDMS nicht ausreichend ausgehärtet ist, kann es schwierig, aus der Form zu entfernen sein. Weitere Möglichkeiten für Fehler zu entfernen sind nicht mischen die PDMS Reagenzien lange genug, mit falschen Verhältnisse-Basis und härter oder übrig gebliebenen Harz bleibt in der Form nach 3D Drucken, die dann die PDMS verseucht. Bei der Entnahme aus dem Ofen zeigen Lufteinschlüsse zwischen dem Gerät und Werkzeug (Abb. 5 b), dass das Gerät leicht entfernt werden.
Einhaltung von PDMS Glasboden Schale (Abbildung 5)
Aus Staub, Fehlstellungen oder unzureichende Länge der Plasmabehandlung ergeben sich schlechte Einhaltung der Glasschale. Wenn Sie das Gerät auf das Glas zu platzieren, das Gericht in einem Winkel kippen und Zentrum der PDMS auf dem Glaskreis sicherstellen, dass es berührt nicht die Kanten des Brunnens. Wenn Gerät nicht hält, drücken Sie vorsichtig das Gerät auf die Glas-Slip mit Back-End der Pinzette, beginnend mit der zarten Tunnel-Region und nach außen bis an den Rand drücken. Wenn das Gerät noch nicht hält, experimentieren Sie, indem man die Zeit im Plasma Reiniger in Schritten von 1 Minute.
Während die Larven in das Gerät für kurze Zeiträume (Minuten) ohne die Verwendung von Agar, zum Zwecke der langfristigen Leben-Bildgebung der Schwanzflosse Region abgebildet werden können wird Agar auf den Kopf in den Füllraum gelegt, nachdem die Fische geladen wurde. Obwohl diese Anwendung des Nährbodens nicht beeinflussen die Wundheilung Reaktion oder Lebensfähigkeit der Larven5angezeigt wird, könnte dies die Studie mehr vorderen Regionen der Larven auswirken. Zwar haben wir in der Lage, Bild Larven für bis zu 60 h haben wir nicht geprüft, ob Rentabilität mit bildgebenden länger belastet würde. Darüber hinaus wurde das besondere Design hier vorgestellten für Alter 2 bis 4 Tage Post Düngung (Dpf) Larven liegen auf ihren Seiten für Heck Durchtrennung und Wundheilung Bildgebung optimiert. Anderen Entwicklungsstadien, Ausrichtungen und experimentelle Protokolle erfordern Änderungen am Design. Die vorsätzliche funktionalen Modularität des Designs macht es jedoch für derartige Veränderungen leicht zugänglich.
Darüber hinaus erfordert die Herstellung von diesem Gerät Zugang an einen 3D-Drucker mikrofluidischen Materialien und Geräte wie PDMS und ein Plasma Reiniger, potenziell begrenzen die Zugänglichkeit des Gerätes für einige Nutzer. Jedoch wurde diese Methode der Schimmel Herstellung gewählt, da 3D Druckfunktionen, zusammen mit Mikrofluidik Fertigung immer auf dem akademischen Campus häufiger sind. Darüber hinaus gibt es Service-Provider für 3D-Druck verfügbar, da die Technologie entwickelt sich rasant und die Kosten für Drucker verringert.
Angesichts seiner unterteilte Design und Funktionalität, bietet der zWEDGI Verbesserungen über die aktuelle Technik für Zeit verfallen Bildersammlung mit Agar einbetten. Erstens surround Agarose nicht die Tail-Region in zWEDGI, schönem Wundheilung und Regeneration für den Fortschritt hemmungslos während Überleben der Larven in die zWEDGI eingebettet und unembedded Kontrollen5vergleichbar ist. Zweitens ermöglicht die Verwendung von hochauflösenden 3D Druck, die Formen zu fabrizieren zWEDGI einzigartige schräge Geometrien, die Larve in drei Dimensionen in Bezug auf die Abbildungsebene zu orientieren haben. Dies entfernt die Zeitabhängigkeit der Larven, um eine korrekte Ausrichtung zu manipulieren, wie Agar härtet. Ein dritter wichtiger Vorteil des zWEDGI Designs ist die offene Kammer-Konstruktion lässt zu, dass die Rute und Kopf Regionen für experimentelle Manipulation zugänglich sein soll. Dies ist von besonderem Interesse für Wundheilung Studien, aber das macht auch die zWEDGI potenziell nützlich für andere Manipulationen. Das wohnzimmertaugliche Design des Geräts, bietet darüber hinaus die Möglichkeit für regionale Anwendung der Verbindungen während der Experimente. Das Gerät semi-Isolate den Kopf vom Heck wegen der Verbreitung Differential Puffer (in der Verwundung Kammer) und Agarose (in den Füllraum)5, so dass Anwendung von Verbindungen während des Studiums der Wundheilung oder anderen biologischen Prozesse. Zusätzlich, da die Larven in getrennten Kanälen angebracht sind, einzelne Larve identifiziert werden kann und Post-Bildgebung für die weitere Verarbeitung wie RNS oder Protein Reinigung oder Antikörper labeling abgerufen. Und schließlich, weil das Gerät aus PDMS besteht, die auf dem Boden Glasschale verklebt worden, das Gerät ist wiederverwendbar sobald die Larven entfernt wurden.
In Zukunft werden die modulare Bauweise und einfache Herstellung von den zWEDGI gut eignet sich zur Modifikation für geänderte Funktionalität. Zur Zeit sind die wohnzimmertaugliche Geometrien speziell für die verletzte und imaging Experimente beschrieben, gibt es breite Anwendung für live-Aufnahmen der Wundheilung gebaut. Allerdings liegt die Larve direkt auf dem Glas, so dass kein Material (d.h. PDMS), die Bildgebung stören könnte, besteht zwischen der Larve und der bildgebenden Oberfläche. Daher, andere Regionen der Larven, wie der Stamm, wouLD sein für Bildgebung zugänglich. Darüber hinaus kann das Design der 3D gedruckte Form der zWEDGI leicht angepasst werden andere Entwicklungsstadien, die unterschiedlichen Ausrichtungen der Larve und abwechslungsreiche Behandlungen. Diese Eigenschaften machen es daher ein wertvolles Werkzeug für die Erfassung der Zeit verfallen Mikroskopie von Ereignissen über eine Vielzahl von Zeitskalen. Die Verwendung von anderen Glasformaten unteren Gericht könnte größere PDMS-Geräte und genügend Platz für weitere Kanäle ermöglichen. Die zunehmende Zugänglichkeit 3D-Drucktechniken Herstellung und die spätere einfache Modifikation für eine Vielzahl von experimentellen Protokollen gegeben, erweisen die zWEDGI sich ein mächtiges Werkzeug im Bereich der live imaging Hochauflösende Mikroskopie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchte anerkennen, primäre Projektförderung vom Morgridge Institute für Forschung und Labor für optische und Computational Instrumentierung. Wir anerkennen auch Finanzierung von NIH # R01GM102924 (AH und KWE). KH, JMS, RS, AH und KWE konzipiert und gestaltet die Studie. KH und JMS führten alle Experimente mit Unterstützung von DL, KP und RS. KH, JS, RS, AH und KWE trugen zu dem Schreiben des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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