Summary
מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) היא טכניקה הנפחי המאפשרת הדמיה דגימות ש-50-100 X עבה יותר brightfield מיקרוסקופ ברזולוציה דומות, עם התמקדות ביצע עיבוד דפוס. כאן סוג התושבות שלהם מופיעים משמש לזיהוי, סופר, ומעקב מיקרואורגניזמים-מאוד נמוך צפיפות לעומת מדידות צפיפות אופטית צלחת ספירה, ספירה ישירה.
Abstract
זיהוי וספירת דגימות בקטריאליות דליל במדויק היא נדבך מזון ומשקאות, תעשיות התרופות עיבוד, בתוכנית האבחון הרפואי, ועל גילוי החיים על ידי משימות רובוטיות אחרות כוכבי לכת, ירחים של מערכת השמש. כיום, דגימות בקטריאליות דליל נספרים על ידי מיקרוסקופ ציפוי או epifluorescence תרבות. תרבות צלחות דורשים זמן דגירה פעמים (ימים עד שבועות), ודורש מיקרוסקופ epifluorescence מכתים נרחב וריכוז של המדגם. . הנה, נדגים כיצד להשתמש מהציר דיגיטלי מיקרוסקופ הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) כדי ספירת חיידקים בתרבויות שתדללו מאוד (100-104 תאים/mL). ראשית, נדון הקמת סוג התושבות שלהם מופיעים מותאם אישית, יחד עם הוראות מפורטות על בניית כלי נגינה בעלות נמוכה. העקרונות של הולוגרפיה נידונות, ומשמשת מודל סטטיסטי כדי להעריך כמה זמן צריך קטעי וידאו ניתן לזהות תאים, בהתבסס על מאפייני ביצועים אופטיים של המכשיר ועל הריכוז של הפתרון חיידקי (טבלה 2) . זיהוי וידאו של תאים ב-105, 104, 103ותאים למ"ל 100 הוכח בזמן אמת באמצעות הולוגרמות האו ם המשוחזרת. שחזור של משרעת ותמונות שלב הוא הפגין באמצעות חבילת תוכנות קוד פתוח.
Introduction
הנחישות של ספירת חיידקים מדויק בדגימות שתדללו מאוד חיוני ביישומים רבים: כמה דוגמאות מים ומזון באיכות ניתוח1,2,3; זיהוי של פתוגנים דם, נוזל מוחי שדרתי או sputum4,5; ייצור של מוצרים פרמצבטיים, כולל במים סטריליים6; וניתוח סביבתי קהילתי בסביבות oligotrophic כגון פתוח האוקיינוס ואת משקעים7,8,9. גם גוברת ההתעניינות גילוי החיים מיקרוביאלי אפשרי הקיימים על הירחים הקפואים של יופיטר ושבתאי, במיוחד Europa10,11 ו-12,אנקלדוס13, 14, אשר ידועים מהסבא האוקיינוסים נוזלי. כי אין משימה מאז ויקינג בשנת 1978 ניסתה למצוא הקיימים חיים בכוכב אחר, חלה התפתחות מוגבלת של טכנולוגיות וכלים עבור זיהוי חיידקים וספירת במהלך משימות שטח15.
שיטות מסורתיות של הרוזן הצלחת למצוא רק culturable תאים, אשר יכולים לייצג מיעוט של מינים של זנים סביבתיים, לפעמים < 1%16. צלחות דורשים ימים או שבועות של דגירה להצלחה מקסימלית, כתלות במתח. מיקרוסקופ Epifluorescence החליף במידה רבה צלחת ספירות כמו תקן זהב עבור ספירת חיידקים מהיר ומדויק. גרעין-חומצה-תיוג צבעי פלורסנט כגון 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי), SYBR ירוק או כתום acridine זה לאגד חומצות גרעין הן צבע אופייני בשימוש17,18,19 , על פי מחקרים רבים להשתמש ניאון שילוט גרם לחתום20,21,22,23,24. בשיטות אלה ללא ריכוז שלפני מדרגות מוביל אל הגבולות של זיהוי (LoDs) של תאי5 ~ 10 מ"ל. שיפורים בלוד אפשריים באמצעות סינון. דגימת נוזל היא ואקום-מסוננים על גבי הממברנה, בדרך כלל פוליקרבונט ושחור אידיאלי כדי להפחית את הרקע. נמוך-רקע צבענים כמו הכתמים DNA הנ ל ניתן להחיל ישירות את המסנן25. עבור ספירה מדויקת לפי העין, תאים5 ~ 10 נדרשים לכל מסנן, ופירוש לדוגמאות ובדילול מאשר תאי5 ~ 10 מ"ל, דגימה משמעותי חייב להיות שנאספו ואמצעי סינון. מכשירי סריקה בלייזר פותחו על מנת לחקור באופן שיטתי את כל האזורים של המסנן, וכך להפחית את מספר התאים הדרושים עבור ספירה, דוחפים את הגבולות של זיהוי אל תאי2 ~ 10 מ ל26. עם זאת, אלה לא יהיו זמינות, במעבדות רוב והן דורשות חומרה מתוחכמים כמו גם תוכנה כי היתר אישור מומחה כי נצפתה חלקיקים הם חיידקים ופסולת לא.
לעיון, מבוגרים עם אלח דם בדרך כלל מתחילים להופיע התסמינים-< 100 תאים למ"ל של דם, ותינוקות -< 10 תאים/מ ל. תיקו דם במבוגר לוקח 10 מ"ל, וממנו תינוק, 1 מ"ל. שיטות מבוססות-PCR מעוכבים על ידי הנוכחות של פלורה פתוגניים שאינם ואנושי DNA על ידי עיכוב PCR הרכיבים השונים הדם27,28. למרות מגוון רחב של טכניקות המתעוררים, תרבויות נשארים תקן הזהב לאבחון של זיהומים למחזור הדם, ובמיוחד באזורים הכפריים יותר או מדינות מתפתחות. גילוי של חיים על כוכבים אחרים, חישובים תרמודינמי יכולים להעריך את התקציב אנרגיה עבור החיים ובכך ביומסה אפשרי הצפוי. 1 - תאים למ"ל 100 צפויים להיות הגיוני למה ב- Europa29. ניתן בקלות לראות ממספרים אלה כי זיהוי של מספר קטן מאוד של תאים של כמויות גדולות של תמיסה מימית היא בעיה לא פתורה חשוב.
בנייר זה, נדגים זיהוי של סרישיה marcescens , Shewanella oneidensis (מוטציה פראי-סוג, שאינם תאי) בריכוזים של 105, 104, 103ו- 100 תאים למ"ל באמצעות ציר. מיקרוסקופ הולוגרפית דיגיטלי (סוג התושבות שלהם. מופיעים). היתרון המפתח של סוג התושבות שלהם מופיעים על מיקרוסקופ אור המסורתית היא ההדמיה סימולטני של אמצעי אחסון מדגם עבה ברזולוציה גבוהה — ביישום זה, היה תא הדגימה בעובי 0.8 מ מ. צ'יימברס דוגמת אלה נבנו על ידי הרך-ליתוגרפיה של polydimethylsiloxane (PDMS) של תבנית אלומיניום במכונה-דיוק עם סובלנות של ± 50 מיקרומטר. זה מייצג שיפור כ 100-fold לעומק של שדה מעל ובעוצמת מיקרוסקופ אור. סוג התושבות שלהם מופיעים גם מספקת מידע שלב כמותית, המאפשרות מדידות של מרחק אופטי (מוצר של שבירה, עובי). סוג התושבות שלהם מופיעים ובטכניקות דומות שימשו עבור ניטור בקטריאלי, מחזור התא שמרים, חישוב של חיידקי יבש המונים30,31,32; פיזור ההבדלים עשוי לשמש גם כדי להבדיל בין זני חיידקים33.
המכשיר שנשתמש שהותקן במיוחד לשימוש עם מיקרואורגניזמים, שפורסמו בעבר34,35, תכנון ובנייה, הם הפגינו ודן. פתרונות מימית מסופקים ללא הרף לתא 0.25 µL נפח דגימה באמצעות משאבת מזרק; קצב הזרימה נקבעת על ידי קצב מסגרות המצלמה כדי להבטיח הדמיה של אמצעי האחסון מדגם כולו. חישוב סטטיסטי מנבאת את מספר אמצעי האחסון מדגם חייב לדימות כדי לזהות מספר משמעותי של תאים על ריכוז נתון.
ליישומים זיהוי תא, לא היה שחזור של הולוגרמות לתוך משרעת ותמונות שלב הכרחי; הניתוח בוצע על ההולוגרמה raw. פעולה זו חוסכת שטח דיסק ומשאבים רבים חישובית: הולוגרמה 500 מגה וידאו יהיה 1-2 טרה-בתים כאשר שיחזר. עם זאת, נדון שחזור באמצעות עומק של הדגימה כדי לאשר כי הולוגרמות מייצגים את המין הרצוי. תכונה חשובה של סוג התושבות שלהם מופיעים הוא יכולתה לפקח הן בעוצמה והן שלב של התמונות. אורגניזמים שקופים כמעט בעוצמת (כמו רוב התאים ביולוגי) מופיעים בבירור שלב. כמו היא טכניקה ללא תווית, אין צבעים משמשים. . זהdvantage ליישומים טיסת חלל אפשרי, מאחר צבעי עלול לא לשרוד את התנאים של משימה, — וחשוב מכך – אי אפשר להניח לעבוד עם אורגניזמים מחוץ לכדור הארץ, אשר רשאי להשתמש DNA או RNA לקידוד. . זה גם יתרון לעבודה בסביבות קיצוניות כגון הקוטב הדרומי, שבו צבע עלול להיות קשה להביא את המיקום המרוחק ו עלולה להיפגם בעת אחסון... שחזור של תמונות לתוך שלב משרעת מתבצע באמצעות חבילת תוכנות קוד פתוח שאנחנו עשינו הזמינים ב GitHub (שמפו) או באמצעות ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. וצמיחה של ספירה של חיידקים
הערה: זה חל על כמעט כל זן חיידקי גדל בינונית המתאימה 36. בדוגמה שלנו, אנו משתמשים שלושה זנים: בסרישיה marcescens כמו זן נפוץ, קל לזיהוי המעבדה; קטן יותר, מאוד תאי סביבתיים זן, מר Shewanella oneidensis-1. כדי להשוות בין גילוי של תאי לעומת בתאים שאינם תאי, שאינם תאי מוטציה Shewanella, Δ FlgM, משמשת גם השוואה 37. כל הזנים גדלים מרק lysogeny (LB).
- הכן אמצעי סטרילי ליברות (לליטר מים מזוקקים: 10 גרם מה נשארתי טריפטון, 5 g מה נשארתי שמרים, 10 גרם NaCl; מסנן או אוטוקלב). להכין סטנדרטי 100 מ מ קוטר LB-אגר צלחות (באותו מתכון בינוני פלוס אגר 15 גרם לליטר; autoclave (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) כדי לעקר ויוצקים כאשר גזעיות מספיק. כדי להתמודד עם). חנות בינונית, צלחות במקרר.
- יום לפני הניסוי זרע 5-6 מ"ל של " אב " תרבות בינוני של מושבת חיידקים טריים, באמצעות הטכניקה הנכונה וסטרילי, אבטחה. דגירה על מטרף (120 סל ד) ב 30 מעלות צלזיוס במשך זמן הדגירה ~ 12 ה. יהיה תלוי על שער זן וצמיחה. בניסויים שלנו, זנים Shewanella מודגרת למשך 12 שעות; עם זאת, בסרישיה הוא נקצרו לאחר 8 שעות, על מנת להבטיח התרבות ממשיכות להציג צמיחה אמצע-לוגריתמי.
- היום של הניסוי, לקחת קריאה spectrophotometric (OD 600) של בקטריאלי מאסטר תרבות, אשר צפוי להיות בטווח של 0.6-0.7. זה צריך להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי (כפי שנקבע בעבר). אם לא, תת-תרבות 100 µL לתוך מ של מדיום מאפשר צמיחת תאים לשלב יומן באמצע.
- לקחת דגימה של המאסטר תרבות ולספור את התאים ישירות באמצעות ספירת Petroff-Hausser קאמרית. זה ספירת תאים חיים וגם מתים.
- לחלץ מדגם 10 µL של התרבות מדולל עם micropipette, העברת לתוך החדר.
- תמונה תחת מיקרוסקופ אובייקטיבית גבוהה-יבש (40 X או 63 X, נה 0.7 - 0.8) באמצעות הניגוד שלב.
- לספור את החיידקים לפחות 20 ריבועים, ממוצע.
הערה: לספור רק אלה חיידקים אשר לחלוטין בתוך ריבוע, רק אלה הצלבה העליון הגבולות השמאלי (או התחתון ואת. אם אתה מעדיף). אם ריבועים מופרדים על-ידי מספר שורות, בחר אחת בתור גבול.
ריבועים - חישוב ריכוז כממוצע של 20 x פקטור דילול. שימו לב: ישיר ספירות לא עובד טוב של ריכוזי < 10 7 / mL-
- להפוך דילולים טורי של התרבות עבור ספירה של המושבה יוצרי יחידות (CFU). זה ספירת תאים חיים רק.
פתרון
- לגרום לדילול טורי של כל הדגימות חיידקי שנבחרו עם סליין 0.9% סטרילי. העברת µL 20 של הפתרון חיידקי, למהול אותו בתמיסת µL 180. חזור עד הריכוז הנמוך ביותר הוא ~ 10 3 תאים/מ ל....
- µL לקחת 100 מ לפחות שניים הציע דילולים הם 10 3 ו- 10 4 /mL — צלחת בצלחת המדיה המתאימה מוצק. מורחים עם מפזר סטרילי. לבצע לפחות 3 ושכפול של כל דילול.
- דגירה בטמפרטורה המתאימה לחיידקים שלך למשך הלילה או עד מושבות לגדול.
- לספור מושבות ולחשב המושבה יוצרי יחידות (CFU) על פי (# של מושבות x פקטור דילול) / אמצעי האחסון מצופה = CFU/mL. ממוצע CFU מעל משכפל.
2. הכנת דוגמאות לדלל מאוד עבור סוג התושבות שלהם מופיעים
- להפוך דילולים טורי של המאסטר תרבות עבור סוג התושבות שלהם מופיעים וספירת פוסט-סוג התושבות שלהם מופיעים של המושבה יוצרי יחידות על לוחות מדיה ליברות (ראה 1.4.1 - 1.4.4). לבצע זה הכפול סמיות, כך האדם עושה את ההקלטות הוא מודע הריכוז בכל מדגם נמדד.
- לדלל את החיידקים בתוך 10-15 מ של מדיום מינימלי לעודד תנועתיות (לפי הצורך) אבל לעכב את חלוקת התא, כך הריכוז של תאים לא משנה ניכרת במהלך הניסוי. זה עשוי להיות saline 0.9% או מדיום תנועתיות יותר ספציפי. לדוגמה, אם משתמש Escherichia coli, תנועתיות בינוני להכיל EDTA 38. לקבלת דוגמאות אלה, אנו משתמשים saline 0.9%.
3. הקלטת סרטוני וידאו סוג התושבות שלהם מופיעים
- באמצעות מזרק סטרילי, למשוך פנימה בערך 10 מ"ל של דילול עניין.
- להתחבר את המזרק תא הדגימה סוג התושבות שלהם מופיעים באמצעות אביזרי סטרילי, אבובים.
הערה: תא microfluidic בהזמנה אישית נבנתה על מנת לאפשר את הזרימה עקבית של הדגימה דרך הנתיב אופטי של המכשיר. עיין בסעיף התוצאות לפרטים נוספים. לפני הניסוי, כל מרכיבי תא הדגימה צריכה להיות מחוטא ע י autoclaving. - לזרום המדגם של המזרק דרך החדר מדגם באופן רציף באמצעות מזרק משאבה.
הערה: זרימה המתאים התעריפים נקבעים על פי מידות ערוץ fluidic, התפוקה הרצויה, כמו גם המגבלות רכישת נתונים. - כפי המדגם מוזרם דרך החדר לדוגמה, רוכשים הולוגרמות ברציפות בקצב המסגרת המתאימה. קובץ חותמת זמן תיווצר אשר יומני רישום הזמן של כל תמונה ללכוד לשמש מאוחר יותר במהלך ניתוח נתונים (פרוטוקול סעיף 4). להשיג כל הולוגרמות בטמפרטורת החדר (23° C). להקליט הולוגרמות על ידי הפעלת שנכתבו מראש C++ קובץ הפעלה שסופקו על-ידי יצרן המצלמה.
הערה: מסגרת המתאימה התעריפים נקבעים על פי קצב הזרימה שבחרת. עבור ניסוי זה, מומלץ להשתמש קצב מסגרות כאלה חיידק לדימות > פי 2 הוא נסע על פני הכלי כמו ' s שדה ראייה. - לאפשר מספיק זמן עבור 10 מ ל כל מדגם זרימה דרך סוג התושבות שלהם מופיעים.
- על מנת להבטיח כי חיידקים לא צומחות או למות במהלך הניסויים, לחסן מועשר מדיה צלחות עם 100 µL של לכידת תמונה מדיה בילה פוסט-סוג התושבות שלהם מופיעים. להפיץ עם מפזר סטרילי וכי תקופת דגירה-temp המתאים של 24 שעות; לספור מושבות נוכח.
4. חישוב צפיפות התאים, מגבלות של זיהוי
- עם הולוגרמה רכשה קטעי וידאו, לנתח את הנתונים עבור נוכחות של חיידקים-
- לחשב את ערך הפיקסל החציוני עבור סדרה זמן של הולוגרמות ואז לחסר ערך זה החציוני של כל פיקסל המתאימים כדי לסלק חפצים נייחים ב ההולוגרמה. זה יכול להיעשות ב- ImageJ על-ידי ביצוע השלבים הבאים:
- להמיר ל- 32 סיביות (תמונה-סוג-32 bit)
- חישוב החציון (תמונה-מחסנית-Zproject-Median)
- לחסר החציון משאר חברי (סטאק Process-ImageCalculator-Subtract)
- לספור את מספר טבעות האווריריים גלויים ותאים בפוקוס באופן ידני. ב- ImageJ, זאת על-ידי מכוון האובייקטים עם הכלי נקודת.
- כל סדרה של הולוגרמות ילווה על ידי קובץ חותמת זמן (נרשמה בזמן רכישת הולוגרמה). שימוש הקובץ חותמת זמן כדי לחשב הסכום הכולל של מדגם שאוב בזמנו את התמונה צולמה.
- לחשב את ערך הפיקסל החציוני עבור סדרה זמן של הולוגרמות ואז לחסר ערך זה החציוני של כל פיקסל המתאימים כדי לסלק חפצים נייחים ב ההולוגרמה. זה יכול להיעשות ב- ImageJ על-ידי ביצוע השלבים הבאים:
- לחשב את צפיפות תא על-ידי חלוקת המספר הכולל של תאים שזיהה את הנפח הכולל של הדגימה עם תמונה. ממוצע של 5-10 מסגרות עבור סטטיסטיקה מדויקת.
5. תמונת שחזור משרעת, שלב
- בחר נציג קטעי וידאו עם 10-200 תאים לכל מסגרת. לטעון הולוגרמות (לא חציון-המופחת) גולמיים לתוך התוכנה שחזור (דוגמאות: הפצת מספריים ImageJ 39; שמפו [GitHub]).
- באמצעות ImageJ, ללכת עקיפה הפצת מספריים OD-מספריים.
- בשורת הפקודה, לצייר מסכה פורייה לבחור אמיתי או וירטואלי התמונה ולחסל את כל התכונות רעש sinusoidal.
- לשחזר משרעת ושלב ב- z-צעדים מתאימים על-ידי הזנת המרחק שחזור.
- חציון תפחית את הנתונים משרעת כדי להפחית את הרעש כמו 4.1.1.
- נתוני ההתוויה כמו 3D קוביה או הקרנה. עבור אל תוספים — מציג נפח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות צריך לציין את היכולת לזהות חיידקים חי וגם מת ברמות נמוכות מאוד על ידי סוג התושבות שלהם מופיעים. מספר החיידקים נספרים צריך להיות עקבי עם התוצאות המתקבלות באמצעות Petroff-האוזר הספירה קאמרית וצלחת הסעיפים. שיטות סטטיסטיות סטנדרטי לספק מידע על הדיוק של שיטות זיהוי שונה בריכוזים שונים חיידקי.
איור 1 מראה לחדר הספירה Petroff-Hausser משמש גם מיקרו לשכת הספירה המשמש בספירה ישירה של תאים. איור 2A מראה צלחת תרבות מועשר טיפוסי זה כבר מותר מספיק זמן marcescens ס לגדול מושבות (16 שעות בטמפרטורת החדר). איור 2B מציגה עקומות גדילה עבור כל זנים בשימוש. בזמן המדידות המדויקות ספקטרופוטומטרים משתנות, הקשר בין ספירת600 ו המושבה OD צריך להיות ליניארי בטווח אמין ספקטרופוטומטרים; מדדנו ~ OD600 = 0.1 כמו /mL8~ 10. Petroff-Hausser ישיר סופרת וכן המושבה ספירות צריכים להסכים בתוך 10% עד התאים. יתחילו למות כפי שנראה מחזור בעקומת הגדילה.
איור 3 מראה את העיצוב של התאים דוגמה מותאמים אישית. Microfluidic מותאם אישית צ'יימברס שימשו את הניסוי הזה כדי לאפשר את זרימה רצופה של הדגימה דרך שדה הראייה של המיקרוסקופ הולוגרפי. Microfluidic סטנדרט טכניקות וחומרים שימשו בבנייה של דגימת התאים. בלאנט משופעת פלדת אל-חלד מחטים עם אביזרי זכוכית-Lok זכר הוכנסו לתוך המכשיר microfluidic לספק כניסת ולשקע יציאות לתא הדגימה. הגיאומטריה ערוץ microfluidic הוקמה על ידי הדפס אבן רכה של polydimethylsiloxane (PDMS) באמצעות תבנית בסיס אלומיניום במכונה, אשר היה דחוס, באמצעות מסגרות אלומיניום, בין שני חלונות זכוכית איכות אופטית. PDMS יוצר זרימה ערוץ גיאומטריות, כמו גם מאבטח מזרקים, המספקים תחבורה נוזל מ תעלות זרימה. התאים האלה לדוגמה להשתמש PDMS אך ורק כדי ליצור זרימה ערוץ הגיאומטריה ומכילים ולכן אין PDMS בנתיב האופטי של המכשיר. שימו לב כי בשל אופיו אופטי של מיקרוסקופ הולוגרפית מהציר, מיקרו שני-ערוצים ששימשו כהשראה מקבילים אחד לשני בבית הבליעה הדגימה. זה נועד להתאים אופטי אורכים בין שתי הזרועות של interferometer (המכונה הזרועות 'דגימה' ו- 'הפניה'). הערוץ הפניה צריך להכיל רק מדיה סטרילי, היתלות זרימה.
איור 4 מראה סכימטי ותמונות של מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפית ביישומה מעבדה. זה מופעל על ידי התוכנה המצורפת עם המצלמה. איור 5 מציג נתונים סוג התושבות שלהם מופיעים נציג ספירת חיידקים התכתבותם במספרים החזוי של תאים לכל שדה ראייה. מ הולוגרמות raw, ללא שיקום, זה אפשרי לראות ולספור את התאים על ידי חיסור חציון מעקב ידני. זו מקטינה באופן משמעותי את הנטל חישובית בהשוואה שיחזור כל z-מטוסים, כמו הולוגרמות raw להראות את התאים בכל העומק של החדר. המראה של תרבויות ריכוזים שונים, את התכתובת שלהם עם צלחת ספירה וספירה Petroff-האוזר מצוינים. סה כ תא ספירת נקבעים לפי ממוצע של מספר התאים בכל כרך מדגם שנראה את המספר הכולל של אמצעי האחסון עם תמונה. המגבלה של זיהוי נקבעת לפי המספר הכולל של אמצעי אחסון מדגם עם תמונה. בניסוי זה, נוכל לקבוע מגבלה מירבית על ערך זה, עם סכום מרבי של 10 מ של דגימה עם תמונה בתוספות µL 0.25 (סך של 40,000 תמונות לכל דגימה). ההקלטות מופסקים לפני האחסון הכולל המרבית מושגת אם התאים הם נצפו בבירור בכל מסגרת על סדרה של 20 מסגרות. במאמר הקודם, דיווחנו נוסחה להערכת מספר אמצעי האחסון מדגם הדרושים כדי לזהות חיידקים ברמה 50% ביטחון בריכוזים הנע בין 1-105 תאים/mL (טבלה 1). בהתבסס על הערכה זו, בחינה של כל המסגרות 40,000 צריך לאפשר גילוי של תאים ב- 1/mL, על פי חישוב זה היא שהמפתחות אינטנסיבית.
איור 6 מראה את השימוש שחזור תוכנה (פיג'י)39. הולוגרמה אחת נפתח ומנוהל התוכנה "OD-מספריים מספריים הפצת עקיפה". הפרמטרים הדמיה ניתנות בתיבת הדו-שיח; משרעת בעוצמה, שלב עשוי הכל מחדש. מטוס z יחיד עשוי להיבחר, או אצווה שחזורים עשוי לשמש כדי לשחזר את כל עומק.
איור 7 מראה שחזורים של משרעת ותמונות שלב בעומקים שונים במדגם שנבחר. המסכה פורייה המשמש ליצירת המרתף מוצג, יחד עם תמונת בעוצמה המופחת-חציון, תמונת שלב, הקרנה מרבי דרך המחסנית שלב, הקרנה נפח הערימה בעוצמה.
איור 1: ישיר ספירת תאים חיידקיים. ריכוז חיידקי ב תאים למ"ל מחושבת על ידי ספירת המספר הכולל של חיידקים ספירת קאמרית, קנה המידה הזה חשבונאות מספר על העובדה כי תא Petroff-האוזר מכיל רק 20 nL מדגם. (א) Petroff-Hausser סופר קאמרית. (B) תמונה של ספירת קאמרית מיקרו תחת 10 X שלב ניגוד, מציג תיבות בגדלים שונים שימושי עבור ספירת תאים בגדלים שונים. (ג) המראה של marcescens ס בתוך התיבות הספירה הקטן קאמרית; 40 X שלב חדות. (ד) השיטה עבור ספירה זה אינו כולל תאים נופלים על הקצוות העליונים וימינה (N), אבל לא את התחתון השמאלי ולקצה (Y). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ספירת תאים על ידי צפיפות אופטית וצמיחה של המושבה. (א) ס marcescens מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. -דילול הנכון, צריך תרבות צלחותיש 20-200 מושבות עבור ספירה מדויקת ונתונים סטטיסטיים. הצלחת המוצגת היא קצת יותר מדי צפוף לספירת אמין. (B) צמיחה ' עקומות ' עבור זנים 3 בשימוש. צפיפות אופטית של 0.1 מקביל ~ 108 תאים למ"ל, אך הערכים המדויק משתנה בהתאם לכלי. סעיפים Petroff-האוזר ישירה מסכים עם ספירות צלחת כדי בתוך 10% בטווח גדילה ליניארית. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של 5 דוגמאות עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: לטעום עיצוב תא. (א) Microfluidic סכימטי (הדגימה והפניה microchannels המסומנות). (B) מדגם שהרכבתם קאמרית. (ג) התפוצץ CAD להציג מציג את היסודות המרכיבים את החדר מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מפרטים טכניים, תמונות של מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי. (א) מפרטים טכניים מציג ארבעה מרכיבים עיקריים: המקור, המדגם (נתיב הדגימה תוצמד ואסתטיקה, נתיב ההפניה הנקרא הפניה למעורר), המיקרוסקופ, החיישן. (B) מודל מוצק של החומרה. מכלול סיבים-fed המקור נמצאת בתחתית, המצלמה הדמיה נמצאת בחלק העליון. המערכת האופטית של מיקרוסקופ – המורכב של שתי עדשות אספריים ו העדשה ממסר – כלולים בתוך הצינור בעדשה ארוכה 300 מ"מ. הבמה שלושה צירים בין המקור אופטיקה מיקרוסקופ מספק טיפול ידני קל של הדגימה במחקר. (ג) תצלום של המכשיר במעבדה. סרגל קנה מידה בחלק התחתון של התמונה מייצגת 1 אינץ '. התרשימים נלקחים מחדש וואלאס. et al. 34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: עקומות גדילה ונתונים סוג התושבות שלהם מופיעים נציג. (א) Predicted תאים לכל שדה ראייה בהתבסס על נפח דגימה של 365 מיקרומטר מיקרומטר x 365 x 1 מ מ. הטווח האופטימלי עבור סוג התושבות שלהם מופיעים ספירה מוצג במלבן, דוגמאות אמיתיות מסומנות כ- (B) ו- (ג). (B) סוג התושבות שלהם מופיעים הולוגרמה Shewanella תרבות בבית 8 x 105 תאים למ"ל נמדד Petroff-האוזר, 7.7 x 105 תאים למ"ל כפי שהיא נמדדת הצלחת לספור; תמונה זו מציגה תאים 110, לתכשירי אל תוכו. (ג) סוג התושבות שלהם מופיעים הולוגרמה של תרבות Shewanella -2.0 ±0.1 x 105 תאים למ"ל נמדדת Petroff-האוזר, 2.0 ±0.3 x 105 תאים למ"ל כפי שהיא נמדדת הצלחת לספור; תמונה זו מציגה תאים 27. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 35. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: ביצוע שחזורים. (א) פתח הולוגרמה בפיג'י. לרוץ הפצת מספריים (B), הזן את גודל גל ותמונה. לבחור מרחק z קרוב ל 0 כדי להתחיל. (ג) צייר מסכה פורייה כאשר תתבקש לבחור את אמת או תמונה וירטואלי. (ד) אמבט עיבוד מאפשר שחזורים בכל נפח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: המראה של שחזורים. תמונות של תרבות בסרישיה ~ 106 תאים/מ ל.... הולוגרמה Raw (A). טרנספורם פורייה (B). האזור בתוך המעגל נמצא באזור כדי לשמש; השאר מסיכה. (ג) שחזור משרעת ב- z-מטוס בודד. (ד) שלב השיקום ב- z-מטוס בודד; סרגל קנה מידה מציג את המופע. ההתחלתי במעלות. (E) מקסימום הטלה בעוצמה דרך כל z-המטוסים במחסנית שלב. נפח (F) להציג של המחסנית מלאה משרעת (365 x 365 x 800 מיקרומטר). סרגל קנה מידה = מיקרומטר 35. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ריכוז [תאים לכל מ ל] | מסגרות הדרושים |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
טבלה 1: מספר מינימום של אמצעי אחסון מדגם נדרש לזהות חיידקים על ידי סוג התושבות שלהם מופיעים (זיהוי ביטחון של 50%).
| המאפיין | ערך | יחידה |
| הפעלה אורך גל | 405 | nm |
| מפתח נומרי אובייקטיבית | 0.3 | - |
| מערכת הגדלה | 20 | - |
| רזולוציה לרוחב | 0.7 | Μm |
| אמצעי הדמיה מדגם | 360 x 360 x 800 | Μm x μm x μm |
| אורך כלי נגינה | 400 | מ מ |
בטבלה 2: מפרטי אופטי וביצועים של מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שחזור המספרי של הולוגרמות: את שיקומה המספרי של הולוגרמות, משמשת השיטה ספקטרום זוויתי (ASM). פעולה זו כרוכה קונבולוציה של ההולוגרמה עם פונקציית גרין עבור סוג התושבות שלהם מופיעים. ניתן לחשב את חזית גל מורכבים של התמונה-מטוס מוקד מסוים על ידי העסקת את משפט קונבולוציה פורייה כדלקמן:
(1)
איפה 
הוא האופרטור טרנספורם פורייה, 
היא מטריצת הולוגרמה, ו 
היא הפונקציה של הירוק של סוג התושבות שלהם מופיעים, אשר מוגדר כ:
(2)
איפה 
הוא המרחק, לאורך ציר אופטי, מישור המיקוד הרצויה מחדש, 
הוא אורך הגל תאורה, 
, 
הן מספר הפיקסלים ב- x וכיוונים y, בהתאמה, ו 
, 
הם גודל פיקסל (על המטוס גלאי) ב- x ו- y כיוונים, בהתאמה40.
מלפנים גל מורכבים, עוצמת יכול להיות מחושב על ידי גודל בריבוע של 
, השלב וניתן להשיגו על ידי הארק-טנגנס של המנה בין החלקים דמיוניים ואמיתיים של .
שינויים ופתרון בעיות
בניסויים המערבים את הספירה של ריכוז חיידקי דליל הם רגישים מאוד זיהום, תוצאות חיוביות שגויות של התשלילים שווא. מסיבה זו, צמיחה, ספירה של חיידקים, כמו גם הכנת דוגמאות שתדללו מאוד עבור סוג התושבות שלהם מופיעים הם שלבים קריטיים בניסוי זה. זהירות יש לנקוט כדי למנוע זיהום בניסוי זה על ידי בקפידה השליטה הסביבה בהם החיידק גדל, לספור. טכניקות עיקור תקין, כולל autoclaving, לסייע במניעת נגד זיהום, כמו גם תוצאות חיוביות שגויות. כדי למנוע עוד יותר נגד תוצאות חיוביות שגויות, חיידקים נבחרו לניסוי הזה כי התערוכה מאפיינים ייחודיים יחסית (למשל, ס' marcescens יש צבע אדום מאוד ברורים כאשר תרבותי). כדי למנוע נגד התשלילים שווא, החיידק שבחרת עבור ניסוי זה נבחרו כך שיוכלו לגדול על תרבות מועשר צלחות, כמו גם צורות אופייניות ו/או תבניות תנועתיות להיות מזוהה באמצעות סוג התושבות שלהם מופיעים. חשוב לבדוק מעת לעת זיהום או גידול תאים בלתי צפויות על ידי ציפוי הדגימות וכימות את החיידקים על ידי ספירת צלחת.
ב מבצע את הניסוי, צפוי גודל הנתונים של בערך 2.4 ג'יגה-בתים לכל 1 מ של דגימה. מספר זה, כמובן, תלויה המצלמה ואת קובץ התבנית. גודל נתוני דיווח היא על ידי שימוש גלאי ה-Mpx 4 תבנית קובץ TIFF סטנדרטי. לאחר עיבוד הנתונים דורש בערך 6 דקות של חישובים לכל 1 מ של דגימה. הפעם עיבוד נצפתה תוך שימוש מעבד 8 ליבות של אינטל i7-3.5 GHz ו- 32 ג'יגה-בתים של זיכרון RAM. יכול להיות parallelized חישובים אלה ל- GPU מאוד מופחתת עיבוד טיימס, אך לא נעשה כאן.
מגבלות של הטכניקה
בעוד באמצעות סוג התושבות שלהם מופיעים כדי לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של חיידקים הוא אפשרי, שיטה זו היא לא ספציפית. מורפולוגיה לבד אינה חד משמעית אמצעי זיהוי זני חיידקים. יישומים אבחון יציג אתגרים ספציפיים בשל נוכחותם של תאים שאינם-יעד, אגרגטים. היתרון של המכשיר-קרן אור כפולה המובאת כאן זאת, כי הוא מסוגל התמונה חיידקים בדגימות יחסית עכורים. היכולת לזהות חיידקים דגימות קליניות, ואת מידת עיבוד הדגימות קדם הדרוש, עדיין נקבע.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
שלב 2: קבלת דילולים מדויק חיוני ספירה כמותית. כל דילולים גרם צריכים להיות מגובים על ידי ספירת צלחת. שלב 3: הבחירה של קצב הזרימה ואת קצב הפריימים המתאים חייבת להיעשות בקפידה כדי להבטיח כי כל התאים נראים. ההתאמה של הפרמטרים משאבת אמור להיות מכוון היטב לפני ביצוע מגבלה של זיהוי הניסוי. שלב 4: ריכוז חיידקי נמוכה מאוד, זה חיוני ללכוד מספיק נתונים כדי להיות בטוחים של זיהוי. יתכן צורך לשחזר נתונים מסוימים כדי להיות בטוח כי תאים, ופסולת לא, להיות נראים. במקרים קיצוניים, יותר מ 10 מ"ל של פתרון עשוי להידרש. Non-תאי זנים נוטים יותר להיות דו-משמעי מאשר זנים תאי. שלב 5: אם יש עמימות בכל הנתונים, שחזור יכול לעזור להמחיש כי הולוגרמות מייצגים תאים ופסולת לא. שחזורים ברזולוציה גבוהה יראה תא קלאסי מורפולוגיות, תנועתיות רואים בבירור במסלולים של זנים תאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את גורדון ואת בטי מור קרן מענקים 4037 4038 אל המכון הטכנולוגי של קליפורניה למימון העבודה הזאת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
