Summary
Digital holografiske mikroskopi (DHM) er en volumetriske teknikk som lar tenkelig prøver 50-100 X tykkere enn brightfield mikroskopi på sammenlignbare oppløsning, med fokusering utført etterbehandling. DHM brukes her til å identifisere, teller, og spore mikroorganismer på svært lav tetthet og sammenlignet med optisk densitet målinger, plate antall og direkte teller.
Abstract
Nøyaktig oppdage og teller sparsom bakteriell prøver har mange programmer i mat, drikke og behandling av farmasøytisk industri, medisinsk diagnostikk og for livet gjenkjenning av robot oppdrag til andre planetene og månene i solsystemet. Foreløpig telles sparsom bakteriell prøver av kultur plating eller epifluorescence mikroskopi. Kultur plater krever lang incubation ganger (dager til uker), og epifluorescence mikroskopi krever omfattende flekker og konsentrasjonen av prøven. Her viser vi hvordan du bruker off-aksen digital holografiske mikroskopi (DHM) til å nummerere bakterier i svært fortynne kulturer (100-104 celler/mL). Først diskuteres byggingen av den egendefinerte DHM, sammen med detaljerte instruksjoner på å bygge en rimelig instrument. Prinsippene for holography diskuteres og en statistisk modell brukes til å anslå hvor lenge videoer bør være å oppdage celler, basert på optisk ytelse karakteristikkene av instrumentet og konsentrasjonen av bakteriell løsningen (tabell 2) . Video gjenkjenning av celler på 105, 104, 103og 100 celler/mL demonstreres i sanntid ved hjelp av rekonstruert un hologrammer. Rekonstruksjon av amplitude og fase bilder er demonstrert ved hjelp av en åpen kildekode programvarepakke.
Introduction
Fastsettelse av nøyaktig bakteriell teller i svært fortynne prøver er avgjørende i mange programmer: noen eksempler er vann og mat kvalitet analyse1,2,3; påvisning av patogener i blodet, Cerebrospinalvæske eller sputum4,5; produksjon av farmasøytiske produkter, inkludert sterilt vann6; og miljømessige samfunnet analyse i næringsfattig miljøer som det åpne havet og sedimenter7,8,9. Det er også økende interesse for påvisning av mulig bevarte mikrobiell livet på isete månene til Jupiter og Saturn, spesielt Europa10,11 og Enceladus12,13, 14, som er kjent for å ha undergrunnen flytende hav. Fordi ingen misjon siden Viking i 1978 har forsøkt å finne bevarte livet på en annen planet, har det vært begrenset utvikling av teknologier og instrumenter for bakteriell identifikasjon og opptelling under plass oppdrag15.
Tradisjonelle metoder for plate teller finner bare culturable celler, som kan representere et mindretall av artene i miljømessige belastninger, noen ganger < 1%16. Plater krever dager eller uker med inkubering for maksimal suksess, avhengig av belastningen. Epifluorescence mikroskopi har i stor grad erstattet plate teller som gullstandarden for rask og nøyaktig mikrobiell opplisting. Nucleic acid-typen fluorescerende fargestoffer som 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR Green eller Akridin oransje som binder til nukleinsyrer er typisk fargestoffer brukes17,18,19 , selv om mange studier bruke fluorescerende indikatorer på Gram signere20,21,22,23,24. Ved hjelp av disse metodene uten pre konsentrasjon trinn fører til grensene for påvisning (LoDs) ~ 105 celler per mL. Forbedringer i LoD er mulig å bruke filtrering. En flytende prøven er vakuum-filtrert på en membran, vanligvis polykarbonat og ideelt svart å redusere bakgrunnen. Lav-bakgrunn fargestoffer som DNA flekker nevnt ovenfor kan brukes direkte på filteret25. For nøyaktig telling av øyet, ~ 105 celler kreves per filter, noe som betyr at for prøver mer fortynne enn ~ 105 celler per mL, signifikant utvalg volumer må samles og filtrert. Laser-skanning enheter er utviklet for å systematisk utforske alle regioner av filteret og dermed redusere antall celler kreves for opptelling, skyve grensene for gjenkjenning ned ~ 102 celler per mL26. Men dette er ikke tilgjengelig i de fleste laboratorier, og krever avansert maskinvare samt programvare som tillater ekspert bekreftelse på at observert partikler er bakterier og ikke rusk.
For referanse, voksne med sepsis begynner vanligvis viser symptomer på < 100 celler/mL blod og spedbarn på < 10 celler/mL. Uavgjort blod fra en voksen tar 10 mL, og fra et spedbarn, 1 mL. PCR-baserte metoder er hemmet av tilstedeværelsen av menneskelige og ikke-patogene flora DNA og PCR-hemmende komponenter i blod27,28. Til tross for en rekke nye teknikker fortsatt kulturer gullstandarden for diagnostisering av blodbanen infeksjoner, spesielt i mer landlige områder eller utviklingsland. Deteksjon av liv på andre planeter, kan termodynamisk beregninger beregne energi budsjettet for livet og dermed forventet mulig biomasse. 1 - 100 celler/mL forventes å være thermodynamically rimelig Europa29. Det kan lett sees fra disse tallene at påvisning av svært små tall i celler i store mengder vandig løsning er et viktig uløste problemet.
Dette papiret, vi viser deteksjon av Serratia marcescens og Shewanella oneidensis (vill-type og ikke-motile mutant) i konsentrasjoner av 105, 104, 103og 100 celler/mL bruker en off-aksen Digital holografiske mikroskopet (DHM). Den viktigste fordelen med DHM over tradisjonelle * lys er samtidige avbilding av en tykk eksempel volum med høy oppløsning-i denne implementeringen, prøve chamber var 0,8 mm tykk. Disse sample chambers ble konstruert av soft-litografi av polydimethylsiloxane (PDMS) fra en presisjons-maskinert aluminium mugg med en toleranse for ± 50 µm. Dette representerer en omtrent 100 ganger forbedring i dybden av feltet over høyeffekts * lys. DHM gir også kvantitativ informasjon, slik at for målinger av optisk banelengde (produkt brytningsindeks og tykkelse). DHM og lignende teknikker har blitt brukt for overvåking bakteriell og gjær celle syklus og beregning av bakteriell tørr masse30,31,32; spredning forskjeller kan også brukes til å skille bakteriell stammer33.
Instrumentet vi bruker er spesialbygd for bruk med mikroorganismer, som er publisert tidligere34,35, og design og konstruksjon er viste og diskutert. Vandige løsninger leveres kontinuerlig til en 0,25 µL volum eksempel kammer via sprøytepumpe; infusjonshastigheten bestemmes av kameraet bildefrekvens for å sikre bildebehandling av hele prøven. En statistisk beregning spår antall eksempel volumer som må avbildes for å oppdage et betydelig antall celler i en gitt konsentrasjon.
For celle-gjenkjenning programmer var rekonstruksjon av holograms i amplitude og fase bilder ikke nødvendig; analyse var utført på rå hologrammet. Dette sparer betydelige beregningsressurser og diskplass: et 500 Mb hologram video blir 1-2 Tb når rekonstruert. Men gjør vi diskutere gjenoppbyggingen gjennom dybde av prøven å bekrefte at holograms representerer den ønskede arten. En viktig funksjon i DHM er dens evne til å overvåke både intensiteten og fasen av bildene. Organismer som er nesten gjennomsiktig intensitet (som de fleste biologiske celler) vises tydelig i fase. Det er en etikett-fri teknikk, brukes ingen fargestoffer. Dette er en endvantage for mulig romferder programmer, siden fargestoffer ikke kan overleve betingelsene for en misjon og, enda viktigere, kan ikke antas for å arbeide med utenomjordisk organismer, som ikke kan bruke DNA eller RNA for koding. Det er også en fordel for arbeid i ekstreme miljøer som Arktis og Antarktis, hvor fargestoffer kan være vanskelig å få til den eksterne plasseringen og kan svekkes ved lagring. Rekonstruksjon av bilder i fase og amplitude utføres ved hjelp av en åpen kildekode programvarepakke som vi gjort tilgjengelig på GitHub (SJAMPO) eller ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vekst og opplisting av bakterier
Merk: Dette gjelder for nesten alle bakterielle belastningen vokst i den aktuelle middels 36. I vårt eksempel, bruker vi tre stammer: Serratia marcescens som en vanlig, lett identifiserbare lab stamme; og en mindre, svært motile miljømessige belastninger, Shewanella oneidensis MR-1. Hvis du vil sammenligne påvisning av motile vs ikke-motile celler, ikke-motile Shewanella mutant, Δ FlgM, brukes også for sammenligning 37. Alle stammer er dyrket i lysogeny kjøttkraft (LB).
- Forberede sterilt LB medium (per liter destillert vann: 10 g bacto tryptone, 5 g bacto gjær, 10 g NaCl; filter eller autoklav). Forberede standard 100 mm diameter LB-agar plater (samme oppskrift som middels pluss 15 g agar per liter, autoklav (121 ° C, 20 min) å sterilisere og hell når kjølig nok til å håndtere). Lagre medium og plater i kjøleskapet.
- Dagen før eksperimentet frø 5-6 mL " Master " kultur medium fra en fersk bakterie kolonien, bruker riktig sterilt og biosikkerhet teknikk. Ruge på en shaker (120 rpm) på 30 ° C for ~ 12 h. inkubasjon tid vil være avhengig av hastigheten belastning og vekst. I vårt forsøk, er Shewanella stammene ruges i 12 timer; men Serratia er høstet etter 8 timer, for å sikre kulturen vil vise midt logaritmisk vekst.
- Dagen for eksperimentet, ta en Spektrofotometri lesning (OD 600) av bakterielle Master kultur, som forventes å være i størrelsesorden 0,6 til 0,7. Det bør være i logaritmisk vekstfase (som angitt tidligere). Hvis ikke, subkultur 100 µL i 5 mL av middels og la cellevekst til midten av Logg fase.
- Ta en prøve av Master kultur og telle celler direkte ved hjelp av en Petroff-Hausser teller kammer. Dette vil nummerere både levende og døde celler.
- Ekstra et 10 µL eksempel ufortynnet kulturen med brønnene og overføring til kammeret.
- Bildet under høy tørr objektive mikroskop (40 X eller 63 X, NA 0,7 - 0,8) bruke kontrast.
- Teller bakterier i minst 20 ruter og gjennomsnitt.
Merk: Tell bare de bakteriene som er helt innenfor en firkant og bare de krysset over toppen og venstre grenser (eller bunn og høyre, hvis du foretrekker). Hvis rutene skilles med flere linjer, Velg ett som grensen. - Beregn konsentrasjonen som gjennomsnittet av 20 ruter x fortynningsfaktoren. Merk at direkte teller ikke fungerer godt for konsentrasjoner < 10 7 / mL.
- Gjøre føljetong fortynninger av kulturen for telling av colony-forming enheter (CFU). Dette vil nummerere bare levende celler.
- Gjør en seriell fortynning av hver av de valgte bakterielle prøvene med sterilt 0,9% saltvann løsning. Overføring 20 µL av bakteriell løsningen og fortynn den med 180 µL saltvann. Gjenta til den laveste konsentrasjonen er ~ 10 3 celler/mL.
- Ta 100 µL fra minst to fortynninger-foreslo er 10 3 og 10 4 /mL — og plate på en solid mediefil plate. Spre med en bakteriefri sprederen. Utføre minst 3 gjenskapninger av hver fortynning.
- Ruge på en passende temperatur for din bakterier over natten eller til koloniene vokse.
- Teller kolonier og beregne kolonien danner enheter (CFU) ifølge (# kolonier x fortynningsfaktoren) / volum belagt = CFU/mL. Gjentak i gjennomsnitt CFU.
2. Forberedelse av svært fortynne prøver til DHM
- gjør føljetong fortynninger av Master kultur for DHM og post-DHM telling av colony-forming enheter på LB media plater (se 1.4.1 - 1.4.4). Utføre denne dobbelt-blind slik at personen gjør opptakene er uvitende om konsentrasjonen i hver målte prøve.
- Fortynne bakterier i 10-15 mL av en minimal medium som vil oppmuntre motilitet (etter behov) men hemme celledeling, slik at konsentrasjonen av celler ikke endres merkbart under eksperimentet. Dette kan være 0,9% saltvann eller en mer spesifikk motilitet medium. For eksempel, hvis bruker Escherichia coli, inneholde motilitet medium EDTA 38. For disse eksemplene bruker vi 0,9% saltløsning.
3. Registrere DHM videoer
- bruker sterile sprøyter, trekke i ca 10 mL av fortynning interessepunkter.
- Koble sprøyten til DHM prøve chamber bruker sterilt beslag og rør.
Merk: Et skreddersydd microfluidic kammeret ble bygget for å tillate konsekvent eksempel gjennom den optiske banen av instrumentet. Se resultatene for mer informasjon. Før eksperimentet, bør alle komponenter for eksempel kammeret steriliseres ved autoklavering. - Flow prøven fra sprøyten gjennom eksempel kammeret kontinuerlig med en sprøytepumpe.
Merk: Aktuelle flyt priser varierer fluidic kanal dimensjoner, ønsket gjennomstrømming samt data oppkjøpet begrensninger. - Som prøven flyter gjennom eksempel kammeret, erverve hologrammer fortløpende på en passende bildefrekvens. En tidsangivelse fil opprettes som logger av hvert bilde fange senere under dataanalyse (protocol seksjon 4). Få alle hologrammer ved omgivelsestemperatur (23° C). Registrere hologrammer ved å kjøre en pre-skrevet C++ kjørbar fil fra kameraprodusenten.
Merk: Riktig bildefrekvens varierer infusjonshastigheten valgt. For dette eksperimentet, anbefales det å bruke en bildefrekvens slik at en bakterie ville avbildes > 2 ganger det reist over instrumentet ' s synsfelt. - Gi tilstrekkelig tid for det hele 10 mL av prøve skal flyte gjennom DHM.
- å sikre at bakterier ikke vokser eller dør under eksperimentene, vaksinere beriket media plater med 100 µL av brukte media innlegg-DHM image fange. Spre med en bakteriefri sprederen og ruge på riktig temp i 24 timer; telle kolonier stede.
4. Beregningen av cellen tetthet og grenser gjenkjenning
- med ervervet hologrammet videoer, analysere dataene for tilstedeværelse av bakterier.
- Beregne medianen bildepunktverdien for en tid hologrammer deretter trekke median verdien fra hver respektive piksel å fjerne stillestående gjenstander i hologrammet. Dette kan gjøres i ImageJ ved å utføre følgende trinn:
- konvertere til 32-biters (bilde-Type-32 bit)
- beregne medianen (Image-Stack-Zproject-Median)
- trekke medianen fra resten av stabel ( Process-ImageCalculator-Subtract)
- telle antall synlige luftige ringer og i fokus celler manuelt. I ImageJ, dette gjøres ved å peke på objekter med verktøyet punkt.
- Hver rekke hologrammer vil bli ledsaget av en tidsstempel fil (registrert på tidspunktet hologram). Bruk filen tidsstempel til å beregne den totale mengden sample pumpet på tidspunktet bildet ble tatt.
- Beregne medianen bildepunktverdien for en tid hologrammer deretter trekke median verdien fra hver respektive piksel å fjerne stillestående gjenstander i hologrammet. Dette kan gjøres i ImageJ ved å utføre følgende trinn:
- Beregne celle tettheten ved å dele antall celler oppdaget av det totale volumet av prøven fotografert. Gjennomsnittlig 5-10 rammer for nøyaktig statistikk.
5. Bildet gjenoppbygging til Amplitude og fase
- Velg representant videoer med 10-200 celler per bilde. Laste inn rå (ikke median-trukket) hologrammer i gjenoppbygging programvaren (eksempler: ImageJ numeriske forplantning 39; SJAMPO [GitHub]).
- Bruker ImageJ, gå til OD-numerisk overføring-numerisk Diffraksjon.
- Ved ledeteksten, tegne en Fourier maske å velge ekte eller virtuelt bilde og fjerne sinusformet støy funksjoner.
- Rekonstruere amplitude og fase z-fremgangsmåten ved å angi rekonstruksjon avstanden.
- Median trekke amplituden data å redusere støy som 4.1.1.
- Plot data som en 3D-kube eller fremvisersystemet. Gå til Plugins — volumet visningsprogrammet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene bør angi muligheten til å oppdage levende og døde bakterier på svært lave nivåer av DHM. Hvor mange bakterier telles bør være konsekvent med resultatene ved hjelp av Petroff-Hauser telling kammer og plate teller. Standard statistiske metoder gir informasjon om nøyaktigheten av ulike gjenkjenningsmetoder i ulike bakteriell konsentrasjoner.
Figur 1 viser Petroff-Hausser teller kammeret samt mikrostruktur av telling kammer som brukes i direkte nummereringen i celler. Figur 2A viser en typisk beriket kultur plate som har fått tilstrekkelig tid for S. marcescens å vokse kolonier (16 timer ved romtemperatur). Figur 2B viser vekst kurver for alle påkjenningen brukes. Mens nøyaktig spektrofotometer målinger varierer, bør forholdet mellom OD600 og kolonien teller være lineær innen pålitelig spektrofotometer; vi målt ~ OD600 = 0,1 som ~ 108/mL. Den direkte Petroff-Hausser teller og kolonien teller bør godta innen 10% til cellene begynner å dø sett av omsetning i vekstkurve.
Figur 3 viser utformingen av egendefinerte eksempel kamre. Egendefinerte microfluidic chambers ble brukt til dette eksperimentet for å tillate kontinuerlig eksempel gjennom synsfeltet holografiske mikroskopet. Standard microfluidic teknikker og materialer er brukt i konstruksjonen av prøven kamre. Blunt tippet rustfritt stål nåler med mannlige Luer-Lok beslag ble satt inn i microfluidic enheten gi innløp og utløp porter til prøve chamber. Microfluidic kanal geometrien ble etablert av den myke litografi av polydimethylsiloxane (PDMS) bruker maskinert aluminium master mold, som ble komprimert, via aluminium rammer, mellom to optisk kvalitet glassvinduer. PDMS etablerer kanal flytgeometri samt sikrer sprøyte nåler, som gir væske transport til og fra strømmen kanalene. Disse sample kamre bruk PDMS utelukkende å etablere flyt kanal geometri og dermed inneholder ingen PDMS i den optiske banen av instrumentet. Merk at på grunn av optisk natur en off-aksen holografiske mikroskop, to mikro-kanaler ble støpt parallelle med hverandre i prøven kammeret. Dette er ment å matche optiske banen lengder mellom begge armene av interferometer (referert til som 'prøven' og 'reference' armene). Referanse kanalen bare inneholde sterilt media, og bør ikke utsettes flyt.
Figur 4 viser en skjematisk og bilder av digitale holografiske mikroskopet i gjennomføringen laboratorium. Det drives av programvaren som følger med kameraet. Figur 5 viser representant DHM data for bakteriell opplisting og deres korrespondanse med anslått antall celler per synsfelt. Fra rå hologrammer, uten gjenoppbygging, er det mulig å se og telle celler ved median subtraksjon og manuell oppfølging. Dette reduserer beregningsorientert byrden sammenlignet rekonstruere alle z-fly, som rå holograms vise cellene i dybden av kammeret. Utseendet til kulturer i ulike konsentrasjoner og deres korrespondanse med plate teller og Petroff-Hauser telle angis. Totalt celletall bestemmes av gjennomsnittlig antall celler sett i hvert eksempel volum over det totale antallet volumer fotografert. Grensen for påvisning bestemmes av antall eksempel volumer fotografert. I dette eksperimentet satt vi en maksimal grense på denne verdien, med maksimal totalt 10 mL av prøve avbildet i 0,25 µL intervaller (totalt 40 000 bilder per prøve). Opptakene stoppes før det maksimale totale volumet er oppnådd hvis cellene er tydelig observert i hver ramme over en rekke 20 bilder. I en tidligere papir rapporterte vi en formel for å beregne antall eksempel volumer for å oppdage bakterier på en 50% sikkerhetsnivå i konsentrasjonene varierer fra 1-105 celler/mL (tabell 1). Basert på dette anslaget, skal en undersøkelse av alle 40.000 rammer deteksjon av celler på 1/mL, selv om denne beregningen er beregningsmessig intensiv.
Figur 6 viser bruk av gjenoppbygging programvare (Fiji)39. Et enkelt hologram åpnes og programvaren "OD-numerisk overføring-numerisk Diffraksjon" er. Parameterne tenkelig er gitt i dialogboksen. amplitude, intensitet og fasen kan alle bli rekonstruert. En enkelt z-fly kan velges eller satsvis Rekonstruksjoner kan brukes til å rekonstruere hele dybden.
Figur 7 viser rekonstruksjoner av amplitude og fase bilder på ulike dybder i en utvalgt utvalg. Fourier maske brukt til å generere rekonstruksjoner vises, sammen med en median-trukket intensitet bilde, en fase bilde, en maksimal projeksjon gjennom fase bunken og en volum projeksjon av stabel intensitet.
Figur 1: direkte telling av bakterieceller. Bakteriell konsentrasjon i celler/mL beregnes ved å telle antall bakterier i teller kammer og skalering at antall regnskap for det faktum at Petroff-Hauser kammeret bare inneholder 20 nL av prøven. (A) den Petroff-Hausser teller kammer. (B) bilde av teller kammer mikrostruktur under 10 X kontrast, viser av forskjellige størrelser nyttig for opplisting celler i forskjellige størrelser. (C) utseendet på S. marcescens i telling kammer minste feltene. 40 x kontrast. (D) metode for å telle som utelater celler faller på de øvre og høyre kantene (N), men ikke nedre og venstre kantene (Y). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: telle celler av kolonien vekst og optisk densitet. (A) S. marcescens ruges i romtemperatur 16 timer. På riktig uttynnet bør kultur platerhar 20-200 koloniene for nøyaktig teller og statistikk. Platen vises er noe for folk for pålitelig opptelling. (B) vekst kurver for de 3 påkjenningen brukes. En optisk densitet 0,1 tilsvarer ~ 108 celler/mL, men nøyaktige verdier varierer med apparatet. Direkte Petroff-Hauser teller enig med plate teller til innenfor 10% innen lineær vekst. Feilfelt representerer standardavviket for 5 uavhengige utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempel kammer design. (A) Microfluidic skjematisk (prøven og referanse microchannels merket). (B) montert ferdig prøven kammer. (C) eksploderte CAD vise vise konstituerende elementer av prøven kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk og bilder av digitale holografiske mikroskopet. (A) skjematisk viser fire hovedelementer: kilden, prøven (prøve banen er merket Spec. og referansebane kalles Ref.) mikroskopet og sensoren. (B) Solid modellen for maskinvaren. Samlingen fiber-matet kilde er nederst imaging kameraet er på toppen. Mikroskopet optikk-består av de to asfærisk linsene og relé linsen-finnes innen 300 mm lang linse røret. Tre-akse scenen mellom kilden mikroskop optikk gir enkel manuell manipulering av prøven under studien. (C) fotografi av instrumentet i laboratoriet. Baren skala i nedre del av bildet representerer 1 tomme. Schematics trukket re fra Wallace et al. 34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: vekst kurver og representant DHM data. (A) Predicted celler per synsfelt basert på et utvalg antall 365 µm x 365 µm x 1 mm. Det optimale området for DHM opplisting vises i rektanglet, og virkelige eksempler er angitt som (B) og (C). (B) DHM hologram av en Shewanella kultur på 8 x 105 celler/mL målt ved Petroff-Hauser og 7,7 x 105 celler/mL målt ved plate teller; Dette bildet viser 110 celler, et utmerket skikket til prediksjon. (C) DHM hologram av en Shewanella kultur på 2,0 ±0.1 x 105 celler/mL målt ved Petroff-Hauser og 2.0 ±0.3 x 105 celler/mL målt ved plate teller; Dette bildet viser 27 celler. Skala bar = 35 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: utfører rekonstruksjoner. (A) åpne et hologram i Fiji. (B) kjøre numeriske forplantning og angi den bølgelengde og bildestørrelse. Velg z avstand nær 0 å starte. (C) tegn en Fourier maske når bedt om å velge ekte eller virtuelt bilde. (D) bad behandling gir rekonstruksjoner hele volumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: utseendet på rekonstruksjoner. Bilder av Serratia kultur på ~ 106 celler/mL. (A) rå hologram. (B) Fourier transform. Området innenfor sirkelen er området som skal brukes; resten er maskert. (C) amplituden rekonstruksjon på et enkelt z-fly. (D) fase rekonstruksjon på et enkelt z-fly; baren skala viser faseskift i grader. (E) maksimum intensitet projeksjon gjennom alle z-fly i fase stakken. (F) volum vise i full amplituden stabelen (365 x 365 x 800 µm). Skala bar = 35 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Konsentrasjonen [celler per mL] | Rammer nødvendig |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Tabell 1: Minimum antall nødvendige eksempel volumer å oppdage bakterier av DHM (deteksjon tillit på 50%).
| Egenskapen | Verdi | Enhet |
| Opererer bølgelengde | 405 | NM |
| Objektive numeriske blenderåpning | 0,3 | - |
| Systemet forstørrelse | 20 | - |
| Lateral oppløsning | 0,7 | Μm |
| Eksempel Imaging volum | 360 x 360 x 800 | Μm x μm x μm |
| Instrumentet lengde | 400 | mm |
Tabell 2: Optisk og ytelse spesifikasjoner for digital holografiske mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numerisk rekonstruksjon av hologrammer: For numeriske gjenoppbyggingen av hologrammer, brukes metoden kantete spektrum (ASM). Dette innebærer convolution av hologrammet med Green funksjon for DHM. Den komplekse wavefront av bildet til en bestemt fokalplanet kan beregnes ved hjelp av Fourier Convolution teoremet som følger:
(1)
Hvor 
er operatoren Fourier Transform 
er hologrammet matrix, og 
Green funksjon av DHM, som er definert som:
(2)
Hvor 
er avstanden, langs den optiske aksen, ønsket fokalplanet kan rekonstrueres, 
er belysning bølgelengdeområdet, 
og 
er antall piksler i x og y retninger, henholdsvis, og 
og 
er pixel (på detektoren flyet) i x og y retninger, henholdsvis40.
Fra komplekse bølgen fronten, intensiteten kan beregnes med omfanget kvadrat av 
, og fasen kan fås ved arctangensen for kvotienten mellom de reelle og imaginære delene av .
Endringer og feilsøking
Eksperimenter med opplisting av sparsom bakteriell konsentrasjoner er svært utsatt for forurensning og falske positiver feilaktige negativer. For denne grunn, vekst og opplisting av bakterier, er samt utarbeidelse av svært fortynne prøver for DHM avgjørende skritt i dette eksperimentet. Forsiktighet må utvises å unngå forurensning i dette eksperimentet ved å nøye kontrollere hvor bakterier er vokst og nummerert. Riktig sterilisering teknikker, inkludert autoklavering, forhindre mot forurensning og falske positiver. For å forhindre mot falske positiver, ble bakterier valgt for dette eksperimentet som viser relativt unike egenskaper (f.eks S. marcescens har en veldig distinkt rød farge når kultivert). For å forhindre feilaktige negativer, ble bakterier valgt for dette eksperimentet valgt slik at de kunne vokse på beriket kultur plater, samt har karakteristiske figurer og/eller motilitet mønstre identifiseres via DHM. Det er viktig å regelmessig teste for forurensning og/eller uventet cellevekst ved plating prøvene og kvantifisere bakterier av platen greven.
I å gjennomføre dette eksperimentet, forventes en datastørrelsen på omtrent 2,4 GB per 1 mL av prøven. Dette nummeret, selvfølgelig, er avhengig av kameraet og fil format brukes. Datastørrelsen rapportert er ved bruk av en 4 Mpx-detektor og en standard TIFF-filformatet. Etterbehandling dataene krever omtrent 6 min for beregning per 1 mL av prøven. Denne behandlingstid ble observert mens du bruker en Intel i7 8 kjerner prosessor på 3,5 GHz og 32 GB RAM. Disse beregningene kan være parallelized til GPU for sterkt redusert saksbehandlingstid, men ble ikke gjort her.
Begrensninger av teknikken
Mens det er mulig å bruke DHM for å oppdage svært lave konsentrasjoner av bakterier, er denne metoden uspesifikke. Morfologi alene er ikke en avgjørende måte å identifisere bakteriell stammer. Diagnostiske applikasjoner vil presentere de spesifikke utfordringene av ikke-målet celler og aggregat. Men er fordelen av dual-beam instrumentet presenteres her at det er kjøpedyktig bilde bakterier i relativt grumset prøver. Muligheten til å oppdage bakterier i klinisk eksempler og graden av pre-prosessering av prøvene som kreves, gjenstår for å fastsettes.
Avgjørende skritt i protokollen
Trinn 2: Få nøyaktige fortynninger er avgjørende for kvantitative opplisting. Noen fortynninger laget skal sikkerhetskopieres av platen greven. Trinn 3: valg av flyt og tilsvarende bildefrekvens må gjøres forsiktig å sikre at alle celler er sett. Justering av parameterne pumpen skal stilles nøye før du utfører en grense på oppdagelsen eksperiment. Trinn 4: For svært lave bakteriell konsentrasjoner er det avgjørende å fange nok data til å være trygg gjenkjenning. Det kan være nødvendig å rekonstruere data for å være sikker på at celler og ikke rusk, blir sett. I ekstreme tilfeller, kan mer enn 10 mL løsning være nødvendig. Ikke-motile stammer er mer sannsynlig å være tvetydig enn motile stammer. Trinn 5: Hvis det er noen tvetydighet i dataene, rekonstruksjon kan bidra til å vise at hologrammer representerer celler og ikke rusk. Høyoppløselig rekonstruksjoner vil vise klassiske celle morphologies, og motilitet kan tydelig sees i spor av motile stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter Gordon og Betty Moore Foundation gir 4037 og 4038 til ved California Institute of Technology for finansiering dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
