Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .
Abstract
وقد المثقوبة الدم البشري، بلهارسيه spp.، لها دورة حياة معقدة تشمل المراحل الإنمائية اللاجنسي والجنسي داخل القواقع الوسيطة والثدييات مضيف نهائي، على التوالي. القدرة على عزل والمحافظة عليها في مراحل مختلفة من دورة الحياة تحت ظروف الثقافة في المختبر سهلت إلى حد كبير تحقيقات الآليات الخلوية والكيمياء الحيوية والجزيئية التي تنظم النمو الطفيلي، والتنمية والمضيف التفاعلات. ويتطلب انتقال البلهارسيا اللاجنسي والتنمية متعددة المراحل اليرقات داخل البلد المضيف الحلزون؛ من ميراسيديوم المعدية، من خلال سبوروسيستس الأولية والثانوية، إلى المرحلة النهائية السباحين الذي يتم المعدية للبشر. في هذه الورقة نقدم بروتوكول خطوة بخطوة الفقس الجماعي وعزل بلهارسيه المنسونيه ميراسيديا من البيض التي تم الحصول عليها من كبد الفئران المصابة، وإدخالها لاحقاً إلى الثقافة في المختبر . ومن المتوقع أن البروتوكول مفصلاً ستشجع الباحثين جديدة للانخراط في وتوسيع هذا المجال الهام من بحوث البلهارسيا.
Introduction
الإنسان الدم المثقوبة بلهارسيه spp.، وهي العوامل المسببة لمرض البلهارسيا، أمراض استوائية مهملة التي يعاني منها على 230 مليون شخص في العالم ما يقدر1. الأنواع الأكثر انتشارا، المنسونيه بلهارسيه، تتوزع جغرافيا في أمريكا الجنوبية والأرخبيل منطقة البحر الكاريبي، والشرق الأوسط و أفريقيا الصحراء2. دورة حياة س. المنسونيه، والأخرى المنشقات، معقد، والتي تنطوي على مضيف نهائي الثدييات والقواقع المياه العذبة من جنس كان بمثابة تلزم الوسيطة المضيفين.
دودة البالغين الذكور والإناث المنسونيه س. أزواج يعيشون في عروق المساريقي العلوي الخلفي تتكاثر الثدييات المضيفة، أسفر عن إطلاق سراح امبريوناتيد البيض (البويضات) التي أصبحت استقرت في الأوردة الصغيرة في الغشاء المخاطي المعوي. البيض ثم فواصل من خلال جدران الأوعية، تهاجر من خلال الأنسجة المخاطية، وأدخل في نهاية المطاف التجويف المعوي حيث أنها هي باطلة مع البراز. عند إدخال البويضات هاتش المياه العذبة وتخترق اليرقات (ميراسيديا)، يجب، في وقت قصير، وجدوا حلزون كان مناسبة لتصيب من أجل مواصلة دورة الحياة. تتضمن هذه العملية الإصابة مرفق ميراسيديال إلى سطح الجسم الخارجي في الحلزون متبوعاً باختراق النشطة ودخول اليرقة إلى المضيف. فور دخول، يبدأ ميراسيديوم إلقاء لوحات البشرة عضو الخارجي حيث أنه يشكل سينسيتيوم التي ستصبح على السطح الخارجي الجديد (لحافة) للمرحلة القادمة اليرقات سبوروسيست الأولية أو الأم. من خلال اللاجنسي، تنتج كل سبوروسيست الأولية والنشرات جيل ثان من سبوروسيستس، ووصف الثانوية أو ابنه سبوروسيستس، التي تخلق بدورها، والإفراج عن إعداد كبيرة من المرحلة النهائية إينترامولوسكان، المذنبات3 . الهروب من البلد المضيف الحلزون، سيركاريا تخترق عند قادر على إرفاق ومباشرة اختراق الجلد من مضيف الثدييات مناسبة البشرية أو غيرها. عند دخول المضيفة الجديدة، سيركاريا تحويل إلى مرحلة شيستوسومولا الطفيلية وغزو نظام الأوعية الدموية. ، بدوره، تهاجر إلى الرئة ومن ثم إلى الوريد الكبدي حيث تنضج الديدان الكبار وشكل أزواج من الذكور والإناث والسفر إلى الأوردة المساريقي العلوي لإكمال دورة حياتها.
إينترامولوسكان بنجاح أو تطوير "المرحلة الحلزون" المنشقات اليرقات ضروري لاستمرار دورة للبشرية مضيف إلى مضيف الإرسال. أهمية حاسمة هو دخول ميراسيديوم تخترق إلى المضيف الحلزون وتحولها المبكر للمرحلة الابتدائية سبوروسيست الفترة التالية. اعتماداً على توافق الفسيولوجية والمناعية بين المضيف والطفيلي، فمن خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات أن النجاح الأولى أو عدم إثبات الإصابات هو العزم4،5،6 . التطور اللاحق للابتدائي سبوروسيستس قادرة على إنتاج بلا تزاوج سبوروسيستس الثانوية، ثم تولد سيركاريا الإنسان المعدية، كذلك تتطلب بيئة متساهلة مضيف فسيولوجية التي توفر لكل من النمو الطفيلي و يحتاج الإنجابية.
وحتى الآن، يعرف الكثير عن الأساسية الفسيولوجية، والكيمياء الحيوية والجزيئية عمليات مراقبة التفاعلات المنشقات-الحلزون، لا سيما الجزيئات ومسارات تشارك في تنظيم التنمية اليرقات والإنجاب، أو تحوير الاستجابات المناعية المضيف. سهولة الوصول إلى إعداد كبيرة من هذه المراحل اليرقات في ظروف في المختبر الثقافة التي تسمح بالتلاعب التجريبية سيسهل اكتشاف المسارات الإنمائية والآليات الأساسية لنمو الخلايا، التمايز والاستنساخ. المسارات الحرجة الطفيلي أو آليات، يتم تحديدها من خلال التجريب في المختبر ، ثم يمكن لعرقلة نمو اليرقات/الاستنساخ في المضيف الحلزون، أو لتحديد الحلزون المضيف المناعية الآليات المعنية بالاعتراف والقضاء على مراحل ميراسيديال أو سبوروسيست.
وفي هذه المادة وعرض الفيديو، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لطريقة لعزل عدد كبير من تخترق المنسونيه س. ميراسيديا لإدخال الثقافة في المختبر الذي ثم يمكن أن يتعرضوا للمتابعة التجريبية التلاعب (انظر الشكل 1 نظرة تخطيطي لسير عمل البروتوكول). على الرغم من أن إجراءات مماثلة قد وصفت سابقا7،،من89، شعرنا أن بروتوكول مفصلة ستكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام هذا النموذج لمعالجة ما زالت التساؤلات المتصلة ب التنمية اليرقات إينترامولوسكان وانتشار الهاتف الخلوي، والتفاعلات المناعية المنشقات-الحلزون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لعزل البيض من غيرها تريماتودا طبيا هامة مثل المثانة مسكن دموية سأو المثقوبة الكبد أو الرئة المثقوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
موافقة جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ويسكونسن-ماديسون تحت البروتوكول لا. V005717. البروتوكول التالي ينطوي على العمل في منشأة للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) لمسببات الأمراض البشرية، على الرغم من أن أيا من مراحل المنشقات المبينة في هذا البروتوكول معدية للبشر أو لغيرها من الثدييات. اتبع سياسات مؤسسية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية خطر المجموعة 2 (RG2).
ملاحظة: نستخدم الإناث الفئران السويسرية وبستر (6-أسبوع من العمر) بسبب تعرضها أعلى إلى10من العدوى، وبالتالي تحقق أكبر بيضة أعباء. وتصف تاكر et al. الماوس والقواقع العدوى البروتوكولات المستخدمة في هذا النظام النموذجي11. يسرد الجدول للمواد جميع معدات محددة ومواد، الكواشف والمصادر الحيوانية اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول التجريبي.
1-تجهيز الكبد المصابة
- Euthanize الفئران، 6-7 أسابيع بعد الإصابة، بالاختناق2 CO (معدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة الواحدة). مراقبة الفئران لوقف التنفس وضربات القلب.
ملاحظة: عادة ما يصل إلى 20 من الفئران قد تتم معالجة في وقت معين. - بعد نقل euthanized الفئران للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، ضع الماوس على ظهورهم والرش على الأسطح البطني مع الإيثانول 70%. واسمحوا نقع لمدة 1 دقيقة.
- قرصه وسحب الجلد أسفل البطن وقطع عبر القاعدة الجلد انتزعت الأقرب إلى البطن مع مقص جراحي معقم. سحب قطع الجلد الأسفل (أي نحو الرأس) للكشف عن الكبد. ملاحظة أن الكبد ينبغي توسيعه ومنقط بسبب استجابة حبيبية المستحثة بالبيض (الشكل 2A).
- إزالة الكبد ووضعه في كوب يحتوي على 200 مل من معقم 1.2% كلوريد الصوديوم الحل الذي يتضمن القلم/بكتيريا.
- كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 مع الفئران المتبقية.
ملاحظة: عادة ما يتم معالجة الفئران العشرين في محصول واحد. - وضع الكبد في طبق بتري معقم وإزالة الأنسجة الضامة الدهون/غير الكبد مع الملقط العقيمة.
- نقل كبد قلص/تنظيف زجاجة معقمة للطرد مركزي 250 مل تحتوي على ~ 200 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% العقيمة مع القلم/بكتيريا.
- قوة يهز زجاجة تحتوي على الكبد، واستخدام ماصة المتاح عقيمة، إزالة السطح الزائد رغوة/تعويم الحطام. ببطء من أجل إيقاف المحلول الملحي المتبقي في حاوية أو بالوعة تحتوي على 1% التبييض (مطهر).
- إضافة ~ 200 مل المحلول الملحي الطازجة للكبد، وكرر الخطوة 1.8 ثلاث مرات أكثر.
2-الكبد العزلة الاستخراج وميراسيديال
- وضع الكبد في كأس خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ عقيمة صغيرة وإضافة ~ 2 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% (الشكل 2).
- تغطية الكأس بإحباط وطبق بيتري لمنع الانسكابات، ومزج لمدة 1 دقيقة بالتناوب منخفضة وعالية السرعة (20 s منخفضة السرعة/10 ق عالية السرعة؛ وتكرار) (الشكل 2).
- توزيع بالتساوي بتعليق الكبد المخلوطة في زجاجات معقمة 250 مل أجهزة الطرد المركزي (لاستخدام كبد 20 4 زجاجات).
- إضافة المحلول الملحي المعقم بالمضادات الحيوية إلى حجم إجمالي ~ 200 مل/الزجاجة. وزن/التوازن الزجاجات قبل الطرد المركزي.
- كبد المخلوطة في ز 290 x لمدة 15 دقيقة في 4 س"جيم بلطف" صب قبالة سوبيرناتانتس في حاوية مع التبييض قبل التخلص من أجهزة الطرد المركزي.
- كرر الخطوات من 2.4-2.5 مرة. يجب التأكد من دقة ريسوسبيند الكبد الرسوبيات قبل الطرد المركزي.
- بعد التخلص من المياه المالحة الماضي يغسل (2.6 خطوة)، بإضافة 200 مل مياه الأحواض العقيمة مع القلم/بكتيريا نسيج الكبد الأعلاف، اهتز ريسوسبيند الرواسب، ونقل التعليق لتعقيم قارورة حجمي 1-L التي قد تم تغطيتها بشكل كامل مع الألومنيوم إحباط، باستثناء الجزء العلوي 3 سم الرقبة (الشكل 2D).
ملاحظة: استخدام زجاجتين (= كبد 10) كل قارورة 1-L. مياه الأحواض يحاكي بيئة المياه العذبة الطبيعية اللازمة لحفز ميراسيديال الفقس من البيض. - استخدام مياه الأحواض العقيمة، تملأ قارورة إلى حوالي 3 سم فوق إحباط تغطي على الرقبة. ثم، دون تأخير (كما ميراسيديا تبدأ قريبا التظليل) وإزالة الرغاوي المتبقية وأنسجة الكبد تطفو على السطح قبل بيبيتينج بسرعة حتى مل ~ 12 من أحواض المياه التي تحتوي على الحطام وتجاهل ذلك إلى منفصل تجاهل الأنبوبة. استبدال المياه العذبة الأحواض العقيمة.
- كرر التنظيف الخطوة 2.8، ثلاث مرات، والتحقق من وجود ميراسيديا في الأنبوب المرتجع. الكف عن تكرار التنظيف الخطوة إذا ميراسيديا تظهر في الحل الغسيل.
- بعد الغسيل الأخير، إضافة ببطء ~ 12 مل مياه الدافئة البركة العقيمة (قبل ارتفعت درجة حرارة 30 سج) لإنشاء تدرج درجة الحرارة مع الماء الدافئ نظيفة ومعقمة في الأعلى.
ملاحظة: هذا هو إنجاز أفضل بتصريف المياه على طول الجانب من الرقبة قارورة لتجنب الاختلاط ببطء. - ضع غطاء صحن بتري صغير على فتح قارورة وتسليط ضوء الساطع عبر الجزء العلوي من قارورة أعلاه غلاف إحباط لإلقاء الضوء على السطح العلوي للمياه.
ملاحظة: عادة، خلال 5-10 دقيقة، السباحة ميراسيديا، تنجذب إلى الضوء، وسوف تركز بإعداد كبيرة داخل سم 2-3 أول من الأحواض المائية (الشكل 3A).
3. زراعة وحصاد ميراسيديال
- عندما جمعوا ميراسيديا في السطح بعد 10 دقائق، باستخدام بيبيت نقل عقيمة، إزالة ~ 8 مل من الأحواض المائية ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على ميراسيديا على الجليد.
- إضافة مل 8 مرة أخرى من المياه الدافئة البركة العقيمة على طول داخل دورق حجمي وانتظر 10 دقائق أخرى.
- استخدام أنابيب جديدة كل مرة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 ثلاث مرات أكثر. بعد جمعال 4، إبقاء الأنبوب النهائي على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح ميراسيديا تسوية. وتضم هذه المجموعة من أنابيب الحصاد الأول.
- أنابيب الطرد المركزي الذي يحتوي على ميراسيديا في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سج في مبردة قبل تبريد أجهزة الطرد مركزي.
- على الفور إزالة معظم المادة طافية (~ 7 مل) مع الحرص على عدم تعكير بيليه الطفيلي (الشكل 3B).
- تجمع جميع ميراسيديا من هذا المحصول الأول في أحد أنبوب، ثم شطف جميع الأنابيب الأصلي مع ~ 1 مل ماء البركة العقيمة، وإضافة إلى الأنبوب "المجمعة".
- السماح للطفيليات ليستقر على الجليد ل ~ 5 دقيقة، ومرة أخرى الطرد المركزي الطفيليات في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سجيم
- بعناية إزالة المادة طافية وإضافة Chernin العقيمة في 6-8 مل متوازنة الحل الملح (مجلس دول بحر البلطيق +؛ انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على القلم/بكتيريا.
- بلطف بتعليق ميراسيديا وقاسمه لهم في لوحة ثقافة 24-جيدا (1 مل كل بئر)، تليها الشطف الأنبوب في 6-8 مل مجلس دول بحر البلطيق + وإضافة 1 مل شطف لكل بئر. احتضان الطفيليات في 26 سج تحت ظروف نورموكسيك. تركيزات ميراسيديا معزولة سوف تختلف، ولكن سيتم عادة المتوسط ~ 7000 مليلتر.
- إذا كانت لا تزال هي تركيز الطفيليات في مصدر الضوء، كرر الخطوات 3.1 إلى 3.9 لمواصلة الحصاد أواخر الفقس ميراسيديا لكن زيادة الفاصل الزمني بين المجموعات إلى 15-20 دقيقة.
ملاحظة: تمثل هذه المجموعة الجديدة من أنابيب الحصاد الثاني. ومع ذلك، نظراً لأن الأرقام ميراسيديال عادة منخفضة، اليرقات من جميع الأنابيب عادة مجمعة في ثقافة واحدة تتضمن أيضا 2 مل مجلس دول بحر البلطيق +. - في 24 ساعة بعد الحصاد، وزراعة، ريسوسبيند بلطف سبوروسيستس في آبارهم التي بيبيتينج.
- انتظر بضع دقيقة للسماح للطفيليات لتسوية إلى الجزء السفلي من الآبار. بمجرد أنهم استقروا بعناية إزالة المادة طافية (مل ~1.5)، التي سوف تحتوي على معظم لوحات البشرة عضو يلقي بها ميراسيديا خلال التحول اليرقات. أن تجاهل هذا "التحول" طافية أو إدماج دراسات المتابعة للمنتجات الافرازية اليرقات.
- إضافة 1.5 مل من جديد مجلس دول بحر البلطيق + لكل بئر وماصة ريسوسبيند سبوروسيستس برفق. كرر الخطوة 3، 12 إذا كان المطلوب هو زيادة الغسيل أو تغييرها إلى وسيلة مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الغالبية العظمى من ميراسيديا عادة سوف قد جمعت في الأولين "الحصاد". حضانة ميراسيديا معزولة في مجلس دول بحر البلطيق + مشغلات عملية التحول ميراسيديوم إلى سبوروسيست (الشكل 4 أ-ج). خلال الساعة الأولى الآبار التالية نقل إلى الثقافة التي تحتوي على + مجلس دول بحر البلطيق، أغلبية ميراسيديا وقف السباحة (الشكل 4 أ). في 6 ح في الثقافة، ميراسيديا حاليا بنشاط ذرف لوحات البشرة عضو (الشكل 4 باء). تزامنت مع هذه العملية ذرف، اليرقات تشكل بهم تغطي تيجومينتال المخلوي الخارجي كما أنها تحول إلى سبوروسيستس الأولية. ستكون قد أنجزت معظم الطفيليات التحول اليرقات، أصبحت سبوروسيستس تماما-وشكلت، بزراعة ح 24-48 بعد في مجلس دول بحر البلطيق + (الشكل 4). بعد 4 أيام ثقافة في مجلس دول بحر البلطيق + وحدها، يمكن أن يتوقع بقاء سبوروسيست إلى إنقاص ~ 80%. ومع ذلك، سبوروسيستس مثقف لمدة يوم واحد في مجلس دول بحر البلطيق + وثم نقل إلى إكمال بجي (كبجي) متوسط 3 أيام عادة ما تؤدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة واليرقات بمظهر أكثر قوة (الشكل 4). الجدوى سبوروسيست عموما لا تزال مستقرة بين 4 و 7 أيام في كبجي مع استمرار الزيادة في نمو اليرقات خلال هذا الوقت في الثقافة مقارنة بمجلس دول بحر البلطيق + وحدها.
الشكل 1 . نظرة عامة على سير عمل البروتوكول. ملخص تخطيطي للخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها عزل وزراعة ميراسيديا المستمدة من الفئران المصابة بحظ الدم البشري، المنسونيه س.. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تجهيز الكبد المصابة. (أ) الماوس الكبد المصابة بشدة مع البيض المنسونيه س. . ملاحظة توسيع حجم ولون غير طبيعي ووجود حبيبية في الكبد المصابة (يمين) بالمقارنة مع كبد مصابة عادي (على اليسار). يغسل (ب) الماوس كبد بعد نقل إلى كأس خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ العقيمة. ثم كانت مخلوطة كبد لمدة دقيقة واحدة استخدام رقائق العقيمة وطبق بيتري لتغطية الكأس، وبالتالي تجنب انسكاب (ج). بعد المزج، هوموجيناتي الكبد، التي تحتوي على البيض وغسلها عدة مرات في المحلول الملحي وحراكه في مياه الأحواض العقيمة، قبل نقله إلى قارورة حجمية 1-L مغطاة برقائق الألومنيوم (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : جمع المنسونيه س. ميراسيديا. نشاط السباحة ميراسيديا تتركز بجاذبية للضوء في الجزء العلوي من دورق حجمي (A). فواصل زمنية 10-دقيقة، تحصد ماصة الطفيليات ووضعها في 4 درجات مئوية شل اليرقات. ميراسيديا ثم غسلها في مجلس دول بحر البلطيق + بالطرد المركزي والتي جمعت في أنبوب واحد (ب) قبل التوزيع للآبار للوحة الثقافة. + مجلس دول بحر البلطيق؛ متوازنة في Chernin الحل الملح (جدول المواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحويل ميراسيديال إلى سبوروسيستس الأساسية وصيانتها في المختبر . ميراسيديا س. المنسونيه وسبوروسيستس وضعها في الثقافة في المختبر لأوقات مختلفة ما بعد الحصاد. ميراسيديا المقطوع حديثا ضمن ح 1 من الثقافة في مجلس دول بحر البلطيق + (A). بعد 6 ح للثقافة، بدأت ميراسيديا لإلقاء لوحات البشرة عضو (الأسهم) كما أنها تحول إلى سبوروسيستس الابتدائي (ب). بعد 24 ساعة في مجلس دول بحر البلطيق + حولت معظم ميراسيديا تماما للابتدائي سبوروسيستس (ج). سبوروسيستس تحول في مجلس دول بحر البلطيق + ح 24، ثم نقل وصيانتها في المتوسط كبجي لمدة 3 أيام (د). سبوروسيستس عموما يبدو أكثر قوة وأعلى معدلات البقاء على قيد الحياة في زراعة ما بعد 4 أيام حضور كبجي، مقارنة بمجلس دول بحر البلطيق + وحدها. + مجلس دول بحر البلطيق، ل Chernin متوازنة الحل الملح؛ كبجي المتوسطة، كاملة صناعي الجنينية الخلية المتوسطة (انظر الجدول للمواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميراسيديا س. المنسونيه، معزولة والتلاعب بها كما هو موضح هنا، يمكن أن تصيب فقط المضيف القواقع الوسيطة، ولذلك لا تمثل الإخطار البيولوجية بشرية خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات. بيد لتجنب التعرض العرضي/العدوى من القواقع، ينبغي الحرص أداء العزلة ميراسيديال في موقع آخر من المجالات التي قد يكون فيها عرضه كان الحلزون الأنواع الحالية أو صيانتها. غرفة منفصلة، مسجلة كالفضاء BSL2، ينصح بشدة. وباﻹضافة إلى ذلك، غسل جميع الحلول المستخدمة في تجهيز الكبد وعزل اليرقات ينبغي أن تعامل بمطهر (مثلاً، 1% التبييض) قبل التخلص منها.
تجدر الإشارة إلى أن الاستئصال الجراحي للكبد من إصابة الفئران وتتم معالجتها اللاحقة قبل المزج/التجانس في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية (BSC) تحت ظروف معقمة. ومع ذلك، لأسباب عملية (سهولة التلاعب بالعينات المجمعة) تتم جميع الإجراءات الأخرى على benchtop تطهيرها استخدام حاويات معقمة (مثلاً، كوب خلاط، قوارير، وزجاجات وأنابيب، ونقل بيبيتس، إلخ) والحلول العقيمة تحتوي على المضادات الحيوية (المالحة، بركة مياه، مجلس دول بحر البلطيق). تتم إضافة المضادات الحيوية لجميع الحلول أخرى كاجراء وقائي ضد التلوث الميكروبي إدخال. وبالإضافة إلى ذلك، أثناء عزلة ميراسيديال والحصاد الخطوات (المادتان 2 و 3 من البروتوكول)، يتم وضع غطاء صحن بتري صغير على قارورة فتح لتقليل التلوث خارج أثناء الأولى إزالة الحطام رغوة/الكبد ونقل لاحقاً إلى تتركز ميراسيديا من قارورة الطرد المركزي أنابيب.
بشكل عام، نحن حصاد ميراسيديا من كبد الفأر المصابين 20 في دفعة واحدة، الذي نقدر غلة اليرقات حوالي 5000 اليرقات في الكبد. ومع ذلك، غلة يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لشدة الإصابة الفردية الفئران أدى إلى تباين دفعة إلى دفعة في المبالغ المستردة ميراسيديال. العزلة يمكن القيام بها باستخدام كبد انطلاق أقل، على الرغم من أن الطريقة التي وصفناها تنطبق بصورة عامة للكبد 10-20. عندما تتم معالجة كبد 20، بعد استثارة النهائي من الكريات الكبد في مياه الأحواض العقيمة (القسم 2، الخطوة 2.7 من البروتوكول)، أن الإيقاف يجب أن توزع بالتساوي في قوارير 1000 مل اثنين (2 زجاجات في قارورة). إذا كان يتم استخدام كبد 10 أو أقل، يمكن توزيعها على زجاجات 2 homogenates الكبد الأصلي (بروتوكول القسم 2، الخطوة 2.3) وغسلها المعلقات ثم نقل قارورة حجمية واحدة لمزيد من المعالجة. واحد أو 2 كبد يمكن معالجتها أيضا، ولكن ينبغي تخفيض كميات (مجلدات) لاستخراج وغسل والفقس الحلول نسبيا، مع النهائي غسلها الرواسب في بركة مياه يجري نقلها إلى قارورة 10 مل حجمي المغطاة بإحباط للتركيز ميراسيديا.
من أجل تعظيم غلة ميراسيديال مع الحد ني تلوث الحطام الكبد، من المهم أيضا أداء يغسل مياه الأحواض (بروتوكول القسم 2، خطوات 2.7-2.9) بسرعة وكفاءة قدر الإمكان. عندما يتعرض البيض للأحواض المائية، يحدث الفقس ميراسيديال قريبا بعد ذلك، على الرغم من أن تبدأ الساعة قبل ظهور اليرقات في مصدر الضوء في الرقبة قارورة يمكن أن تختلف من 5-20 دقيقة بعد الفقس. للحد من الخسارة للطفيليات أثناء تنظيف الأحواض المائية تغسل خطوات من الأهمية بمكان للتحقق بصريا من كل مياه الأحواض لأوائل ميراسيديا القادمين في طبقة المياه العليا للرقبة قارورة. وباﻹضافة إلى ذلك، حالما يتم نقل أنابيب جمع 15 مل ميراسيديا وتوضع على الجليد، سوف تتوقف عن السباحة النشاط وتسوية لأسفل الأنبوبة. ومع ذلك، بعد الطرد المركزي بيليه اليرقات (الباب 3، خطوات 3.4-3.5)، مرة أخرى سوف تبدأ ميراسيديا للسباحة وإذا سمح للمياه الحارة. ولذلك، من المهم لإزالة مياه الأحواض بسرعة، ولكن دون إزعاج بيليه أو بيبيتينج حتى السباحة الطفيليات.
وكما ذكر سابقا، غلة ميراسيديا معزولة يمكن أن تختلف اعتماداً على العدد أزواج دودة الكبار موجودة في الفئران الفردية (كثافة العدوى) والاتساق للبروتوكولات الإصابة الأولى. ميراسيديا فوتوتروبيك بقوة وسوف تركز الأغلبية (80-90 ٪) في مصدر الضوء على مدى فترة الحصاد الأول. 10-20 في المائة الباقية من ميراسيديا وسوف تواصل هاتش وأكثر تتراكم ببطء خلال الفترة الثانية للحصاد. آخر (> 95%) سوف حولت ميراسيديا أدخلت الثقافة والإبقاء على 26 سج في مجلس دول بحر البلطيق + المتوسطة إلى سبوروسيستس الأولية داخل ح 24-48 من زراعة. في هذا الوقت، اليرقات البقاء عادة > 90%. بعد 4 أيام في مجلس دول بحر البلطيق + قطرات البقاء وحدها إلى حد كبير (70-80 في المائة). بيد التبديل بين المتوسط الثقافة من مجلس دول بحر البلطيق + لإكمال بجي متوسطة 24 ساعة عقب النتائج الأولية مجلس دول بحر البلطيق زراعة في معدلات البقاء على قيد الحياة والنمو أكثر قوة. بشكل روتيني نحافظ على الثقافات سبوروسيست قصيرة الأجل تحت ظروف نورموكسيك. ومع ذلك، سبوروسيستس حساسة جداً لمستويات الأوكسجين، ولا سيما للأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن أن تلحق الضرر التأكسدي الضار7. وأفاد باين كج4 وآخرون إلى حد كبير تحسين صحة وسلامة سبوروسيستس في المختبر العام عندما تتم المحافظة على الثقافات تحت ظروف التاكسج. ويمكن الحصول على مستويات الأوكسجين المخفض بالغاز (مع النيتروجين) قوارير كلوسيابلي الفردية أو بالنيتروجين-الإثراء من الطور الغازي حاضنة4.
الأساليب المذكورة أعلاه، لعزل واستزراع المنشقات أكسينيك ميراسيديا وسبوروسيستس وقد وصفت سابقا. واعترف في وقت مبكر أن فوتوتروبيسم ميراسيديال يمكن استخدامها لجذب وتركيز اليرقات السباحة ويمكن أن ميراسيديا معزولة المعطل تداولها سريعاً في الملين الحلول المالحة (بين 120-160 موس/كغ)8. ولوحظ كذلك أن الصيانة في حلول المالحة أدت إلى تحول ميراسيديا للابتدائي سبوروسيستس، أول مرحلة اليرقات إينترامولوسكان9،12. وضعت وسائل الإعلام معقدة أيضا لدعم النمو في الأجل الطويل في المختبر والتنمية المنسونيه س. سبوروسيست المراحل9،13،،من1415، فضلا عن الخلايا المستمدة من المضيف الحلزون صناعي كان16. هذه الصياغات إدراج وسائط الإعلام التجارية المختلفة، وقد استكملت مع الأحماض الأمينية والأملاح والدهون، وتخفيض عوامل والسكريات. تركيبات كاملة من وسائل الإعلام شملت أيضا إبطال الحرارة بقرى الجنين أو مصل الحصان بتركيزات مختلفة. وقد وجدنا أن الحرارة المناسبة-(مرحبا) المنظمة كانت حاسمة لبقاء سبوروسيست والتنمية الطويلة الأجل في المختبر. أننا العثور على أن الحضانة للمصل (زجاجات المذابة، 100 مل) في حمام مائي سج 60 لمدة 60 دقيقة، مع لطيف خلط كل 10 دقيقة للزي تدفئة كان الأكثر فعالية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن عادة اختبار عدة الكثير من المصل من الموردين المحتملين للتوافق الثقافة اليرقات. وأخيراً، إنشاء خط الخلية الأولى (وحاليا فقط) الرخويات أصيلة، صناعي (ب) خط الخلية (بجي) الجنينية قبل هانسن16 كان إنجازا كبيرا التي سهلت إلى حد كبير التقدم في اليرقات المنشقات جهود زراعة. عزل المنسونيه س. ميراسيديا، عند وضعها في ثقافة التعاون مع خلايا بجي المتقدمة من المستوى الابتدائي إلى سبوروسيستس ابنه الثانوية/17، وفي نهاية المطاف إلى18،المرحلة النهائية السباحين19. وهكذا حققت المستمر في المختبر زراعة الحلزون كامل المرحلة من دورة حياة س. المنسونيه . وتؤيد بجي خلية الوسيلة المستخدمة في نظامنا الثقافة سبوروسيست النمو والتنمية والحفاظ على خط الخلية بجي.
وباختصار، لدينا وصف وبصريا يوضح بروتوكول مفصل للعزل الجماعي أكسينيك وزراعة ميراسيديال تخترق المرحلة من المنسونيه س.. هذه ميراسيديا، عندما تتعرض لظروف الثقافة المناسبة، وقادرة على تطوير الأجيال المتعاقبة سبوروسيست الابتدائية والثانوية، وفي نهاية المطاف سيركاريا. مع التطوير والتحسين المستمر للأدوات المتاحة حاليا للتلاعب بالجينات والجينات التعبير في المختبر عن طريق معدلة وراثيا، تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينوم التحرير (مثلاً، كريسبر/Cas9) النهج، ومن المتصور أن كفاءة الأساليب لعزل وزراعة ميراسيديا من مختلف الأنواع تريماتودي20 سيظل مطلوباً من أجل شراء المواد لمزيد النهوض بالبحوث في هذا المجال. هذا الأسلوب جيد يكمل بروتوكول تم وصفه مسبقاً لعزل واستزراع سيركاريا تخترق من المنسونيه س. لتسهيل التحول في المختبر ل المرحلة شيستوسومولا الثدييات21، في نهاية المطاف زراعة للكبار أوفيجيروس الديدان22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.
Acknowledgments
تمويل جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1AI015503. قدمت الفئران المصابة المنشقات البلهارسيا نييد مركز الموارد في معهد البحوث الطبية الحيوية (روكفيل، دكتوراه في الطب) من خلال المعاهد الوطنية للصحة-نييد HHSN272201000005I العقد للتوزيع من خلال "موارد الشركة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
