Summary
Detta manuskript beskriver zWEDGI (zebrafiskar Wounding och brottsprovokation enheten för tillväxt och Imaging), som är en konkurrensbetingat anordning för att orientera och hindra zebrafiskar larver. Designen möjliggör svans transection och långsiktiga samling av högupplösta fluorescerande mikroskopi bilder av sårläkning och förnyelse.
Abstract
Zebrafiskar larven är en viktigt modellerar organism för både utvecklingsbiologi och sårläkning. Dessutom är Sebrafisken larven ett värdefullt system för levande högupplösta mikroskopbilder av dynamiska biologiska fenomen i rymd och tid med cellulära upplösning. Den traditionella metoden av agaros inkapsling för levande avbildning kan dock hindra larval development och vävnad återväxt. Därför detta manuskript beskriver zWEDGI (zebrafiskar Wounding och brottsprovokation enheten för tillväxt och Imaging), som ritades och fabricerade som en funktionellt konkurrensbetingat enhet att orientera larver för högupplösande mikroskopi samtidigt tillåter stjärtfenan transection inom enheten och efterföljande ohämmad svans utveckling och återväxt. Denna enhet möjliggör såra och långsiktiga imaging bibehållen lönsamhet. Eftersom zWEDGI mögel är 3D tryckta, anpassningsbarheten för dess geometrier att det enkelt ändras för olika zebrafiskar bildhanteringsprogram. Dessutom erbjuder zWEDGI många fördelar, såsom tillgång till larven under experiment för sårande eller för tillämpningen av reagenser, parallellt orientering av flera larver för strömlinjeformad imaging och återanvändning av enheten.
Introduction
Zebrafiskar larver Danio rerio regenerativ förmåga gör dem en ideal modellerar organism för att undersöka såret svar samt healing och återväxt1,2,3,4. Tillgång till en matris av transgena zebrafiskar linjer och zebrafiskars anatomiska öppenhet ytterligare förbättra deras nytta för in-vivo studier av såret svar händelser liksom långsiktiga regenerativ processer4. Studera dessa biologiska processer som använder högupplösta time-lapse fluorescensmikroskopi därför kräver en levande zebrafiskar bildenhet som möjliggör hög stabilitet och minimal rörelse av zebrafisk larven bibehållen lönsamhet. Det är avgörande att enheten möjliggör effektiv såra medan läkning och förnyelse inträffar påverkas inte av enheten.
Levande imaging stabilisering standardmetoden för inbäddning larven i agaros under levande imaging begränsar tillväxt och sår regenerering5 och kan öka dödligheten eftersom larverna börjar visa tecken på kardiell stress och vävnad nekros efter fyra timmar4. Därför, borttagning av agaros från områden av intresse är ofta nödvändigt att tillåta normal utveckling och förnyelse6, utsätta larverna till potentiella skada som Agarens skärs bort. Dessutom måste användaren med Agarens inbäddning teknik, orientera larverna under den korta tid innan Agarens stelnar5,6,7. Snabbt att manipulera larven förutsätter inte bara skicklighet av användaren, det riskerar också att skada larven. Även om metoder att stabilisera larven för levande imaging har beskrivits för att kringgå dessa nackdelar, såsom räfflad agar brunnar3 eller divets8, användning av silikon vakuum fett för att skapa en avbildning kammare med PVC-rör eller andra material6och roterande slang9, många av dessa metoder är labor intensiv, stökigt, ofta icke-återanvändningsbara och tillåter inte för miljömässiga manipulation (drug behandlingar, såra osv.) efter fisken har monterats.
Därför utformades zWEDGI enheten (figur 1) för att övervinna några av nackdelarna med agar montering för långsiktiga levande avbildning av zebrafisk larver medan tillåter manipulering av preparatet. ZWEDGI består av tre halvöppna konkurrensbetingat kammare (figur 1A) för att möjliggöra för lastning, återhållsamhet, såra och avbildning av 2 till 4 dagar efter befruktning zebrafiskar larver. Enheten är fabricerade från Polydimetylsiloxan (PDMS) och placeras på täckglaset av en 60 mm glas botten imaging maträtt. Designen presenteras här var avsedd för såret helande studier, men användningen av en modulär design och standard fabrication teknik gör den zWEDGI designen kan ändras och kan bli föremål för en mängd olika experimentella rutiner, särskilt för förfaranden som kräver minimal återhållsamhet med experimentella manipulation och långsiktiga imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: bas zWEDGI design formulerades för zebrafiskar larver som är 2 till 4 dagar efter befruktning (dpf) och följ riktlinjerna från University of Wisconsin-Madison forskning djur Resurscenter.
1. design och 3D utskrift av mögel
- modell av PDMS komponent av enheten med önskad geometrier och attribut i en 3D-modellering programvara 5. Skapa en montering av en tom mögel och PDMS delen och generera en negativ mögel för PDMS delen genom att skapa ett hålrum i formen motsvarar den PDSM delen. Spara mögel som en .stl fil för 3D-utskrifter ( figur 2, steg 1.1).
Obs: En Stereolitografi formatfil (.stl) av mögel design presenteras här ( figur 1) är tillgänglig för nedladdning på https://morgridge.org/designs/. - Skriv ut formarna använder en fotopolymer 3D skrivare ( figur 2, steg 1.2). Göra flera formar i en enda utskrift, om möjligt, så mer än en enhet kan formas med ett parti av PDMS.
Obs: Exemplet trycktes i högupplöst läge med en 0,075 mm beam diameter och 0,05 mm skikttjocklek, använder fotopolymer harts 5.- Ren formarna med en fin pensel, denaturerad alkohol i en sprayflaska och tryckluft försiktigt skrubba och ta bort ohärdade harts. Avlägsna material från Regionkommittén microchannel.
- Efter bota formarna i en UV post bota apparater för 60 min på varje sida som ohärdat avgå är giftigt för zebrafiskar larver 10.
- Sand den hålighet sidan av mögel med 200 sandpapper på en plan yta tills alla tätningsytorna har kontakt med sandpapper (lastning kanal geometrier och mögel omkrets). Slipa lätt med 400 och 600 grit sand papper, successivt, för att producera släta spola ytor över alla geometri ytskikt ( figur 2, steg 1.3). Mäta djupet av Hålrummet efter slipning med en indikatorklocka för att verifiera att det är nära designade djupet.
- Rengör mögel och täcka skivor (1 ¾ tum i diameter x ¼ tum tjock Borsilicat glas eller akryl, ett glas täcka per mögel) genom att spola under rinnande vatten eller genom att placera i ett ultraljud renare fylld med vatten i 30 min.
- Föna med tryckluft och rengör båda formarna och täcker med isopropylalkohol och filtrerad tryckluft. Använd en ren bänk som en plats för att fabricera enheterna för att minimera kontaminering från luftburet skräp. Lämna den rengjorda formar och glas täcker i ren bänken eller en övertäckt petriskål tills behövs.
2. PDMS tillverkning av zWEDGI enhet
- göra PDMS av hälla 184 silikon elastomer Polydimetylsiloxan (PDMS) i förhållandet 5:1 (bas till aktivare) in i en plastmugg. Blanda väl i 2 min med en trä hantverk pinne, omrörning gelen över på sig, som knådning bröd. För 5 formar, använda 10 g base och 2 g aktivator.
- De gas blandning i vakuum exsickator för 25-45 min tills alla bubblor är borta.
- Fylla hålrummet av 3D tryckta formarna med cirka 0,75 mL PDMS med en 10mL spruta tills formen något svämmar över av en menisk ( figur 2, steg 2.1).
- De gas fyllda formarna för 45 min att ta bort ytterligare bubblor som kan ha bildats när fyllning.
- Applicera ett glas täckskivan ovanpå PDMS-fyllda mögel, trycka skivan ner i en vinkel att förhindra bubblor instängd ( figur 2, steg 2.2). Tillåta överskott PDMS skall utvisas som luckan glas skiva tillämpas.
- Användning små ratchet klämma för att hålla täckskivan hårt att mögel.
Obs: Detta skapar en plan yta när PDMS härdas och producerar genom hål där 3D tryckta geometrier är i jämnhöjd med glas cover slip. Alternativt, för att öka antalet enheter som kan botas på en gång, bygga en multi klämma enheten (t.ex. figur 2, steg 2.3). - Bota PDMS enheten i spänns formarna på 100 o C i ugn i 90 min ( figur 2, steg 2,4). Ta ut formarna ur ugnen och låt svalna tills de kan hanteras enkelt. Om fastspänningsanordning är metall, ta bort mögel och täck skiva församlingen från klämman att förhindra att metallen fortsätter att bota PDMS på grund av restvärme.
Obs: Enheten är enklast att ta bort från mögel medan fortfarande något varmt och inte helt botas. Men när mögel tas bort från ugnen och luckan skivan tas bort, kan enheten sitta i ett par dagar innan du fortsätter till demolding. Om enheten är demolded strax efter avlägsnande från härdning ugnen, placera den i en övertäckt petriskål att minimera föroreningar samtidigt som gör det möjligt att helt bota.
3. Plasma-limning zWEDGI glas skålen
- Clamp mögel som innehåller PDMS enheten i en bänk vice så att mögel ' s-geometrierna står inför upp, parallellt till arbetande station bänken.
- Start ta bort PDMS enheten genom att släppa fliken PDMS pull från mögel använder platt-tipped pincett. Arbete i ytterkanten av mögel med pincetten (som att ta bort en kaka ur en kastrull ( figur 2, steg 3.1)).
- Användning filtrerad tryckluft och pincett för att försiktigt dra enheten ur formen genom att hålla in på fliken pull och blåser luft under enheten. Arbeta långsamt, så att luften att hjälpa separat PDMS från mögel, ta särskilt försiktig med tips av pincetten runt avsnitten tunn tunnel.
- Placera PDMS enheten upp och ned på insidan av omslaget till en glasskål bottnat så att besöksförbud tunnel kilar vidrör plasten ( figur 2, steg 3.2).
- Placera skålen locket med uppochnervänt zWEDGI och motsvarande glas bottnat skålen i en plasma renare med inre glaset uppåt ( figur 2, steg 3.3).
- Evakuera plasma rengöring kammaren tills trycket når 500 mTorr.
- Set radiofrekvens (RF) makt till hög. Utsätta enheten och skålen till RF-frekvens för cirka 2 min. långsamt de trycksätta kammaren och returnera enheten och skålen till rena rum huva.
- PDMS enheten tas bort från skålen täcker. Vänd den PDMS zWEDGI till rätt orientering på glaset genom att placera den försiktigt upp på stadens väl glas botten skålen ( figur 2, steg 3,4)
- med den baksida änden av pincetten, lätt tryck nedåt på PDMS enhet att säkerställa luftbubblor är inte instängd under. Applicera tryck runt minuten geometrier micro kanaler och PDMS på kanterna ( figur 5 c).
Obs: Fullständig kontakt mellan PDMS och glas säkerställer bättre följsamhet från plasma bindning. ZWEDGI enheten kan vara plasma bundna till andra glas botten maträtt format, såsom ett glas botten 6-väl plate ( figur 2 c). - Placerar en täcka över enhet skålen innan du tar bort från rena rum huven.
Obs: När enheterna har åtgärdats till glas, protokollet kan pausas tills de är redo för användning.
- med den baksida änden av pincetten, lätt tryck nedåt på PDMS enhet att säkerställa luftbubblor är inte instängd under. Applicera tryck runt minuten geometrier micro kanaler och PDMS på kanterna ( figur 5 c).
4. Kanalisera förberedelse och lastning larver
Obs: General zebrafiskar djurhållning genomfördes per zebrafiskar boken, tillgänglig online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Adult zebrafiskar och embryon kvarstod som tidigare beskrivits 1. Vildtyp AB stammen användes. Följ institutionen ’ s djur vård protokoll för detaljerna beträffande kraven för imaging levande larver.
- Skölj kanalerna med ett minimum av 100 µL 70% etanol per kanal, med hjälp av en mikropipett för att skölja genom den fasthållande tunnel. Ta bort etanol och skölj 2 eller 3 gånger med dubbel destillerat vatten. Låt lufttorka.
- Fyller kanalerna med lättmjölk (vid en koncentration av 1% utspädd i vatten) under 10 minuter vid rumstemperatur för att minimera efterlevnad av larver av täckglaset av skålen. Sedan försiktigt doppa enheten flera gånger i dubbel destillerat vatten att skölja. Låt lufttorka uppochner.
Obs: Protokoll kan pausas här. Denna förberedelse av zWEDGI enheten kan göras flera dagar före användning. Butiken omfattas rumstemperatur. - Förbered 1% låg smältning pekar (LMP) agaros genom att kombinera 100 µL 2% smält LMP agaros med 100 µL 2 x Tricaine (0,4 mg/mL Tricaine - etyl 3-aminobensoat) i E3 buffert 11 före värmas till 38 o C. upprätthålla 1% agaros/tricaine lösning på 38 o C i en het block att förhindra gelbildande.
Obs: För multiphoton mikroskopi 11, Använd antingen un-pigmenterad zebrafiskar varianter (t.ex. casper 12) eller upprätthålla larver i E3 som innehåller 0,2 mM N-phenylthiourea att förhindra pigment bildning 11 att minimera de nära infraröda våglängderna absorberas av pigmentet.
Varning: N-phenylthiourea är giftiga. Följ institutionen ' s regler för bortskaffande. - Anesthetize larver i E3 buffert innehållande 0,2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11. Vänta tills larverna är orörlig och icke-lyhörd för en touch stimulans.
- Våt före kanalerna med några mikroliter av Tricaine/E3.
- Plocka upp en enda larv med en bred öppning pipettspetsen. Sätta in larver på kanalen lastning ( figur 3A). Använda en pipettspetsen eller liknande verktyg, rikta larven i lastning kammare så att ryggsidan ansikten rakare kanten av lastning kammare och svans ansikten mot besöksförbud tunneln ( figur 3B).
- Noggrant återkalla vätska från skadade kammaren, så att larven att flöda in i besöksförbud tunneln ( figur 3 c). Ta bort de flesta av vätskan bibehållen fukt runt larven ( figur 3D). Denna process kan underlättas genom att vinkla skålen något mot den skadade avdelningen.
- Placera 1% agaros som LMP i Tricaine/E3 (~ 38 o C) över larven ' s huvud, fylla lastning kammare ( figur 3E). Tillåta agaros stelna med larv i rätt position. Lägg till Tricaine/E3 till skadade avdelningen som behövs för att upprätthålla vätskebalans. Upprepa detta lastning process för de återstående 2 kanalerna.
- Med hjälp av en spruta nål, ta försiktigt bort eventuella agaros som trängt genom besöksförbud tunneln in skadade kammaren ( figur 3F). Lägga till ytterligare tricaine/E3 antingen drygt Agarens (för sårade, kort sikt imaging eller sår behandling isolering) eller att fylla kultur skålen (för långsiktiga imaging). Ersätta kultur maträtt locket för att förhindra avdunstning. Larverna kan avbildas på denna punkt (oskadad) eller sårade.
5. Skadade och Imaging larver
- med en steril skalpell blad, transekt stjärtfenan posteriort ryggsträng 11 i skadade kammaren ( figur 3 G, H). Lägga till ytterligare tricaine/E3 om det behövs och ersätta kultur maträtt locket.
Obs: Alternativt, beroende av utvecklingstoxicitet tidsfönstret för intresse, larver kan sårade, tillåtet att återställa i E3 och underhålls i en inkubator (28,5 o C) tills önskad bildbehandling, varvid de kan läsas in kanaler som ovan beskrivna. - Installera zWEDGI enheten med sövda larver på ett inverterat Mikroskop i ett skede Infoga som kommer att rymma 60 mm glas botten skålen. Leta upp svansen på larven i översta kanalen, roterande skålen som behövs för att få svansen i önskad position. Bild som krävs för det specifika experimentet.
Obs: ZWEDGI är i stort sett tillämpliga för högupplösta ljusmikroskop, inklusive widefield fluorescens och laserscanning mikroskopi. Det finns ett antal parameter överväganden när imaging zebrafiskar larver, men specifika imaging parametrar är instrument, prov och experiment beroende. Här, larval svansen fotograferades på en anpassade bygga multiphoton Mikroskop 5 , 11 utnyttja följande parametrar: 40 X länge arbeta avstånd vatten nedsänkning mål, 890 nm laser magnetisering, 445/20 nm utsläpp filter och 512 x 512 upplösning.
6. Slutet av experimentet
- ta bort zWEDGI skålen från Mikroskop. Euthanize larverna genom att placera zWEDGI antingen på en is vattenbad eller på 4 o C i minst 20 min och bedöma för avsaknad av hjärtslag och omsättning.
Obs: Eftersom larverna bibehålls i separata avdelningar, larverna kan individuellt återställas genom att försiktigt dra på agar med pincett eller pipetten. Ägarn kan tas bort från regionen huvud och larven används för ytterligare förfaranden, såsom fixering för antikropp färgning eller bearbetas för RNA- eller protein utvinning. - Efter avlägsnande av larver och agar, rengöra zWEDGI med etanol och destillerat vatten, som beskrivs i steg 4.1 och ställa upp och ner för att luften torr. Butiken omfattas i en sval, torr plats. Re päls med lättmjölk (steg 4,2) som behövs före nästa användning.
Obs: zWEDGIs kan återanvändas flera gånger, tills PDMS börjar att komma bort från glaset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS mikroflödessystem enheten är ett funktionellt konkurrensbetingat enhet utformad för att rymma fyra huvudfunktioner (visas nedan) är associerad med levande avbildning av stjärtfenan såra healing och återväxt i larvaena zebrafiskar. PDMS valdes för zWEDGI tillverkning eftersom det inte är bara lättillgängliga och en branschstandard för biokompatibilitet, men också fungerar bra i formar. Dessutom gör PDMS enheten återanvändbara och tomt på hårda eller vassa kanter när enheten är bildat. ZWEDGI specifikt tillstånd 1) lastning av larver i enheten, 2) återhållsamhet på rätt orientering för imaging, 3) sårande av stjärtfenan och 4) mikroskopbilder, beskrivs i detalj nedan.
Lastning
ZWEDGI konstruktionen består av 3 kanaler, var avsedda för att begränsa en larva (figur 1B). För lastning och inledande orientering på larven är öppen lastning kammaren 3 mm brett (figur 1A) att rymma en stor öppning pipettspetsen för att sätta in en larv (figur 3A). Vidare, längd och bredd ger tillräckligt utrymme för att tillåta efterföljande manipulation av larven in i rätt riktning, med svansen mot besöksförbud tunneln och ryggsidan mot toppen (figur 3B).
Återhållsamhet
När larven har lästs in i kanalen, kan det vara dragna svans-första genom besöksförbud tunneln genom avlägsnande av vätska från den skadade avdelningen eller försiktigt knuffa på plats med en pipettspetsen eller liknande verktyg (figur 3 c). Trattformad geometri av lastning kammare (figur 1A), från 3 mm till 0,45 mm, guidar larven in önskad laterala orientering (figur 3 c). Orientering på larven på sin sida håller fast svansen ungefär parallellt med glas botten av skålen för bättre imaging. Till skillnad från mikroflödessystem enheter görs med hjälp av kiselskivor, behöver geometrier för 3D tryckta formarna inte vara konsekvent i z-riktningen. Besöksförbud tunneln är därför omfattas och avsmalnande i z-axeln så att posten höjd är större än avfarten, från 0,5 mm till 0,3 mm höjd (figur 1B, isometrisk vy av tunneln). Denna nedtrappning underlättar vägledning för larven och tillplattning av svansen mot täckglaset imaging yta. Denna funktion eliminerar behovet för användaren att orientera preparatet medan agaros är härdning.
Vätska avlägsnas från lastning kammare (figur 3D) och ersätts med låg smältpunkt agaros att stabilisera huvudet inom kanal medan svansen upprätthålls ohämmat i buffert i skadade kammaren (figur 3E). Den minimala agaros som kan läcka genom besöksförbud tunneln kan enkelt avlägsnas från skadade kammaren (figur 3F). Avsaknaden av agaros i skadade kammaren tillåter ohämmad återväxt och utveckling av stjärtfenan5.
Såra
När larven har lästs igenom tunneln och huvudet fastspända av agaros, är stjärtfenan tillgänglig för transection eftersom det skjuter ut in i skadade kammaren. Halvcirkel skadade kammaren är förskjuten 1,9 mm från horisontella symmetri. Detta möjliggör en skalpell bladet infogas precis ovanför den stjärtfenan, ger tillräckligt utrymme för bladet att dras nedåt över svansen, transecting stjärtfenan (figur 3 g). Den bredaste delen av 7 mm diameter halvcirkeln uppstår där svansen är sårad för att rymma denna rörelse. Förutom att låta användaren sår larven, ger denna konkurrensbetingat design möjlighet till regional tillämpning av föreningar till svans region5. Denna unika funktion i semi isolering skulle möjliggöra lokaliserade testning av effekterna av olika droger, kemikalier eller biologiska agens på sårläkningsprocessen.
Imaging
Målet med zWEDGI enheten är att möjliggöra hög upplösning Ljus microscopy avbildning av den zebrafiskar stjärtfenan, obehindrat av agaros inbäddning. Av denna anledning är PDMS enheten bunden till en kommersiellt tillgängliga glas botten maträtt, att ge en optisk kvalitet yta för mikroskopi med hög NA linser. Här presenterar vi bilder med multiphoton mikroskopi för andra harmoniska (SHG) avbildning av kollagenfibrer i stjärtfenan för att illustrera imaging funktionerna i zWEDGI. Men kan zWEDGI tillämpas på andra ljusmikroskopi metoder, såsom konfokalmikroskopi, utnyttja en inverterade Mikroskop scenen konfiguration. Med zWEDGI, till skillnad från metoden av agaros inbäddning med efterföljande avlägsnandet, kan stjärtfenan enkelt avbildas i enheten före såra (figur 4A), sårade inom enheten, sedan omedelbart återvände till mikroskopet för efter såret Imaging (figur 4B-E). Tidigare arbete identifierat förändringar i kollagen fiber organisationen under såret läkningsprocessen använder SHG. 13 SHG kan användas för att upptäcka vissa typer av beställda strukturer, däribland fibrillar kollagen, utan användning av EXOGEN etiketter. 14 bild kvaliteten på levande kaudala fenorna avbildas i zWEDGI var liknande som erhölls i fasta vävnad5 men zWEDGI ger ett antal fördelar. Viktigast av allt, kan de stjärtfenan healing och återväxt fortsätta obehindrat av agaros inbäddning med larver överlevnad liknande till det av larverna vuxit ohämmad5. Ytterligare, eftersom den skadade kan utföras medan larven är i enheten, före och efter skadade bilder kan samlas på den samma stjärtfenan (figur 4A). ZWEDGI tillåter insamling av 3 dimensionella data över tiden, vilket ger en mer komplett bild av de dynamiska förändringar som sker i strukturen av extracellulärmatrix (figur 4B). Illustreras här följer SHG fiber sår avkoppling, i 3 dimensioner, såra inom zWEDGI. Innan såra, upptäckt SHG kollagenfibrer strålar utåt från ryggsträng till fin spets, (figur 4A). Strax efter såra avståndet mellan spetsen på kontrakterade fenan och centrum av the fin ökar med såret avkoppling. 3D arten av datainsamlingen tillåter rumsliga återuppbyggnaden, med rendering programvara såsom Imaris. Dessa rekonstruktioner och de efterföljande rotationsalternativ, illustrera sammandragning och avslappning av fenan uppstår inte bara i x y symmetriplan bild samlingen (figur 4 B, C, D), men också i z-axeln (figur 4 G-J, L-O, Q-T; Kompletterande filmer 1, 2) som svansen plattar från den uppåtgående curl kontrakterade statens. ZWEDGI kan användas med andra avbildningsmetoder över längre tidsperioder, såsom användning av konfokalmikroskopi till bild nervceller under stjärtfenan utveckling över 24 h5. Eftersom enhetens besöksförbud enheter är uppradade parallellt, vilket eliminerar behovet av att rotera enheten när lokalisera larverna, ställa in mikroskopet och flytta mellan flera exemplar för avbildning är okomplicerad och kan automatiseras för att samla in Time-lapse bilddata över flera larver. För att utöka antalet prover som kan avbildas, kan PDMS zWEDGI enheten placeras i andra glas botten format, såsom en 6-well platta (figur 2 c).
Figur 1 : Slutliga utformningen Schematisk (A) Schematisk bild som visar allmänna layout och mätningar av zWEDGI enheten, belysa terminologi i funktionellt konkurrensbetingat kamrarna. (B) isometrisk vy av PDMS enheten bort från mögel. (C) infälld visar tunnel, belysa förändringen i ingångs- och utgångseffekter höjder. (D) modell av larvaen återhållsamma i enheten. Figur modifierad från en tidigare publicera artikel5 med nytryck tillstånd från zebrafisk tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fabrication Schematisk (A) Steg 1 börjar med design av enheten mögel i en 3D-modellering av programvara (1.1) som sedan 3D tryckta (1,2). Formarna är UV-ljus botas och sedan slipas och rengöras så upphöjda geometrier har jämn höjd (1,3). Steg 2 innebär att fylla formarna med blandade och avgasade PDMS (2.1) och tillämpa en glas-skiva över mögel på en vinkling att förhindra svällning luftbubblor i enheten PDMS (2,2). Glas och mögel spänns grupp (2,3) för härdning i ugn på 100oC i minst en timme (2,4). Steg 3 använder filtrerad luft och platt-tipped pincett för att ta bort PDMS enheten från mögel (3.1). Enheten placeras på toppen av imaging maträtt locket (3.2) och är behandlad plasma (3.3), tillsammans med glas botten, att tillåta PDMS att följa glas botten skålen (3.4). (B) enhetens färdiga zWEDGI bundna i ett glas botten maträtt och redo för tänkbar användning. (C) flera zWEDGI enheter kan placeras i ett glas botten 6-väl pläterar för att bild många larver i samma experiment. Figur modifierad från en tidigare publicera artikel5 med nytryck tillstånd från zebrafisk tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Lastning och sårande av Larva i zWEDGI (A) En larv är laddad in lastning kammare med wide-öppning pipett. (B) larven är orienterad med ryggsidan mot den platta delen av lastning kammare tratt och svansen mot besöksförbud tunneln. (C) använda sug från pipettspetsen hölls vid ingången till den skadade avdelningen larven dras in i tunneln, placera den i rätt riktning för imaging. (D) vätska avlägsnas från lastning kammare att möjliggöra (E) tillägg av agaros runt huvud regionen att stabilisera larven. Agaros som är rött här endast i demonstrationssyfte. Minimal agaros läcker in i skadade kammaren och lätt kan tas bort som visas i (F). (G) för att sår när larven är fastspända i kanalen, en skalpell blad sätts ovanför larven och skivad ner över stjärtfenan, posteriort ryggsträng. (H) larven är nu klar för efter sår imaging. Skala bar (A-H) = 1 mm; Skala bar (F) = 1 mm; Skala bar (G) = 1 mm. figur modifierad från en tidigare publicera artikel5 med nytryck tillstånd från zebrafisk tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : 3D multiphoton tidsfördröjning imaging SHG fibrer i de zebrafiskar stjärtfenan, före och efter skadade, i zWEDGI. Den zWEDGI designen ger möjlighet för hög upplösning imaging, i detta fall av SHG fiber organisation föregående (pre sår) och efterföljande kaudala fin transection (efter såret). Data samlades in som z-stackar 4 minuters mellanrum. (A-E) visar SHG av fibrer i stjärtfenan som en projektion av z-stackar, före och vid fyra intervaller efter transection. Z-projektion utfördes med hjälp av ImageJ programvara. 15 t = 0 var början på imaging, ca 20 min efter transection. Dubbelpilarna anger ökningen i distansera av spetsen på såret kanten (kort vit linje) relativ till ryggsträng (lång vit linje) under avkoppling av såret efter inledande sammandragning. (F-J). Lutande 3D rekonstruktion av originaldata. (K-O). Surface rendering av den lutande 3D rekonstruktion visas i F-J. (P-T). Sidoutsikt över 3D rekonstruktion surface rendering, illustrerar hur den kontraktion och avslappning förekommer i 3-dimensionell rymd, som kan bedömas med denna data samlas in med zWEDGI där stjärtfenan inte begränsas av agaros. Skala bar (A-E) = 100 mikrometer; Skala bar (F-T) =100 µm. 3D-renderingar utfördes med programvara för bildåtergivning. Se även kompletterande filmer 1 och 2. Figur modifierad från en tidigare publicera artikel5 med nytryck tillstånd från zebrafisk tidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kritiska steg av zWEDGI Fabrication (A) För att säkerställa att inga bubblor form eller fastna i enheten när fastspänning på glas skivan, degas efter PDMS har fyllts i formarna och slant fastspänning glaset när du tillämpar det på PDMS i formen. Dessutom, för att förhindra PDMS från ”blinkande” över lastning och såra chambers, se till att slipa toppen av enheten noggrant för att säkerställa är ytorna av geometrier spola när fastspänning på glaset. (B) när enheten är tillräckligt härdas i ugnen, luftfickor mellan PDMS och mögel visar att enheten kommer att vara lätt att ta bort. Om enheten inte bort enkelt, det är troligtvis på grund av otillräcklig härdningstiden eller temperatur eller mögel själv var inte tillräckligt UV-härdad, vilket resulterar i resterande kådan kontaminering av PDMS. (C) när du tillämpar enheten till glas botten skålen efter plasmabehandling, applicera lätt tryck med den baksida änden av pincett, börjar vid Regionkommittén tunnel och arbeta utåt mot kanten av enheten. Om enheten inte bond Tja, indikerat av luftfickor mellan enheten och glas, förlänga tidsperiod i den plasma bonder och säkerställa att det finns inget damm mellan PDMS och glas ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: lutande 3D surface rendering av multiphoton tid bilder SHG fibrer i stjärtfenan under avkoppling efter såra. SHG fibrer i de stjärtfenan som avbildas som zstacks över tiden efter skadade (början av filmen är ca 20 min efter såra) i zWEDGI. Z-stackar rekonstruerades och yta återges med programvara för bildåtergivning. Svans lutas för att visa tre dimensionalitet. Anterior är till vänster. Filmen motsvarar stillbilder i figur 4 (K-O). Skalstapeln = 50 µm. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.
Kompletterande Movie 2: sidovy av 3D surface rendering av multiphoton tid bilder SHG fibrer i stjärtfenan under avkoppling efter såra. SHG fibrer i de stjärtfenan som avbildas som zstacks över tiden efter skadade (början av filmen är ca 20 min efter såra) i zWEDGI. Z-stackar rekonstruerades och yta återges med programvara för bildåtergivning. Sidovy visat att betona att fånga dynamiska förändringar i z-axeln. Anterior är till vänster. Filmen motsvarar stillbilder i figur 4 (P-T). Skalstapeln = 40 µm. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med zWEDGI enheten är att fånga 3D tidsfördröjning imaging av stabiliserande och inrikta fisken inom små arbetsavstånd ett högupplöst Mikroskop mål. Samtidigt som den uppfyller dessa specifikationer för konstruktionen, är det också en förbättring över traditionella agar-baserade förberedelse för levande imaging. Det finns tre kritiska steg (nedan) vid tillverkning av den zWEDGI, som, om inte gjort rätt, kan resultera i skadade enheter:
PDMS förberedelse (figur 5A)
För att förhindra bubblor, degas formarna efter PDMS har lagts till. Kontrollera att alla bubblor har eliminerats efter avgasning och ägna stor uppmärksamhet åt tillämpningen av glas skivan. Glas skivan måste tillämpas på en vinkling att se till att luften inte är att vara instängd under och inom PDMS. Damm kan vara ett problem under de flesta steg i processen. För att förhindra damm, Slutför varje rengöring steg noggrant och förvara delar i en ren huva mellan stegen. Kontrollera formar för överskjutande harts som kan skapa en grov yta före UV-härdning. När slipning, se till att de sand papper kontakter alla geometrier att se till att alla ytor är spola (figur 2, steg 1.3). Alltid rent med isopropylalkohol och luft precis innan du fyller formarna med PDMS. När klämma den extra PDMS ur formen, säkerställa klämmorna tätt Håll formen och glas täcker tillsammans (figur 2, steg 2.3).
Ta bort enheten från mögel (figur 5B)
Kontrollera att ugnen är minst 100 o C och härdningstiden är minst 1-1,5 tim. Om PDMS inte härdas tillräckligt, kan det vara svårt att ta bort från mögel. Andra möjligheter för underlåtenhet att ta bort inkluderar inte blanda PDMS reagenserna länge nog, med felaktiga förhållandet av bas och härdare eller överblivna harts kvar i formen efter 3D utskrift som kontaminerar sedan PDMS. Efter borttagning från ugnen indikerar luftfickor mellan enheten och mögel (figur 5B) att enheten tas enkelt bort.
Efterlevnad av PDMS glasbotten maträtt (figur 5 c)
Dålig följsamhet till glas skålen kan resultera från damm, felaktig eller otillräcklig längd av plasmabehandling. När du placerar enheten på glaset, spets skålen i en vinkel och center i PDMS till glas cirkeln se till att det berör inte kanterna på brunnen. Om enheten inte följer, tryck försiktigt enheten på glas slip med bakändan av pincetten, med början i regionen delikat tunnel och trycka utåt mot kanterna. Om enheten fortfarande inte följer, experimentera genom att öka tiden i plasma renare i steg om en minut.
Medan larverna kan avbildas i enheten under kort tid (minuter) utan användning av agar, i syfte att långsiktigt live-imaging regionen stjärtfenan, placeras agar på huvudet i lastning kammare efter fisken har laddats. Även om denna tillämpning av agar inte verkar påverka den sårläkning svar eller livskraften hos de larver5, kunde detta påverka studien av fler främre regioner av larverna. Även om vi har kunnat för upp till 60 h larver på bilden har vi inte undersökt huruvida livskraft skulle påverkas med längre imaging gånger. Dessutom var särskilt designen presenteras här optimerad för ålder 2 till 4 dagar efter befruktning (dpf) larver liggande på deras sidor för svans transection och sårläkning imaging. Andra utvecklingsstadier, inriktningar och experimentella protokoll kan kräva ändringar i designen. Det avsiktliga funktionella modularitet av design gör det dock lätt mottagliga för sådana ändringar.
Tillverkning av denna enhet kräver dessutom tillgång till en 3D-skrivare och andra mikroflödessystem material och utrustning, såsom PDMS och en plasma som renare, potentiellt begränsa tillgängligheten till enheten till vissa användare. Dock valdes denna metod av mögel tillverkning eftersom 3D utskriftsfunktioner, tillsammans med mikrofluidik fabrication, blir allt vanligare på akademiska campus. Dessutom finns det tjänsteleverantörer för 3D utskrift tillgängliga, eftersom tekniken utvecklas snabbt och kostnaden för skrivare minskar.
ZWEDGI med tanke på dess konkurrensbetingat design och funktionalitet, och erbjuder förbättringar över den nuvarande tekniken för tid förfaller bildsamling med agar inbäddning. Först, agaros inte omger regionen svans i den zWEDGI, tillåter sårläkning och förnyelse till framsteg hämningslös medan överlevnaden av larver i zWEDGI är jämförbar med inbäddade och unembedded kontroller5. För det andra tillåter användning av högupplösta 3D-utskrifter att tillverka formarna zWEDGI att ha unika sluttande geometrier att orientera larven i tre dimensioner med avseende på bildplanen. Detta tar bort tid beroende av att manipulera larverna till rätt orientering som ägarn hårdnar. En tredje viktig fördel av zWEDGI design är öppen kammare design som tillåter svans och huvud regioner ska vara tillgänglig för experimentell manipulation. Detta är av särskilt intresse för sårläkning studier, men detta gör också att zWEDGI ett potentiellt användbart verktyg för andra manipulationer. Compartmental utformningen av enheten, ger dessutom möjlighet till regionala tillämpningen av föreningar under experiment. Enheten semi isolaten huvudet från svansen på grund av diffusion differentialen av buffert (i den skadade avdelningen) och agaros (i lastning kammare)5, så att tillämpningen av föreningar medan du studerar sårläkning eller andra biologiska processer. Dessutom, eftersom larverna monteras i separata kanaler, enskilda larv kan identifieras och Hämtad efter imaging för ytterligare bearbetning såsom RNA- eller protein rening eller antikropp märkning. Och slutligen, eftersom enheten är gjord av PDMS som har varit bundna till glas bottnat skålen, enheten är återanvändbara när larverna har tagits bort.
Framåt, kommer den modulära designen och enkel tillverkning av zWEDGI lämpar sig i väl ändring för förändrad funktionalitet. För närvarande byggs compartmental geometrier speciellt för de skadade och imaging experiment som beskrivs, vilket ger bred tillämpning för levande avbildning av sårläkning. Larven ligger dock direkt på glaset, så att inget material (dvs PDMS) som kan störa imaging, finns mellan larv och imaging ytan. Därför andra regioner av larverna, såsom stammen, wouLD vara tillgängliga för avbildning. Dessutom kan utformningen av 3D tryckta formen av zWEDGI lätt modifieras för att rymma andra utvecklingsstadier, olika inriktningar av larv och varierande behandlingar. Dessa attribut gör det därför ett värdefullt verktyg för att fånga tid förflutit mikroskopi av händelser över en mängd olika tidsskalor. Användning av andra glas botten maträtt format möjliggör för större PDMS enheter och utrymme för fler kanaler. ZWEDGI ges ökande tillgänglighet till 3D tryckteknik av tillverkning och modifiering efterföljande enkel för en mängd olika experimentella protokoll, och kan visa sig vara ett kraftfullt verktyg i sfären av högupplösta levande imaging mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna primära projektfinansiering från Morgridge Institutet för forskning och laboratoriet för optisk och Computational instrumentering. Vi erkänner också finansiering från NIH # R01GM102924 (AH och KWE). KH, JMS, RS, AH och KWE utformades och utformat studien. KH och JMS utförs alla experiment med stöd från DL, KP och RS. KH, JS, RS, AH och KWE bidragit till handstilen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
