Summary
Digitala holografisk mikroskopi (DHM) är en volymetriska teknik som tillåter imaging prover 50-100 X tjockare än brightfield mikroskopi på jämförbar upplösning, med fokusering utförs efterbearbetning. DHM används här för att identifiera, räkna, och spårning mikroorganismer vid mycket låga tätheter och jämfört med optisk densitet mätningar, plattan, antal och direkt.
Abstract
Korrekt upptäcka och räknar glesa bakteriell prover har många tillämpningar i mat, dryck och farmaceutiska beredningsindustrin i medicinsk diagnostik, och för livet upptäckt av robotic uppdrag till andra planeter och månar i solsystemet. För närvarande räknas glesa bakteriell prover av kultur bordläggning eller epifluorescence mikroskopi. Kultur plattor kräver lång inkubation times (dagar till veckor), och epifluorescence mikroskopi kräver omfattande färgning och koncentrationen i provet. Här visar vi hur du använder off-axeln digital holografisk mikroskopi (DHM) att räkna upp bakterier i mycket utspädd kulturer (100-104 celler/mL). Först diskuteras byggandet av den anpassade DHM, tillsammans med detaljerade instruktioner om att bygga en låg kostnad instrument. Principerna för holografi diskuteras, och en statistisk modell används för att uppskatta hur länge videor bör vara att identifiera celler, baserat på optisk prestandaegenskaper för instrumentet och koncentrationen av bakteriell lösningen (tabell 2) . Video upptäckt av celler 105, 104, 103och 100 celler/mL demonstreras i realtid med hjälp av un-rekonstruerade hologram. Rekonstruktion av amplitud och fas bilder demonstreras med en öppen källkod-paketet.
Introduction
Bestämning av korrekt bakteriell räknas i mycket utspädda prover är avgörande i många applikationer: några exempel är vatten och mat kvalitet analys1,2,3; patogener i blod, ryggmärgsvätska eller sputum4,5. tillverkning av farmaceutiska produkter, inklusive sterilt vatten6; och miljörörelsen analys i näringsfattiga miljöer såsom den öppna ocean och sediment7,8,9. Det ökar också intresset för upptäckt av möjliga bevarade mikrobiellt liv på de isiga moonsna av Jupiter och Saturnus, särskilt Europa10,11 och Enceladus12,13, 14, som är känt för att ha under markytan flytande världshaven. Eftersom inga uppdrag sedan Viking i 1978 har försökt att hitta bevarade liv på en annan planet, har det varit begränsad utveckling av teknik och instrument för bakteriell identifiering och inventering under utrymme uppdrag15.
Traditionella metoder för plattspridning hitta endast odlingsbara celler, som kan representera en minoritet av arter i miljömässiga stammar, ibland < 1%16. Plattorna kräver dagar eller veckor för inkubation för maximal framgång, beroende på belastningen. Epifluorescence mikroskopi har till stor del ersatt plattan räknas som den gyllene standarden för snabb och noggrann mikrobiell uppräkning. Nucleic-acid-märkning fluorescerande färger såsom 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI), SYBR Green eller akridin orange som binder till nukleinsyror är typiska färgämnen används17,18,19 , även om många studier använder fluorescerande indikatorer gram logga20,21,22,23,24. Med dessa metoder utan före koncentrationen steg leder till detektionsgränser (LoDs) ~ 105 celler per mL. Förbättringar i LoD är möjligt med hjälp av filtrering. Ett flytande prov är vakuum-filtrerad på ett membran, oftast polykarbonat och helst svart att minska bakgrunden. Låg-bakgrund färgämnen som DNA fläckarna nämns ovan kan appliceras direkt på de filter25. För noggrann inventering av ögat, ~ 105 celler krävs per filter, vilket betyder att för prover mer utspädd än ~ 105 celler per mL, betydande provvolymer måste samlas in och filtreras. Laserskanning enheter har utvecklats för att systematiskt utforska alla regioner i filtret och därmed minska antalet celler krävs för inventering, driver detektionsgränser ner till ~ 102 celler per mL26. Men dessa är inte tillgängliga i de flesta laboratorier, och kräver sofistikerade hårdvara samt mjukvara som tillåter expert bekräftelse som observerats partiklar är bakterier och inte skräp.
För referens, vuxna med sepsis brukar börja visar symtom på < 100 celler/mL blod och spädbarn på < 10 celler/mL. En blodprovstagning från en vuxen tar 10 mL, och från ett spädbarn, 1 mL. PCR-baserade metoder hämmas genom närvaron av mänskliga och icke-patogena floran DNA och PCR-hämmande komponenter i blodet27,28. Trots en mängd ny teknik fortfarande kulturer den gyllene standarden för diagnos av blodinfektioner, särskilt i mer lantliga områden eller utvecklingsländer. För påvisande av liv på andra planeter, kan termodynamiska beräkningar uppskatta energi budgeten för livet och därmed den förväntade möjligt biomassan. 1 - 100 celler/mL förväntas vara thermodynamically rimlig på Europa29. Det kan lätt ses från dessa siffror att upptäckten av ett mycket litet antal celler i stora mängder vattenlösning är ett viktigt olösta problem.
I detta papper, vi visar upptäckt av Serratia marcescens och Shewanella oneidensis (wild-type och icke-rörliga mutant) vid koncentrationer av 105, 104, 103och 100 celler/mL med hjälp av en off-axeln Digital holografisk Mikroskop (DHM). Den viktigaste fördelen med DHM över traditionella ljusmikroskopi är den samtidiga avbildning av en tjock provvolymen med hög upplösning — i detta genomförande, i provkammaren var 0,8 mm tjock. Dessa prov kammare konstruerades av den mjuka-litografin av Polydimetylsiloxan (PDMS) från en precision-frästa aluminium mögel med en tolerans på ± 50 µm. Detta är en cirka 100-faldig förbättring i djup i fältet över high-power ljusmikroskopi. DHM ger också kvantitativa fas information, vilket möjliggör mätningar av optiska ljuspassagelängden (produkt av brytningsindex och tjocklek). DHM och liknande metoder har använts för övervakning av bakterier och jäst cellcykeln och beräkning av bakteriell torr massa30,31,32. scattering skillnader kan även användas för att differentiera bakteriestammar33.
De instrument som vi använder är specialbyggda specifikt för användning med mikroorganismer, som tidigare publicerade34,35, och dess design och konstruktion är visade och diskuterade. Aqueous lösningar levereras kontinuerligt till en 0,25 µL volym provkammare via sprutpump; flödet bestäms av kamerans bildfrekvens för att säkerställa avbildning av den hela provvolymen. En statistisk beräkning förutspår antalet provvolymer som måste avbildas för att upptäcka ett betydande antal celler vid en given koncentration.
För cell-påvisande program var rekonstruktion av hologram i amplitud och fas bilder inte skyldig; analysen utfördes på raw hologrammet. Detta sparar betydande dataresurser och diskutrymme: ett 500 Mb hologram video blir 1-2 Tb när rekonstrueras. Dock diskutera vi återuppbyggnad genom djup av provet att bekräfta att hologram motsvarar önskad arten. Ett viktigt inslag i DHM är dess förmåga att övervaka både intensitet och fas av bilderna. Organismer som är nästan transparent i intensitet (såsom de flesta biologiska celler) visas tydligt i fas. Eftersom det är en etikett-fri teknik, används inga färgämnen. Detta är en endvantage för möjliga rymdfärder program, eftersom färgämnen inte kan överleva villkoren för ett uppdrag och – ännu viktigare — inte kan antas för att arbeta med utomjordiska organismer, som inte får använda DNA eller RNA för kodning. Det är också en fördel för arbete i extrema miljöer såsom Arktis och Antarktis, där färgämnen kan vara svårt att få till fjärrplatsen och försämras vid förvaring. Rekonstruktion av bilderna i fas och amplitud utförs med hjälp av en programvara med öppen källkod paket som vi har gjort tillgänglig på GitHub (schampo) eller ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillväxt och uppräkning av bakterier
Obs: Detta gäller för nästan alla bakteriestam som odlas i den lämpliga medium 36. I vårt exempel använder vi tre stammar: Serratia marcescens som en gemensam, lätt identifierbara lab stam; och en mindre, mycket rörliga miljöbelastningen, Shewanella oneidensis MR-1. För att jämföra detektering av rörliga vs. icke-motila celler, en icke-rörliga Shewanella mutant, Δ FlgM, används också för jämförelse 37. Alla stammar odlas i lysogeny buljong (LB).
- Förbereda sterila LB medium (per liter destillerat vatten: 10 g bacto trypton, 5 g bacto jäst, 10 g NaCl; filter eller autoklav). Förbereda standard 100 mm diameter LB-agar plattor (samma recept som medium plus 15 g agar per liter, autoklav (121 ° C, 20 min) att sterilisera och häll när tillräckligt svalt för att hantera). Förvara i kylskåpet på medium och plattorna.
- Dagen innan experimentet utsäde 5-6 mL " Master " odlingsmedium från en färsk bakteriell koloni, med rätt sterila och biosäkerhet teknik. Inkubera i en shaker (120 rpm) vid 30 ° C för ~ 12 h. inkubationstid kommer att bero på den belastning och tillväxttakt. I vårt experiment ruvas Shewanella stammar i 12 timmar; dock Serratia skördas efter 8 timmar för att säkerställa att kulturen kommer att ställa ut mitten-logaritmisk tillväxt.
- Dagen för experimentet, ta en spektrofotometrisk avläsning (OD 600) av bakteriella ledar-kultur, som förväntas vara i intervallet 0,6 till 0,7. Det bör vara i logaritmisk tillväxtfasen (enligt tidigare). Om inte, subkultur 100 µL i 5 mL medium och tillåta celltillväxt till fasen mitten av log.
- Ta ett prov av befälhavaren kultur och räkna cellerna direkt med hjälp av en Petroff-Hausser räknar kammare. Detta kommer att räkna upp både levande och döda celler.
- Extrahera ett 10 µL prov av de outspädda kulturen med en mikropipett och överföring in i kammaren.
- Bild i hög-torr objektiva Mikroskop (40 X eller 63 X, NA 0,7 - 0,8) med faskontrast.
- Räkna bakterier i minst 20 rutor och genomsnittliga.
Notera: Räknas endast de bakterier som är helt inom en kvadrat och endast dessa passerar över toppen och vänster gränser (eller nedre och höger, om du föredrar). Om rutor skiljs åt av flera rader, Välj en som en gräns. - Beräkna koncentrationen som genomsnittet av 20 rutor x utspädningsfaktor. Observera att direkt räknas inte fungerar bra för koncentrationer < 10 7 / mL.
- Gör seriespädningar av kultur för inventering av kolonibildande enheter (CFU). Detta kommer att räkna upp levande celler endast.
- Göra en seriell utspädning av varje vald bakteriella prov med steril 0,9% koksaltlösning lösning. Överför 20 µL av den bakteriella lösningen och späd med 180 µL saltlösning. Upprepa tills den lägsta koncentrationen är ~ 10 3 celler/mL.
- Ta 100 µL från minst två utspädningar-föreslog är 10 3 och 10 4/ml — och plattan på en lämplig fast media tallrik. Sprids med en steril spridare. Utför minst 3 replikat för varje spädningssteg.
- Inkubera vid en lämplig temperatur för dina bakterier över natten eller tills kolonierna växer.
- Räkna kolonier och beräkna kolonibildande enheter (CFU) enligt (# av kolonier x utspädningsfaktor) / volym förkromad = CFU/mL. Genomsnittliga CFU de replikerar.
2. Beredning av mycket Späd prover för DHM
- gör seriespädningar av Master kultur för DHM och post-DHM räkning av kolonibildande enheter på LB media tallrikar (se 1.4.1 - 1.4.4). Utföra denna dubbel-blind så att personen gör inspelningarna är omedvetna om koncentrationen i varje uppmätt prov.
- Späda ut bakterierna i 10-15 mL en minimal medium som kommer att uppmuntra motilitet (som lämpligt) men hämmar celldelning, så att koncentrationen av celler inte förändras nämnvärt under experimentet. Detta kan vara 0,9% koksaltlösning eller en mer specifik motilitet medium. Till exempel om du använder Escherichia coli, måste motilitet medium innehålla EDTA 38. För exemplen, använder vi 0,9% koksaltlösning.
3. Registrera DHM videor
- med en steril spruta, dra i ca 10 mL utspädning av intresse.
- Anslut sprutan till den DHM provkammare använder sterila kopplingar och slangar.
Obs: En skräddarsydd mikroflödessystem kammare konstruerades för att möjliggöra konsekventa flödet av provet genom den optiska vägen av instrumentet. Se avsnittet resultat för mer detaljer. Innan experimentet, alla komponenter i en provkammare ska steriliseras i autoklav. - Flow provet från sprutan genom provkammaren kontinuerligt använder en sprutpump.
Obs: Lämpligt flöde varierar beroende på fluidic kanal dimensioner samt önskad genomströmning och data förvärv begränsningar. - Som provet flödas igenom provkammaren, förvärva hologram i följd på en lämplig bildfrekvens. En tidsstämpel fil kommer att skapas som loggar tiden för varje bild fånga användas senare under dataanalys (protokoll avsnitt 4). Få alla hologram vid rumstemperatur (23° C). Spela in hologram genom en redan skrivna C++ körbara filen som tillhandahålls av kameratillverkaren.
Observera: Lämplig ram varierar beroende på flödet valt. För detta experiment, är det rekommenderat att använda en bildhastighet så att en bakterie skulle avbildas > 2 gånger som det reste över instrumentet ' s synfält. - Tillräckligt med tid för den hela 10 mL av provet vara flödat igenom DHMEN.
- Att säkerställa att bakterier inte växer eller dö under experimenten Inokulera berikad media plattor med 100 µL av den förbrukade media post-DHM Bildinsamling. Sprids med en steril spridare och inkubera vid lämplig temp i 24 timmar. räkna kolonier närvarande.
4. Beräkning av Cell densiteten och detektion gränser
- med de förvärvade hologram videorna, analysera data för förekomst av bakterier.
- Beräknar medianvärdet pixelvärdet för en tidsserie med hologram och sedan subtrahera detta medianvärdet från varje respektive pixel att eliminera stationära artefakter i hologrammet. Detta kan göras i ImageJ genom att utföra följande steg:
- konvertera till 32-bitars (bild-typ-32 bitars)
- Beräkna medianen (bild-Stack-Zproject-Median)
- subtrahera medianvärdet från resten av den stack ( Process-ImageCalculator-Subtract)
- räkna antalet synliga luftiga ringar och i fokus celler manuellt. I ImageJ, detta görs genom att peka på objekt med verktyget punkt.
- Varje serie av hologram kommer att åtföljas av en tidsstämpel fil (inspelad vid förvärvstidpunkten hologram). Använd filen tidsstämpel för att beräkna den totala mängden prov pumpas på gång bilden fångades.
- Beräknar medianvärdet pixelvärdet för en tidsserie med hologram och sedan subtrahera detta medianvärdet från varje respektive pixel att eliminera stationära artefakter i hologrammet. Detta kan göras i ImageJ genom att utföra följande steg:
- Beräkna cell densiteten genom att dividera det totala antalet celler upptäckts av den totala volymen av provet som avbildas. Genomsnitt 5-10 ramar för noggrann statistik.
5. Bild återuppbyggnad till amplitud och fas
- Välj representativa videor med 10-200 celler per bildruta. Läsa in rå (inte median-subtraheras) hologram i programvaran återuppbyggnad (exempel: ImageJ numeriska förökning 39; SCHAMPO [GitHub]).
- Med hjälp av ImageJ, gå till OD-numeriska förökning-numeriska diffraktion.
- Vid prompten ritar du en Fourier mask för att välja den verkliga eller virtuella bild och eliminera eventuella sinusformad buller funktioner.
- Rekonstruera amplitud och fas på lämpliga z-åtgärder genom att ange återuppbyggnad avståndet.
- Median subtrahera amplitud data att minska buller som i 4.1.1.
- Tomt data som en 3D-kub eller projektion. Gå till Plugins — volym Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten bör indikera förmågan att upptäcka levande och döda bakterier på mycket låga nivåer av DHM. Antalet bakterier räknas bör överensstämma med de resultat som erhållits med Petroff-Hauser räknande kammare och plattan räknas. Statistiska standardmetoder innehåller information om riktigheten av de olika identifieringsmetoder vid olika bakterie koncentrationer.
Figur 1 visar Petroff-Hausser räknande kammaren används samt mikrostrukturen i räknande kammaren som används i den direkta uppräkningen av celler. Figur 2A visar en typisk berikad kultur-platta som har tillåtits tillräcklig tid för S. marcescens växa kolonier (16 timmar vid rumstemperatur). Figur 2B visar tillväxtkurvor för alla de stammar som används. Medan de exakta spektrofotometer mätningarna varierar, bör förhållandet mellan OD600 och kolonin räkna vara linjär inom intervallet tillförlitlig spektrofotometerns; Vi mätte ~ OD600 = 0,1 som ~ 108/ml. Den direkta Petroff-Hausser räknar och kolonin räknas bör enas om att inom 10% tills cellerna börjar dö som ses av omsättning i tillväxtkurvan.
Figur 3 visar utformningen av anpassade prov kamrarna. Anpassade mikroflödessystem chambers användes för detta experiment för att tillåta ett kontinuerligt flöde av provet genom synfältet av holografiska mikroskopet. Standard mikroflödessystem tekniker och material användes i konstruktionen av provet kamrarna. Blunt tippas rostfria nålar med manlig Luer-Lok beslag fördes in i ultrakalla enheten att tillhandahålla in- och utsugningskanaler till avdelningen i provet. Mikroflödessystem kanal geometri grundades av den mjuka litografin av Polydimetylsiloxan (PDMS) använder en aluminium herre mögel, som komprimerades, via aluminiumramar, mellan två optiska kvalitet glasfönster. PDMS upprättar flöde kanal geometrier samt säkrar injektionssprutor, som ger flytande transport till och från flödet kanaler. Dessa prov kammare används PDMS enbart att upprätta flöde kanal geometri och innehåller därmed inga PDMS i den optiska vägen av instrumentet. Observera att två micro-kanaler var gjuten optiska pågrund av ett off-axeln holografisk Mikroskop, parallellt med varandra i en provkammare. Syftet är att matcha optisk väg längder mellan båda armarna av interferometern (benämnd 'exemplar' och 'referens' armarna). Kanalen hänvisning endast bör innehålla sterila media och bör inte omfattas av flöde.
Figur 4 visar en schematisk och bilder av den digitala holografiska mikroskopet i dess laboratorium genomförande. Det drivs av programvara som medföljde kameran. Figur 5 visar representativa DHM data för bakteriell uppräkning och deras överensstämmelse med förväntade antalet celler per synfält. Från raw hologram, utan återuppbyggnad, är det möjligt att se och räkna cellerna av median subtraktion och Manuell spårning. Detta minskar avsevärt den computational börda jämfört rekonstruera alla z-plan, som rå hologram Visa cellerna hela djup av kammaren. Uppkomsten av kulturer på olika koncentrationer och deras korrespondens med plate count och Petroff-Hauser count indikeras. Totala blodkroppar bestäms av antalet celler som sett i varje provvolymen över det totala antalet volymer som avbildas i genomsnitt. Detektionsgränsen bestäms av det totala antalet provvolymer avbildas. I detta experiment satt vi en maxgräns på detta värde, med sammanlagt högst 10 mL av provet som avbildas i 0,25 µL steg (sammanlagt 40.000 bilder per prov). Inspelningarna är stannade innan den totala maxvolymen uppnås om celler observeras tydligt i varje bildruta över en serie av 20 ramar. I en föregående uppsats rapporterade vi en formel för att beräkna antalet provvolymer som behövs för att upptäcka bakterier på en 50% konfidensnivå på koncentrationer från 1-105 celler/mL (tabell 1). Baserat på denna uppskattning, bör en undersökning av alla 40.000 ramar möjliggöra upptäckt av celler vid 1/mL, även om denna beräkning är processorkrävande.
Figur 6 visar användningen av återuppbyggnad programvara (Fiji)39. Ett enda hologram öppnas och programvaran ”OD-numeriska förökning-numeriska diffraktion” körs. Imaging parametrar anges i dialogrutan. amplitud, intensitet och fas kan alla rekonstrueras. En enda z-planet kan väljas eller batch rekonstruktioner kan användas för att rekonstruera hela djupet.
Figur 7 visar rekonstruktioner av amplitud och fas bilder på olika djup i ett urval. Fourier masken används för att generera rekonstruktionerna är visas, tillsammans med en median-subtraheras intensitet bild, en fas-bild, en maximal projektion genom fas stacken och en volym projektion av intensitet stacken.
Figur 1: direkt räkna av bakterieceller. Bakteriella koncentration i celler/mL beräknas genom att räkna det totala antalet bakterier i räknar kammare och skalning som nummer redovisning för det faktum att Petroff-Hauser kammaren endast innehåller 20 nL av provet. (A) The Petroff-Hausser räknar kammare. (B) bilden av räknar kammare mikrostruktur under 10 X faskontrast, visar lådor i olika storlekar som är användbar för att räkna upp cellerna i olika storlekar. (C) uppkomsten av S. marcescens inom räknande kammare minsta rutorna; 40 x faskontrast. (D) metoden för att räkna som utesluter celler som faller på den övre och högra kanten (N), men inte de nedre och vänstra kanterna (Y). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: räkna cellerna genom koloni tillväxt och optisk densitet. (A) S. marcescens inkuberas vid rumstemperatur i 16 timmar. Med rätt utspädning bör kultur plattorhar 20-200 kolonier för korrekt räkna och statistik. Den plattan som visas är något alltför trångt för tillförlitlig inventering. (B) tillväxt kurvor för de 3 stammar som används. En optisk densitet på 0,1 motsvarar ~ 108 celler/mL, men exakta värden variera av instrumentet. Direkta Petroff-Hauser räknas håller med plattan räknas till inom 10% inom intervallet linjär tillväxt. Felstaplar representera standardavvikelsen för 5 oberoende prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: prova kammare design. (A) mikroflödessystem Schematisk (förlagan och referens mikrokanaler märkt). (B) färdigmonterad provkammare. (C) exploderade CAD Visa visar provkammaren brottsrekvisit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk och bilder av den digitala holografiska mikroskopet. (A) Schematisk visar fyra huvuddelar: källan, provet (preparatet sökväg är märkt Spec. och referenssökväg är märkt Ref.), Mikroskop och sensorn. (B) Solid modell av maskinvaran. Fiber-matade källa församlingen är längst, och imaging kameran är överst. Mikroskopet optik – består av två asfäriska linser och relä linsen – finns inom 300 mm långa objektiv röret. Treaxlig scenen mellan källan Mikroskop optiken ger lätt manuell manipulation av preparatet under studien. (C) fotografi av instrumentet i laboratoriet. Skalstapeln i den nedre delen av bilden representerar 1 tum. Schemat är åter dras från Wallace m.fl. 34. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: tillväxtkurvor och representativa DHM uppgifter. (A) uppskattad celler per synfält som baseras på en provvolymen 365 µm 365 µm x 1 mm. Det optimala intervallet för DHM uppräkning visas i rektangeln och riktiga prover anges som (B) och (C). (B), DHM hologram av en Shewanella kultur på 8 x 105 celler/mL mätt med Petroff-Hauser och 7,7 x 105 celler/mL mätt med plate count; denna bild visar 110 celler, en utmärkt passform till prognos. (C), DHM hologram av en Shewanella kultur 2,0 ±0, 1 x 105 celler/ml mätt med Petroff-Hauser och 2.0 ±0.3 x 105 celler/mL mätt med plate count; denna bild visar 27 celler. Skalstapeln = 35 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: utför rekonstruktioner. (A) öppna ett hologram i Fiji. (B) kör numeriska förökning och anger den våglängd och bild storleken. Välj en z avstånd nära 0 att starta. (C) rita en Fourier mask när du uppmanas att välja real eller virtuell bild. (D) bad bearbetning möjliggör rekonstruktioner i hela volymen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: utseendet på rekonstruktioner. Bilder av Serratia kultur på ~ 106 celler/mL. (A) Raw hologram. (B) Fourier transform. Området inuti cirkeln är området som skall användas. resten är maskerad. (C) amplitud återuppbyggnad på ett enda z-plan. (D) fas återuppbyggnad på ett enda z-plan; skalstapeln visar fasförskjutning i grader. (E) maximal intensitet projektion genom alla z-plan i fas stack. (F) volym Visa av full amplitud stacken (365 x 365 x 800 µm). Skalstapeln = 35 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Koncentration [celler per mL] | Ramar som behövs |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Tabell 1: Minsta antal obligatoriska provvolymer att upptäcka bakterier av DHM (upptäckt förtroende 50%).
| Boende | Värde | Enhet |
| Rörelseresultat våglängd | 405 | nm |
| Objektiva numeriska bländaröppningen | 0,3 | - |
| Systemet förstoring | 20 | - |
| Lateral Resolution | 0,7 | Μm |
| Provvolymen Imaging | 360 x 360 x 800 | Μm x μm x μm |
| Instrumentet längd | 400 | mm |
Tabell 2: Optisk och prestandaspecifikationer för mikroskopet digital holografisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numeriska rekonstruktion av hologram: för numeriska återuppbyggnaden av hologram, används metoden kantiga spektrum (ASM). Detta innebär faltningen av hologrammet med Greens funktion för DHMEN. Den komplexa wavefront av bilden på en viss fokalplan kan beräknas genom att anställa Fourier faltning sats enligt följande:
(1)
Där 
är operatorn Fourier Transform, 
är hologram matrisen, och 
är de grönas funktion av DHMEN, som definieras som:
(2)
Där 
är avståndet längs den optiska axeln, av önskad fokalplanet rekonstrueras, 
är belysningen våglängd, 
och 
är antalet pixlar i x och y riktningar, respektive, och 
och 
är de pixel storlekarna (på detektorn planet) i x och y riktningar, respektive40.
Framifrån komplexa våg, intensiteten kan beräknas genom omfattningen fyrkant av 
, och fasen kan erhållas av arcus tangens av kvoten mellan de inbillade och verkliga delarna av .
Modifieringar och felsökning
Experiment med uppräkning av glesa bakterie koncentrationer är mycket mottagliga för smitta, falska positiva och falska negativa. För denna anledning, tillväxt och uppräkning av bakterier, är samt utarbetandet av mycket utspädda prover för DHM viktiga steg i detta experiment. Försiktighet måste iakttas för att undvika kontaminering i detta experiment genom att noggrant kontrollera miljön där bakterier odlas och räknas upp. Ordentlig sterilisering tekniker, inklusive autoklavering, förhindra mot kontaminering samt falska positiva. För att ytterligare förhindra mot falsklarm, valdes bakterier för detta experiment som uppvisar relativt unika egenskaper (t.ex. S. marcescens har en mycket distinkt röd färg när odlade). För att förhindra mot falska negativa, var bakterierna valt för detta experiment utvalda så att de skulle kunna växa på berikad kultur plattor, samt har karakteristiska former och/eller motilitet mönster identifieras via DHM. Det är viktigt att regelbundet testa för förorening eller oväntade celltillväxt genom plätering proverna och kvantifiera bakterier av bakterier.
Genomför detta experiment, förväntas en datastorlek ungefär 2,4 GB per 1 mL av provet. Detta nummer, är naturligtvis beroende av kameran och fil format som används. Storleken på data som rapporterats är genom användning av en 4 Mpx-detektor och en standard TIFF format. Efterbehandling av data kräver ungefär 6 min av uträkningen per 1 mL av provet. Detta handläggningstiden observerades när du använder en Intel i7 8-core-processor på 3,5 GHz och 32 GB RAM. Dessa beräkningar kan vara parallelized till Grafikprocessorn för kraftigt minskade handläggningstider, men var inte klar här.
Begränsningar av tekniken
Även om det är möjligt att använda DHM för att upptäcka mycket låga koncentrationer av bakterier, är denna metod ospecifika. Morfologi ensam är inte ett avgörande sätt att identifiera bakteriestammar. Diagnostik program kommer att presentera specifika utmaningar på grund av förekomsten av icke-målceller och aggregat. Fördelen med dual-beam instrumentet presenteras här är dock att det är kunna bild bakterier i relativt grumliga prover. Förmågan att upptäcka bakterier i kliniska prover och graden av förbehandling av prov som krävs, återstår bestämmas.
Kritiska steg i protokollet
Steg 2: Att erhålla korrekt utspädningar är viktigt att kvantitativa uppräkning. Alla spädningar som gjorts bör säkerhetskopieras av bakterier. Steg 3: val av flöde och motsvarande bildhastighet måste göras noggrant se till att alla celler ses. Justering av parametrarna pump bör stämmas noggrant innan du utför en gräns av upptäckt experiment. Steg4: för mycket låga bakterie koncentrationer, är det viktigt att fånga tillräckligt med data för att vara säkra på att upptäcka. Det kan vara nödvändigt att rekonstruera vissa data för att vara säker på att celler och inte skräp, är att bli sedd. I extrema fall kan det krävas mer än 10 mL lösning. Icke-rörliga stammar är mer sannolikt att vara tvetydig än rörliga stammar. Steg 5: om det finns tvetydigheter i data, rekonstruktion kan bidra till att visa att hologram representerar celler och inte skräp. Högupplösta rekonstruktioner visar klassiska cell morfologier och motilitet kan tydligt ses i spår av rörliga stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Gordon och Betty Moore Foundation bidrag 4037 och 4038 till California Institute of Technology för att finansiera detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
