Summary
Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.
Abstract
Nauwkeurig detecteren en tellen sparse bacteriële monsters kent vele toepassingen in de voedingsmiddelen, dranken en farmaceutische verwerkingsindustrie, in de medische diagnostiek, en voor de detectie van het leven door robotic missies naar andere planeten en manen van het zonnestelsel. Momenteel worden schaars bacteriële monsters geteld door cultuur beplating of epifluorescence microscopie. Cultuur platen vereisen lange incubatie tijd (dagen tot weken), en epifluorescence microscopie vereist uitgebreide kleuring en concentratie van het monster. Hier laten we zien hoe off-axis digitale holografische microscopie (DHM) te gebruiken bij het inventariseren van bacteriën in zeer verdunde culturen (100-104 cellen/mL). Eerst, de bouw van de aangepaste DHM is besproken, samen met gedetailleerde instructies voor het bouwen van een low cost-instrument. De beginselen van holografie worden besproken, en een statistisch model is gebruikt om te schatten hoe lang video's moeten worden om op te sporen cellen, op basis van de kenmerken van de optische prestaties van het instrument en de concentratie van de bacteriële oplossing (tabel 2) . Video detectie van cellen op 105, 104, 103, en 100 cellen/mL wordt gedemonstreerd in real time via un-gereconstrueerde hologrammen. Wederopbouw van amplitude en fase beelden is aangetoond door middel van een open-source softwarepakket.
Introduction
Bepaling van nauwkeurige bacteriële graven in zeer verdunde monsters is van cruciaal belang in vele toepassingen: een paar voorbeelden zijn water en voedsel kwaliteit analyse1,2,3; opsporing van ziekteverwekkers in het bloed, cerebrospinaal vocht of sputum4,5; productie van farmaceutische producten, met inbegrip van steriel water6; en milieu Gemeenschap analyse in oligotrofe omgevingen zoals de open oceaan en sedimenten7,8,9. Er is ook steeds meer belangstelling in opsporing van mogelijke bestaande microbiële leven op de ijzige manen van Jupiter en Saturnus, met name Europa10,11 en Enceladus12,13, 14, waarvan bekend is dat hebben ondergrond vloeibare oceanen. Omdat er geen missie sinds Viking in 1978 heeft geprobeerd te vinden van overgeleverde leven op een andere planeet, is er beperkte ontwikkeling van technologieën en instrumenten voor bacteriële identificatie en tellen tijdens ruimte missies15.
Traditionele methoden van kiemgetal vinden alleen culturable cellen, die een minderheid van soorten in milieu stammen, soms kunnen vertegenwoordigen < 1%16. Platen vereisen dagen of weken van incubatie voor maximaal succes, afhankelijk van de stam. Epifluorescence microscopie heeft grotendeels plaat graven als de gouden standaard voor snelle en accurate microbiële opsomming vervangen. Nucleic-zuur-labeling fluorescente kleurstoffen zoals 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI), SYBR Green of acridine oranje die zich aan nucleic zuren binden zijn de typische kleurstoffen gebruikt17,18,19 , hoewel vele studies gebruiken fluorescerende indicatoren van Gram ondertekenen20,21,22,23,24. Met behulp van deze methoden zonder pre concentratie stappen leidt tot detectiegrenzen (LoDs) van ~ 105 cellen per mL. Er zijn verbeteringen in LoD mogelijk gebruik van filtratie. Een vloeibare monster is vacuüm-gefilterd op een membraan, meestal polycarbonaat en ideaal zwart te verminderen achtergrond. Low-achtergrond kleurstoffen zoals de vlekken van DNA bovengenoemde kunnen rechtstreeks worden toegepast op de filter-25. Voor het nauwkeurig tellen met het blote oog, ~ 105 cellen zijn vereist per filter, wat dat voor monsters meer verdund dan ~ 105 cellen per mL betekent, significante steekproef volumes worden verzameld en gefilterd. Laser-scannen apparaten zijn ontwikkeld om systematisch Ontdek alle regio's van de filter en dus vermindering van het aantal cellen die nodig zijn voor het tellen, verlegging van de grenzen van de detectie tot ~ 102 cellen per mL26. Echter, deze zijn niet beschikbaar in de meeste laboratoria, en vereisen geavanceerde hardware zowel als software waarmee deskundige bevestiging dat deeltjes waargenomen zijn bacteriën en niet puin.
Ter referentie, volwassenen met sepsis beginnen meestal met symptomen bij < 100 cellen/mL bloed en zuigelingen op < 10 cellen/mL. Een bloed trekken uit een volwassene neemt 10 mL, en van een kind, 1 mL. PCR gebaseerde methoden worden geremd door de aanwezigheid van menselijke en niet-pathogene flora DNA en door PCR-remmende componenten in het bloed27,28. Ondanks een verscheidenheid van technieken in opkomst blijven culturen de gouden standaard voor de diagnose van infecties van de bloedbaan, vooral in de meer landelijke gebieden of ontwikkelingslanden. Voor de detectie van het leven op andere planeten, kunnen thermodynamische berekeningen schatten het energiebudget voor leven en dus ook de verwachte mogelijk biomassa. 1 - 100 cellen/mL verwachting thermodynamisch redelijk op Europa29. Het kan worden gemakkelijk afgeleid uit deze nummers dat detectie van zeer kleine aantallen cellen in grote hoeveelheden waterige oplossing een belangrijk onopgelost probleem is.
In deze paper, tonen we detectie van Serratia marcescens en Shewanella oneidensis (wild-type en niet-sporenvormende mutant) bij concentraties van 105, 104, 103en 100 cellen/mL met behulp van een off-axis digitale holografische Microscoop (DHM). Het belangrijkste voordeel van DHM over traditionele lichte microscopie is de gelijktijdige beeldvorming van een dikke monstervolume op hoge resolutie — in deze uitvoering was de monsterkamer 0.8 mm dik. Deze steekproef kamers werden gebouwd door de zacht-litho Polydimethylsiloxaan (PDMS) van een precisie-gefreesd aluminium schimmel met een tolerantie van ± 50 µm. Dit is een ongeveer 100-fold verbetering in de diepte van veld opzichte high-power licht microscopie. DHM biedt ook kwantitatieve fase informatie, waardoor metingen van optische weglengte (product van de brekingsindex en dikte). DHM en soortgelijke technieken werden gebruikt voor het toezicht op bacteriële en gist celcyclus en berekening van bacteriële droge massa30,31,32; verstrooiing verschillen kunnen zelfs worden gebruikt om te onderscheiden van de bacteriestammen33.
Het instrument dat wij gebruiken is custom-built specifiek voor gebruik met micro-organismen, als eerder gepubliceerde34,35, en het ontwerp en de constructie worden gedemonstreerd en besproken. Waterige oplossingen worden doorlopend geleverd aan een 0,25 µL volume monsterkamer via spuitpomp; het debiet wordt bepaald door de framesnelheid van de camera met het oog op de beeldvorming van het gehele monstervolume. Een statistische berekening voorspelt het aantal monster volumes die image moet worden gemaakt om op te sporen van een groot aantal cellen met een bepaalde concentratie.
Voor cel-detectie toepassingen was wederopbouw van de hologrammen in amplitude en fase beelden niet vereist; analyse werd uitgevoerd op het ruwe hologram. Dit bespaart aanzienlijke rekenkracht en schijfruimte: een 500 Mb hologram video zal worden 1-2 Tb wanneer gereconstrueerd. We echter wederopbouw door de diepte van het monster te bevestigen dat de hologrammen de gewenste soort vertegenwoordigt bespreken. Een belangrijk kenmerk van DHM is haar vermogen om te controleren zowel de intensiteit en de fase van de beelden. Organismen die bijna transparant in intensiteit (zoals de meeste biologische cellen zijn) worden duidelijk weergegeven in fase. Zoals het is een label-vrije techniek, worden geen kleurstoffen gebruikt. Dit is een eendvantage voor mogelijke ruimtevaart toepassingen, omdat kleurstoffen niet op de voorwaarden van een missie overleven kunnen en — belangrijker — niet kan worden aangenomen om te werken met buitenaardse organismen, die mag niet DNA of RNA voor codering gebruiken. Het is ook een voordeel voor werk in extreme omgevingen zoals de arctische en Antarctische, waar kleurstoffen kunnen moeilijk te brengen naar de externe locatie en kunnen afnemen bij opslag. Reconstructie van beelden in fase en amplitude wordt uitgevoerd met behulp van een open-source softwarepakket dat we beschikbaar hebben gesteld op GitHub (SHAMPOO) of met behulp van ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groei en opsomming van bacteriën
Opmerking: Dit geldt voor bijna elke bacteriële stam geteeld in de passende middellange 36. In ons voorbeeld gebruiken we drie stammen: Serratia marcescens als een gemeenschappelijk, eenvoudig identificeerbare lab stam; en een kleinere, zeer motile milieu stam, Shewanella oneidensis heer-1. Als u wilt vergelijken detectie van motile vs. niet-sporenvormende cellen, niet-sporenvormende Shewanella mutant, Δ FlgM, wordt ook gebruikt voor vergelijking 37. Alle stammen worden gekweekt in lysogenie Bouillon (LB).
- Voorbereiden steriele LB medium (per liter gedistilleerd water: 10 g bacto trypton, 5 g bacto Gist, 10 g NaCl; filter of autoclaaf). Bereiden standaard 100 mm diameter LB-agar platen (zelfde recept als medium plus 15 g per liter agar; autoclaaf (121 ° C, 20 min) te steriliseren en giet wanneer koel genoeg om te behandelen). Opslag medium en platen in ijskast.
- De dag vóór het experiment zaad 5-6 mL " Master " kweekmedium uit een vers bacteriële kolonie, met behulp van de juiste bioveiligheid en steriele techniek. Incubeer op een shaker (120 rpm) bij 30 ° C ~ 12 h. incubatietijd zullen afhankelijk van de stam- en groeisnelheid bij. In onze experimenten, de stammen van de Shewanella worden ge¨ uncubeerd 12 uur; echter, Serratia wordt geoogst na 8 uur, om ervoor te zorgen dat de cultuur zal worden exposeren medio-logaritmische groei.
- De dag van het experiment, neem een spectrofotometrische lezing (OD 600) van de bacteriële cultuur, die wordt verondersteld te worden in het bereik van 0,6 naar 0,7-Master. Het moet in de logaritmische groeifase (zoals eerder bepaald). Als niet, subcultuur 100 µL in 5 mL van medium en toestaan van celgroei naar de mid log fase.
- Neemt een monster van de meester cultuur en de cellen direct met behulp van een Petroff-Hausser tellen kamer tellen. Dit zowel live als dode cellen zal opsommen.
- Extract van een monster 10 µL van de onverdunde cultuur met een micropipet en overdracht in de bedwelmingsruimte.
- Afbeelding onder een hoge-droge objectieve Microscoop (40 X of 63 X, NA 0,7 - 0.8) met fase contrast.
- Rekenen de bacteriën in ten minste 20 vierkanten en gemiddelde.
Opmerking: Tellen alleen die bacteriën die volledig binnen een vierkant en alleen die kruising over de bovenkant en linker grenzen (of onderkant en recht, als u liever). Als vierkantjes zijn gescheiden door verschillende lijnen, kies een als een grens. - Berekenen concentratie als het gemiddelde van 20 vierkanten x verdunningsfactor. Merk op dat directe graven werken niet goed voor concentraties < 10 7 / mL.
- Maken seriële verdunningen van de cultuur voor het tellen van de kolonie-vormende eenheden (kve). Dit levende cellen alleen zal opsommen.
- Maken een seriële verdunning van elk van de geselecteerde bacteriële monsters met een steriele zoutoplossing 0,9% oplossing. Breng 20 µL van de bacteriële oplossing en Verdun het met 180 µL zoutoplossing. Herhaal deze actie tot de laagste concentratie ~ 10 3 cellen/mL.
- Nemen 100 µL van ten minste twee verdunningen-voorgesteld zijn 10 3 en 10 4 /mL — en plaat op een passende vaste voedingsbodems plaat. Bestrijk met een steriele strooier. Uitvoeren van ten minste 3 replicatieonderzoeken van elke verdunning.
- Broeden op een passende temperatuur voor uw bacteriën, 's nachts of tot kolonies groeien.
- Tellen kolonies en berekenen van kolonievormende eenheden (kve) volgens (# van kolonies x verdunningsfactor) / volume verguld = CFU/mL. CFU gemiddelden over de duplobepalingen.
2. Bereiding van de monsters sterk verdund voor DHM
- Make seriële verdunningen van de meester cultuur voor DHM en post-DHM tellen van de kolonie-vormende eenheden op LB media platen (zie 1.4.1 - 1.4.4). Uitvoeren van deze dubbel-blinde, zodat de persoon die van de opnamen niet op de hoogte van de concentratie in elk monster gemeten is.
- De bacteriën verdund in 10-15 mL van een minimale voedingsbodem die zal aanmoediging motiliteit (naar gelang van het geval), maar remmen de celdeling, zodat de concentratie van cellen niet merkbaar tijdens het experiment verandert. Dit kan worden zoutoplossing 0,9% of een meer specifieke motiliteit medium. Bijvoorbeeld, als met behulp van Escherichia coli, moet beweeglijkheid medium bevatten EDTA 38. Voor deze voorbeelden, we gebruiken 0.9% zout.
3. DHM Videos opnemen
- met een steriele injectiespuit, trek in ongeveer 10 mL van de verdunning van belang.
- Verbinden de spuit de DHM-monsterkamer met behulp van steriele fittingen en buizen.
Opmerking: Een op maat gemaakte microfluidic kamer werd gebouwd zodat de consistente stroom van monster door de optische weglengte van het instrument. Zie het gedeelte ' resultaten ' voor meer informatie. Voorafgaand aan het experiment, alle onderdelen van de monsterkamer moeten worden gesteriliseerd met autoclaaf. - Stromen het monster uit de spuit via de monsterkamer continu gebruik maakt van een spuitpomp.
Opmerking: Juiste debiet afhankelijk fluidic kanaal afmetingen, gewenste doorvoer, alsmede gegevens overname beperkingen. - Als het monster is stroomde door de monsterkamer, verwerven hologrammen achter elkaar op een juiste framesnelheid. Een tijdstempel bestand wordt gemaakt welke logboeken de tijd van elke afbeelding vastleggen om later tijdens de data-analyse (protocol sectie 4) worden gebruikt. Het verkrijgen van alle hologrammen bij omgevingstemperatuur (23° C). Hologrammen opnemen door het uitvoeren van een vooraf geschreven C++ uitvoerbaar bestand geboden door de camerafabrikant.
Opmerking: Juiste framesnelheid afhankelijk van het debiet gekozen. Voor dit experiment, is het aanbevolen om gebruik van een framesnelheid, zodanig dat een bacterie beeld zou worden > 2 keer als zij over het instrument reisden ' s gezichtsveld. - Voldoende tijd voor de hele 10 mL van het monster te worden stroomde door de DHM.
- Om ervoor te zorgen dat bacteriën niet groeien of sterven tijdens de experimenten, beënten verrijkt media platen met 100 µL van de verbruikte media post-DHM Fotolader. Bestrijk met een steriele strooier en Incubeer bij juiste temp gedurende 24 uur; Telling kolonies aanwezig.
4. Berekening van de celdichtheid en grenzen van opsporing
- met de verworven hologram video's, het analyseren van de gegevens voor de aanwezigheid van bacteriën.
- De mediane pixelwaarde berekend voor een tijdreeks van hologrammen dan deze gemiddelde waarde van elke respectieve pixel te elimineren stationaire artefacten in het hologram aftrekken. Dit kan worden gedaan in ImageJ door de volgende stappen uit te voeren:
- omzetten in 32-bits (Image-Type-32 bits)
- Bereken de mediaan (Image-Stack-Zproject-mediaan)
- aftrekken van de mediaan van de rest van de stapel ( Process-ImageCalculator-Subtract)
- het aantal zichtbare luchtige ringen en in-focus cellen tellen handmatig. In ImageJ, dit wordt gedaan door te wijzen op de objecten met het gereedschap Ankerpunt.
- Elke reeks van hologrammen zal vergezeld gaan van een tijdstempel bestand (opgenomen op tijdstip van verwerving van het hologram). Gebruik het bestand tijdstempel voor het berekenen van de totale hoeveelheid monster gepompt destijds de afbeelding werd gevangengenomen.
- De mediane pixelwaarde berekend voor een tijdreeks van hologrammen dan deze gemiddelde waarde van elke respectieve pixel te elimineren stationaire artefacten in het hologram aftrekken. Dit kan worden gedaan in ImageJ door de volgende stappen uit te voeren:
- De celdichtheid berekenen door het verdelen van het totale aantal cellen gedetecteerd door de totale hoeveelheid monster beeld. Gemiddelde van 5-10 frames voor nauwkeurige statistieken.
5. Afbeelding van wederopbouw Amplitude en fase
- Kies representatieve video's met 10-200 cellen per frame. Laden van rauwe (niet mediaan-afgetrokken) hologrammen in de wederopbouw-software (voorbeelden: ImageJ numerieke Propagation 39; SHAMPOO [GitHub]).
- Met behulp van ImageJ, ga naar OD-numerieke Propagation-numerieke diffractie.
- Bij de opdrachtprompt, tekenen een Fourier-masker om te kiezen van de reële- of virtueel beeld en elimineren alle functies sinusvormige lawaai.
- Amplitude en fase bij passende z-stappen door het invoeren van de wederopbouw afstand reconstrueren.
- Mediaan aftrekken de amplitude gegevens geluiddempingsinrichtingen zoals in 4.1.1.
- Plot gegevens als een 3D-kubus of projectie. Ga naar Plugins — Volume Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten dienen de mogelijkheid om te detecteren van levende en dode bacteriën op een zeer laag niveau door DHM op te geven. Het aantal bacteriën geteld moeten in overeenstemming zijn met de resultaten die zijn verkregen met behulp van de Petroff-Hauser tellen kamer en plaat graven. Standaard statistische methoden geven informatie over de nauwkeurigheid van de verschillende detectiemethoden bij verschillende bacteriële concentraties.
Figuur 1 toont de Petroff-Hausser tellen kamer gebruikt evenals de microstructuur van de tellende kamer die wordt gebruikt in de directe opsomming van cellen. Figuur 2A toont een typische verrijkt cultuur plaat die heeft gekregen voldoende tijd voor S. marcescens groeien koloniën (16 uur bij kamertemperatuur). Figuur 2B toont groeicurven voor alle spanningen gebruikt. Hoewel de exacte spectrofotometer metingen variëren, moet de relatie tussen OD600 en kolonie graaf lineair binnen het betrouwbare bereik van de spectrofotometer valt; we gemeten ~ OD600 = 0.1 als ~ 108/mL. De directe Petroff-Hausser telt en kolonie graven mogen goedkeuren binnen 10% tot de cellen beginnen te sterven zoals gezien door de omzet in de groeikromme.
Figuur 3 toont het ontwerp van de aangepaste monster kamers. Aangepaste microfluidic kamers werden gebruikt voor dit experiment dat de continue stroom van monster door het gezichtsveld van de holografische Microscoop. Standaard microfluidic technieken en materialen werden gebruikt in de bouw van de monster-kamers. Blunt getipt RVS naalden met mannelijke Luer-Lok hulpstukken zijn ingevoegd in het microfluidic apparaat voor inlaat en uitlaat poorten naar de monsterkamer. Het microfluidic kanaal meetkunde werd opgericht door de zachte litho Polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van een meester mal van gefreesd aluminium, die was gecomprimeerd, via aluminium frames, tussen twee optische kwaliteit glazen ramen. De PDMS stroom kanaal geometrieën vaststelt evenals beveiligt injectienaalden, waarmee vloeistof transport naar en vanuit de kanalen van de stroom. Deze steekproef kamers kunnen PDMS uitsluitend stellen stroom kanaal geometrie en bevatten dus geen PDMS in de optische weglengte van het instrument. Merk op dat de optische karakter van een off-axis holografische Microscoop, twee micro-kanalen werden gegoten evenwijdig aan elkaar in de monsterkamer. Dit is bedoeld om overeenkomen met optische weglengte van lengtes tussen beide takken van de interferometer (hierna aangeduid als de 'specimen' en 'reference' armen). Het referentie-kanaal mag alleen steriele media bevatten, en moet niet onder stroom.
Figuur 4 toont een schema en beelden van de digitale holografische Microscoop in haar laboratorium uitvoering. Het wordt beheerd door de software meegeleverd met de camera. Figuur 5 toont representatieve DHM gegevens voor bacteriële inventarisatie en hun correspondentie met de voorspelde aantal cellen per gezichtsveld. Vanaf de ruwe hologrammen, zonder wederopbouw, is het mogelijk om te zien en de cellen door mediaan aftrekken en handmatige tracking tellen. Dit vermindert sterk de computationele belasting in vergelijking met de wederopbouw van alle z-vliegtuigen, zoals de rauwe hologrammen de cellen in de diepte van de kamer tonen. Het uiterlijk van culturen op verschillende concentraties en hun correspondentie met kiemgetal en Petroff-Hauser worden aangegeven. Totale cellen worden bepaald door het gemiddelde van het aantal cellen in elke monstervolume gezien over het totale aantal volumes beeld. De limiet van detectie wordt bepaald door het totale aantal monster volumes beeld. In dit experiment, we een maximum wordt gesteld op deze waarde, met een maximale totaal van 10 mL van het monster beeld in stappen van 0,25 µL (een totaal van 40.000 beelden per monster). De opnames worden gestopt voordat de maximale totale volume wordt bereikt als de cellen worden duidelijk waargenomen in elk frame over een reeks van 20 beelden. In een eerdere papier meldden wij een formule voor het schatten van het aantal monster volumes nodig om te sporen van bacteriën bij een betrouwbaarheidsniveau van 50% bij concentraties variërend van 1-105 cellen/mL (tabel 1). Op basis van deze raming, een onderzoek van alle 40.000 frames ruimte laten voor detectie van cellen bij 1/mL, al is deze berekening computationeel intensief.
Figuur 6 toont het gebruik van wederopbouw software (Fiji)39. Een enkele hologram wordt geopend en de software "OD-numerieke Propagation-numerieke diffractie" wordt uitgevoerd. De imaging parameters zijn gegeven in het dialoogvenster; amplitude, intensiteit en fase kunnen allemaal worden gereconstrueerd. Een enkele z vlak kan worden gekozen, of batch reconstructies kunnen worden gebruikt voor de wederopbouw van de hele diepte.
Figure 7 toont reconstructies van amplitude en fase-beelden op verschillende diepten in een geselecteerde steekproef. Het masker van de Fourier gebruikt voor het genereren van de reconstructies wordt weergegeven, samen met een mediaan-afgetrokken intensiteit beeld, een beeld van de fase, een maximale projectie door middel van de fase-stack en een volume projectie van de intensiteit stack.
Figuur 1: directe tellen van bacteriecellen. Bacteriële concentratie in cellen/mL wordt berekend door het tellen van het aantal bacteriën in de kamer tellen en schalen van dat nummer boekhouding voor het feit dat de Petroff-Hauser kamer alleen 20 bevat nL van monster. (A) de Petroff-Hausser tellen kamer. (B) afbeelding tellen kamer microstructuur onder 10 X fase contrast, handig voor het opsommen van de cellen van verschillende grootte tonen van dozen van verschillende maten. (C) verschijning van S. marcescens binnen de tellen kamer kleinste vakken; 40 x fase contrast. (D) methode voor het tellen die sluit cellen vallen op de boven- en rechterrand (N), maar niet de lagere en links randen (Y). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: cellen door groei van de kolonie en optische dichtheid tellen. (A) S. marcescens gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Bij de juiste verdunning moeten cultuur platenhebben 20-200 kolonies voor nauwkeurige tellen en statistieken. De plaat komt te staan is een beetje te druk voor het tellen van betrouwbare. (B) groei buigt voor de 3 soorten gebruikt. Een optische dichtheid van 0.1 correspondeert ~ 108 cellen/mL, maar exacte waarden variëren per instrument. Directe Petroff-Hauser graven bewilligen plaat telt binnen 10% binnen het bereik van de lineaire groei. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Sample kamer ontwerp. (A) Microfluidic schematische (specimen en verwijzing microchannels label). (B) volledig geassembleerd monsterkamer. (C) ontplofte CAD bekijken waarin de bestanddelen van de monsterkamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: schematische voorstelling en beelden van de digitale holografische Microscoop. (A) schematisch weergegeven: vier hoofdelementen: de bron, het monster (specimen pad heet Spec. en verwijzing pad heet Ref.), de Microscoop, en de sensor. (B) solide model van de hardware. De vezel-gevoed bron-vergadering is aan de onderkant en de beeldvorming camera is aan de bovenkant. De Microscoop optica-bestaat uit de twee asferische lenzen en de lens van de relay-bevinden zich in de buis van de 300 mm lange lens. De drie assen etappe tussen de bron de Microscoop optiek biedt gemakkelijke manuele manipulatie van het specimen bestudeerde. (C) foto van het instrument in het laboratorium. De schaal in het onderste gedeelte van de afbeelding balk 1 inch. Het schema zijn opnieuw uit Wallace et al. getrokken 34. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: groeikrommes en representatieve gegevens DHM. (A) Predicted cellen per gezichtsveld op basis van een steekproef volume van 365 µm x 365 µm x 1 mm. De optimaal bereik DHM opsomming wordt weergegeven in de rechthoek, en echte monsters worden aangeduid als (B) en (C). (B) DHM hologram in een Shewanella cultuur bij 8 x 105 cellen/mL gemeten door Petroff-Hauser en 7,7 x 105 cellen/mL zoals gemeten door het kiemgetal; Dit beeld toont 110 cellen, een uitstekende pasvorm aan de voorspelling. (C) DHM hologram in een Shewanella cultuur 2.0 ±0.1 x 105 cellen/ml gemeten door Petroff-Hauser en 2.0 ±0.3 x 10-5 cellen/mL zoals gemeten door het kiemgetal; Dit beeld toont 27 cellen. Schaal bar = 35 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: uitvoeren van reconstructies. (A) Open een hologram in Fiji. (B) draaien numerieke propagatie en geef de golflengte en beeld grootte. Kies een afstand z dicht bij 0 beginnen. (C) trekt een Fourier-masker wanneer gevraagd te selecteren van de reële- of virtueel beeld. (D) bad verwerking voorziet in reconstructies tijdens het volume. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: weergave van reconstructies. Beelden van Serratia cultuur op ~ 106 cellen/mL. (A) Raw hologram. (B) Fourier transform. Het gebied binnen de cirkel is het gebied worden gebruikt; de rest wordt gemaskeerd. (C) Amplitude wederopbouw op een enkel z-vliegtuig. (D) fase van wederopbouw op een enkel z-vliegtuig; de schaal-balk toont de faseverschuiving in graden. (E) Maximum intensiteit projectie door alle z-vliegtuigen in de fase-stack. (F) Volume weergeven van de volledige amplitude stack (365 x 365 x 800 µm). Schaal bar = 35 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Concentratie [cellen per mL] | Frames nodig |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Tabel 1: Minimum aantal vereiste monster volumes te detecteren van bacteriën door DHM (detectie vertrouwen van 50%).
| Eigenschap | Waarde | Eenheid |
| Operationele golflengte | 405 | nm |
| Objectieve numerieke diafragma | 0.3 | - |
| Vergroting van het systeem | 20 | - |
| Laterale resolutie | 0,7 | Μm |
| Imaging monstervolume | 360 x 360 x 800 | Μm x μm x μm |
| Lengte van het instrument | 400 | mm |
Tabel 2: Optische en prestaties specificaties voor de digitale holografische Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numerieke wederopbouw van hologrammen: voor de numerieke wederopbouw van hologrammen, de hoekige spectrum methode (ASM) wordt gebruikt. Het gaat hierbij om de convolutie van het hologram met de Greense functie voor de DHM. De complexe wavefront van de afbeelding op een bepaalde brandvlak kan worden berekend door gebruik te maken van de Fourier convolutie stelling als volgt:
(1)
Waar 
is de operator bij Fourier Transform, 
is de hologram matrix, en 
is de Greense functie voor de DHM, die is gedefinieerd als:
(2)
Waar 
is de afstand, langs de optische as, van het gewenste brandvlak te worden gereconstrueerd, 
is de golflengte van de verlichting, 
en 
zijn het aantal pixels in de x en y de richtingen, respectievelijk, en 
en 
zijn de pixel maten (op het vlak van de detector) in de x en y richtingen, respectievelijk40.
Van de complexe wave front, de intensiteit kan worden berekend door de omvang van het kwadraat van 
, en de fase kan worden verkregen door de boogtangens van het quotiënt tussen het imaginaire en reële deel van .
Wijzigingen en probleemoplossing
Experimenten met de opsomming van sparse bacteriële concentraties zijn zeer gevoelig voor besmetting, valse positieven en valse negatieven. Om deze reden, de groei en de opsomming van bacteriën, zijn alsmede de voorbereiding van zeer verdunde monsters voor DHM kritische stappen in dit experiment. Voorzichtigheid moet worden genomen om verontreiniging te vermijden in dit experiment door een zorgvuldige controle van de omgeving waar de bacteriën zijn gegroeid en geïnventariseerd. Sterilisatie van de juiste technieken, waaronder autoclaaf, helpen voorkomen tegen verontreiniging alsmede valse positieven. Voorkom verdere tegen valse positieven en werden bacteriën geselecteerd voor dit experiment die relatief unieke kenmerken (bijvoorbeeld S. marcescens heeft een zeer duidelijke rode kleur wanneer gekweekt) vertonen. Om te voorkomen dat tegen valse negatieven, werden de bacteriën gekozen voor dit experiment zodanig dat ze zou kunnen groeien op verrijkte cultuur platen, evenals karakteristieke vormen en/of beweeglijkheid patronen worden geïdentificeerd via DHM geselecteerd. Het is belangrijk om regelmatig te testen op besmetting en/of onverwachte celgroei door plating de monsters en kwantificeren van de bacteriën door kiemgetal.
Bij het uitvoeren van dit experiment, wordt een gegevensgrootte van ongeveer 2,4 GB per 1 mL van het monster verwacht. Dit nummer, is uiteraard afhankelijk van de camera en de bestandsindeling gebruikt. De gegevensgrootte gemeld is door het gebruik van een 4 Mpx-detector en een standaard TIFF-bestandsindeling. De post verwerking van de gegevens vereist ongeveer 6 min van de berekening per 1 mL van het monster. Deze verwerkingstijd werd waargenomen tijdens het gebruik van een 8-core-processor van Intel i7 van 3.5 GHz en 32 GB RAM-geheugen. Deze berekeningen kunnen worden heeft naar de GPU voor sterk verminderd doorlooptijden, maar was hier niet gedaan.
Beperkingen van de techniek
Hoewel DHM met behulp van zeer lage concentraties van bacteriën mogelijk is, is deze methode niet-specifieke. Morfologie alleen is niet een afdoend middel bacteriestammen te identificeren. Diagnostische toepassingen zal presenteren specifieke uitdagingen als gevolg van de aanwezigheid van niet-doelsoorten cellen en aggregaten. Het voordeel van het instrument van de dual-beam hier gepresenteerd is echter dat het vermag afbeelding bacteriën in relatief troebel monsters. De mogelijkheid om op te sporen van bacteriën in klinische monsters, en de mate van voorbehandeling van de monsters die vereist is, moet nog worden bepaald.
Kritische stappen in het protocol
Stap 2: Het verkrijgen van nauwkeurige verdunningen is essentieel bij kwantitatieve opsomming. Elke verdunningen gemaakt moeten worden ondersteund door kiemgetal. Stap 3: de keuze van debiet en bijbehorende framesnelheid moet zorgvuldig geschieden om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gezien. Aanpassing van de pomp geldende parameters moet zorgvuldig worden afgestemd alvorens een limiet van detectie experiment uit te voeren. Stap 4: voor zeer lage bacteriële concentraties, is het cruciaal om vast te leggen onvoldoende gegevens om te vertrouwen op detectie. Mogelijk moet u om enkele gegevens om er zeker van zijn dat cellen, en geen puin, zijn wordt gezien te reconstrueren. In extreme gevallen, kan meer dan 10 mL van oplossing worden verlangd. Niet-sporenvormende stammen zijn vaker worden dubbelzinnig dan motile stammen. Stap 5: als er dubbelzinnigheid in de gegevens, de wederopbouw kan helpen aantonen dat hologrammen cellen en geen puin vertegenwoordigen. Hoge resolutie reconstructies zal tonen klassieke cel morphologies en motiliteit is duidelijk te zien in sporen van motile stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de Gordon en Betty Moore Foundation subsidies 4037 en 4038 aan het California Institute of Technology voor financiering van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
