Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for store axenic isolasjon og samling av frittlevende miracidia av den menneskelige blod fluke Schistosoma mansoni og deres påfølgende behandling for innføring i i vitro kultur.
Abstract
Menneskelig blod flukes, Schistosoma spp., har en kompleks livssyklus som involverer aseksuell og seksuelle utviklingsmessige faser innenfor en snegle middels og pattedyr siste vert, henholdsvis. Isolere og opprettholde annen livssyklus stadiene under i vitro oppdrettsforholdene har mye lettere undersøkelser av mobilnettet, biokjemiske og molekylære mekanismer regulere parasitten vekst, utvikling og vert interaksjoner. Overføring av schistosomiasis krever ukjønnet formering og utvikling av flere larver stadier i sneglen host; fra det infeksiøs miracidium, gjennom primære og sekundære sporocyster, til cercarial finalen som er infeksiøs til mennesker. I denne artikkelen presenterer vi en trinnvis protokoll for masse klekking og isolering av Schistosoma mansoni miracidia fra egg fra lever av infiserte mus, og deres påfølgende innføring i i vitro kultur. Det er forventet at detaljert protokollen vil oppmuntre nye forskere til å engasjere seg i og utvide dette viktige området av schistosome forskning.
Introduction
Menneskelige blod flukes Schistosoma spp., er den forårsaker agenter av schistosomiasis, en forsømte tropiske sykdommer afflicting en estimerte 230 millioner mennesker over hele verden1. Den vanligste arten, Schistosoma mansoni, er geografisk distribuert i Sør-Amerika, de karibiske øyer, Midtøsten og sub-Sahara Afrika2. Livssyklusen til S. mansoniog andre schistosomes, er kompleks, som omfatter en pattedyr definitive vert og ferskvann snegler av slekten Biomphalaria som fungerer som forplikte mellomverter.
S. mansoni mannlige og kvinnelige voksen orm par bor i bakre hvem venene pattedyr vert reprodusere, noe som resulterer i utgivelsen av embryonated egg (ova) som blir lodged i de lille venules i tarmen. Egg da bryter gjennom fartøyet veggene, vandrer gjennom mucosal vev, og til slutt angi intestinal lumen der de er annullert med avføring. Når egg inn ferskvann og frittlevende Larvene (miracidia) Luke, må de i korte rekkefølge, finne et egnet Biomphalaria sneglen å infisere for å fortsette sin livssyklus. Denne infeksjon prosessen innebærer miracidial vedlegg til sneglens ytre kroppsdeler etterfulgt av aktive gjennomtrenging og oppføring av Larvene inn i verten. Snart etter oppføring begynner miracidium å kaste sine ytre tungeformet epidermal plater som danner en syncytium som vil bli den nye ytre overflaten (tegument) av neste larvestadiet, den primære eller mor sporocyst. Gjennom aseksuell reproduksjon, hver primære sporocyst produserer og slipper en ny generasjon sporocyster, kalt sekundær eller datter sporocyster, som igjen genererer og slipper et stort antall intramolluscan sluttfasen, cercaria3 . Ved flukt fra sneglen verten er frittlevende cercariae i stand til å feste til og direkte gjennomtrengende huden av et menneske eller andre passende pattedyr vert. Ved inngåelse deres ny vert, cercariae transformere til parasittiske schistosomula scenen og invadere det vaskulære systemet. De overføre igjen til lungene og deretter til hepatic venen der de eldre til voksen ormer, danne mannlige og kvinnelige par og reise til hvem årer å fullføre deres livet syklus.
Vellykket intramolluscan eller "sneglen fase" utvikling av larver schistosomes er avgjørende for videreføring av syklusen av menneskelig vert til vert-overføring. Er perioden følgende oppføring av frittlevende miracidium sneglen verten og tidlig transformasjonen til primære sporocyst stadium av avgjørende betydning. Avhengig av fysiologiske og immunologiske kompatibilitet mellom vert og parasitt er det i denne fasen av larver utvikling som innledende suksess eller fiasko å etablere infeksjoner er bestemt4,5,6 . Utvikling av primære sporocyster asexually produsere sekundære sporocyster, som deretter generere menneske-infeksiøs cercariae, videre krever en ettergivende fysiologiske vertsmiljøet som gir alle av det parasite vekst og reproduktiv behov.
Hittil lite er kjent om den underliggende fysiologisk, biokjemiske og molekylære prosesser kontrollere schistosome-sneglen interaksjoner, spesielt molekyler og veier involvert i regulere larver utvikling og reproduksjon eller modulerende verten immunreaksjoner. Tilgang til mange av disse larver stadier under i vitro kultur forhold som tillater eksperimentelle manipulasjon vil stor grad lette oppdagelsen av utviklingsmessige og underliggende mekanismene cellevekst, differensiering og reproduksjon. Kritisk parasitten gangstier eller mekanismer, identifisert gjennom i vitro eksperimentering, kan deretter brukes å forstyrre larver vekst/reproduksjon i sneglen verten eller identifisere sneglen vert immun mekanismer involvert i anerkjennelse og eliminering av miracidial eller sporocyst stadier.
I denne artikkelen og videopresentasjon, vi gir en detaljert beskrivelse av en metode for å isolere et stort antall frittlevende S. mansoni miracidia for innføring i i vitro kultur som kan deretter bli utsatt for oppfølging eksperimentell manipulasjon (se figur 1 for en skjematisk oversikt over protokollen arbeidsflyten). Selv om lignende prosedyrer har blitt beskrevet tidligere7,8,9, følte vi at en detaljert protokoll ville være nyttig for forskere som ønsker å ansette denne modellen å ta fortsatt ubesvart spørsmål knyttet til intramolluscan larver utvikling, mobilnettet spredning og schistosome-sneglen immun interaksjoner. I tillegg kan denne tilnærmingen lett tilpasses for isolering av egg fra andre medisinsk viktig trematodes som blæren-bolig S. haematobium, leveren flukes eller lunge flukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av dyr institusjon og bruk komiteen av University of Wisconsin-Madison under protokollen ingen. V005717. Følgende protokollen innebærer arbeider i en grad 2 (BSL2) anlegg for human patogener, selv om ingen av de schistosome stadiene avbildet i denne protokollen er infeksiøs mennesker eller andre pattedyr. Følg institusjonelle retningslinjer for håndtering av risiko gruppe 2 (RG2) human patogener.
Merk: Vi bruker kvinnelige Swiss-Webster mus (6 - uke gamle) på grunn av deres høyere mottakelighet for infeksjon10, og dermed gir større egg byrder. Tucker et al. beskriver musen og sneglen infeksjon protokollene som brukes i denne modellen systemet11. Tabell for materiale viser alle bestemt utstyr, materialer, reagenser og dyr kilder for å gjennomføre denne eksperimentelle protokollen.
1. behandling av infiserte lever
- Euthanize mus, 6-7 uker etter infeksjon, av CO2 kvelning (rate på 10-30% av kammeret volum per minutt). Overvåke mus for opphør av åndedrett og hjerteslag.
Merk: Vanligvis opptil 20 mus kan behandles om gangen. - Etter overføring euthanized mus til en biosafety skap, plassere mus på ryggen og spray deres ventrale overflater med 70% etanol. La suge for 1 min.
- Knip og trekke opp huden på nedre del av magen og kutte over basen på klemt nærmest magen med sterilt kirurgisk saks. Trekke kutt huden peke (dvs. mot hodet) å avsløre leveren. Merk at leveren burde bli forstørret og flekkete på grunn av en egg-indusert granulomatøs svar (figur 2A).
- Fjern leveren og plassere den i et beaker med 200 mL steril 1,2% NaCl løsning som inneholder penn/strep.
- Gjenta trinn 1.3 og 1.4 med gjenværende mus.
Merk: Tjue mus er vanligvis behandles i en enkelt harvest. - Plasser lever i et sterilt Petriskål og fjerne ikke lever fett/bindevev med sterilt tang.
- Overføre trimmet/renset lever et sterilt 250 mL sentrifuge flaske inneholder ~ 200 mL steril 1,2% NaCl løsning med penn/strep.
- Kraftig riste flasken inneholder lever, og bruker en steril disponibel pipette, fjerne overflødig overflaten skum/flytende avfall. Sakte hell av gjenværende saltvann i en container eller synke med 1% blekemiddel (desinfeksjonsmiddel).
- Legge til ~ 200 mL frisk saltvann i lever og gjentar trinn 1.8 tre ganger.
2. lever utvinning og miracidial isolasjon
- Legg lever i en liten sterilt rustfritt stål blender kopp og legge ~ 2 mL 1,2% NaCl løsning (figur 2B).
- Dekke koppen med folie og en Petriskål å hindre søl, og blanding for 1 min av vekslende lav og høy hastighet (20 s lav hastighet/10 s høy hastighet, gjenta) (figur 2C).
- Jevnt distribuere blandet leveren suspensjon i sterilt 250 mL sentrifuge flasker (for 20 lever bruker 4 flasker).
- Legge til sterilt saltvann med antibiotika ~ 200 mL totalt volum/flaske. Veie/balanse flasker før sentrifugering.
- Sentrifuger blandet lever 290 x g i 15 min på 4 oC. forsiktig hell av supernatants i en beholder med blekemiddel før forkaster.
- Gjenta trinn 2.4-2.5 en gang. Husk å grundig resuspend lever sediment før sentrifugering.
- Forkaster den siste saline vaskes (trinn 2.6), legge til 200 mL steril dammen vann med penn/strep til pelleted leveren vev, riste resuspend sedimenter, og overføre suspensjon til en sterilisert 1-L volumetriske kolbe som er helt dekket med aluminium folie, unntatt de 3 cm i nakken (figur 2D).
Merk: Bruk to flasker (= 10 lever) per 1-L kolbe. Dammen vann simulerer ferskvann naturen for å stimulere miracidial klekking egg. - Bruker sterilt dammen vann, fyll opp flasken til ca 3 cm over folien dekker på halsen. Så, uten forsinkelse (som miracidia snart begynne å klekkes), fjerne gjenværende skum og leveren vev flyter på overflaten av raskt pipettering opp ~ 12 mL dammen vann som inneholder rusk og forkaster det i en egen forkaste rør. Erstatte med fersk sterilt pond vann.
- Gjenta rengjøring trinn 2.8, tre ganger, sjekke for tilstedeværelse av miracidia i Forkast røret. Opphøre gjentakelse av rengjøring trinn hvis miracidia vises i vaskeløsning.
- Etter siste vask, sakte Legg ~ 12 mL av varm sterilt dammen vann (pre oppvarmet 30 oC) for å opprette en temperaturgradient med ren, sterilt vann på toppen.
Merk: Dette oppnås best av sakte lossing vann langs kolbe halsen å unngå blanding. - Plasser en liten Petriskål dekke over kolbe åpningen og skinne et lys øverst i flasken over folie dekselet å belyse den øvre overflaten av vannet.
Merk: Vanligvis innen 5-10 min, svømming miracidia, tiltrukket av lyset, vil konsentrere seg i stort antall innen de første 2-3 cm dammen vann (figur 3A).
3. Miracidial høsting og dyrking
- Når miracidia har samlet på overflaten etter 10 min, bruker et sterilt overføring Pipetter, fjerne ~ 8 mL av dammen vann og overføre til et sterilt 15-mL sentrifuge rør. Sett røret som inneholder miracidia på is.
- Legg tilbake 8 mL av varm sterilt dammen vann langs innsiden av volumetriske kolbe og vente en annen 10 min.
- Bruke nye rør hver gang, Gjenta trinn 3.1 og 3.2 tre ganger. Etter 4th samlingen, holde siste røret på is 10 min å tillate miracidia å bosette seg. Dette settet med rør består den første innhøstingen.
- Sentrifuger rør som inneholder miracidia på 290 x g for 1 min på 4 oC i en pre-avkjølt nedkjølt sentrifuge.
- Umiddelbart fjerne det meste av nedbryting (~ 7 mL) å være forsiktig for ikke å forstyrre parasitten pellet (figur 3B).
- Pool alle miracidia fra denne første harvest i en tube, deretter skylle alle opprinnelige rør med ~ 1 mL steril dammen vann og legge til "samlet" røret.
- Tillate parasitter betale på is for ~ 5 min, og igjen sentrifuge parasitter 290 x g for 1 min på 4 oC.
- Nøye fjerne nedbryting og legger 6-8 mL steril Chernin balansert salt løsning (CBSS +, se tabellen for materiale) inneholder penn/strep.
- Forsiktig suspendere den miracidia og aliquot dem i en 24-brønnen plate (1 mL per brønn), fulgt av skylling røret i 6-8 mL CBSS + og legge 1 mL av skyll i hver brønn. Inkuber parasitter på 26 oC under normoxic forhold. Konsentrasjoner av isolerte miracidia varierer, men vil vanligvis gjennomsnittlig ~ 7000/mL.
- Hvis parasitter er fortsatt fokus på lyskilden, Gjenta trinn 3.1 til 3,9 fortsette høsting sent-klekking miracidia men øke tidsintervallet mellom samlinger til 15-20 min.
Merk: Denne nye sett med rør representerer den andre høsting. Men fordi miracidial tall er vanligvis lav, er larver fra alle rør vanligvis samlet inn i en enkelt kultur godt med 2 mL CBSS +. - 24 timer etter høsting og dyrking, forsiktig resuspend sporocyster i deres brønner av pipettering.
- Vent et par minutter å tillate parasitter å bosette til bunnen av brønnene. Når de har avgjort, forsiktig fjerne nedbryting (~1.5 mL), som inneholder de fleste av tungeformet epidermal platene skur ved miracidia under larver transformasjon. Denne "transformasjon" supernatant kan enten forkastet eller innlemmet i oppfølgingsstudier av larver sekretoriske produkter.
- Legge til 1,5 mL frisk CBSS + hver godt og forsiktig Pipetter til resuspend sporocyster. Gjenta trinn 3.12 Hvis ytterligere vask eller bytte til et annet medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De aller fleste miracidia vanligvis vil har blitt samlet inn i de to første "avlinger". Inkubasjon av isolerte miracidia i CBSS + utløser miracidium-til-sporocyst transformasjonsprosessen (Figur 4A- C). I den første timen brønner følgende overføring til kultur som inneholder CBSS +, fleste av miracidia opphøre svømming (figur 4A). På 6 h i kultur og miracidia er i ferd med å aktivt shedding sine tungeformet epidermal plater (figur 4B). Samtidig med denne shedding prosessen, larvene danner deres ytre syncytial tegumental dekker som de forvandle til primære sporocyster. De fleste av parasitter har fullført larver transformasjon, bli fullt dannet sporocyster, ved 24-48 h etter dyrking i CBSS + (figur 4C). Etter 4 dager av kulturen i CBSS + alene, kan sporocyst overleve forventes å redusere ~ 80%. Men sporocyster kultivert for en dag i CBSS + og deretter overført til komplett Bge (cBge) medium for 3 dager vanligvis resultere i bedre overlevelse og larver med en mer robust utseende (Figur 4 d). Sporocyst levedyktighet generelt holder seg stabil mellom 4 og 7 dager i cBge med fortsatt økning i larver vekst på denne tiden kultur sammenlignet med CBSS + alene.
Figur 1 . Oversikt over protokollen arbeidsflyten. Skjematisk oversikt over de viktigste trinnene involvert i isolasjon og dyrking av miracidia avledet fra mus infisert med den menneskelige blod fluke, S. mansoni. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Behandling av de infiserte lever. (A) musen leveren tungt infisert med S. mansoni egg. Merk forstørret størrelsen, unormal farge og tilstedeværelsen av granulomer i infiserte leveren (høyre) sammenlignet med en vanlig infisert lever (venstre). (B) Washed musen lever etter overføring til sterilt rustfritt stål blender cup. Lever ble deretter blandet ett minutt bruker sterilt folie og Petriskål for å dekke koppen, dermed unngår søl (C). Etter blanding, var det lever homogenate, som inneholder egg, vasket flere ganger i saltvann og resuspended i sterilt dammen vann, før overføres til en 1-L volumetriske kolbe dekket med aluminiumsfolie (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Høsting S. mansoni miracidia. Aktivt svømming miracidia konsentrert av attraksjon lys på toppen av volumetriske kolbe (A). Med 10 minutters intervaller, er parasitter høstet av pipette og plassert på 4 ° C til nakkens larver. Miracidia deretter vasket i CBSS + av sentrifugering og samlet i et enkelt rør (B) like før distribusjon til wells fra en kultur plate. CBSS +; Chernins balansert salt løsning (Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Miracidial transformasjon til primære sporocyster og vedlikehold i vitro . S. mansoni miracidia og sporocyster plassert inn i vitro kultur på ulike klokkeslett etter høsting. Nylig høstet miracidia innen 1 time kultur i CBSS + (A). Etter 6 h kultur og miracidia har begynt å kaste sine tungeformet epidermal plater (piler) som de forvandle til primære sporocyster (B). Etter 24 timer i CBSS + har de fleste av miracidia helt forvandlet til primære sporocyster (C). Sporocyster ble forvandlet CBSS + 24 h, deretter overført og vedlikeholdes i cBge medium for 3 dager (D). Sporocyster vanligvis vises mer robust og har høyere overlevelse på 4 dager etter dyrking i nærvær av cBge, sammenlignet med CBSS + alene. CBSS +, Chernins balansert salt løsning; cBge medium, komplett B. glabrata embryonale celle medium (se Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia av S. mansoni, isolert og manipulert som beskrevet her, kan infisere bare sneglen mellomliggende verten, og derfor representerer ikke en menneskelig biohazard i denne fasen av larver utvikling. Men for å unngå utilsiktet eksponering/infeksjon av snegler, bør omsorg tas for å utføre miracidial isolasjoner et annet sted fra områder hvor utsatt Biomphalaria sneglen arter kan være nåværende eller vedlikeholdes. Et eget rom, registrert som BSL2 plass, anbefales. Dessuten, alle vask løsninger brukes i behandlingen av lever og larver isolasjon bør behandles med desinfiserende (f.eks, 1% blekemiddel) før salg.
Det bør bemerkes at kirurgisk fjerning av lever fra infiserte mus og deres påfølgende behandling før blanding/homogenisering utføres i en biologiske sikkerhetskabinett kabinett (BSC) under aseptiske forhold. Imidlertid av praktiske grunner (enkel manipulere bulk prøver) er alle andre prosedyrer gjort på en desinfiseres Borstemmaskin sterile containere (f.eks, blender kopper, flasker, flasker og rør, overføring Pipetter for flergangsbruk, etc.) og sterile løsninger inneholder antibiotika (saltvann, dammen vann, CBSS). Antibiotika legges til alle løsninger ytterligere kategorilister introdusert mikrobiell forurensning. I tillegg under miracidial isolasjon og høsting trinn (protokollen deler 2 og 3), er en liten Petriskål cover plassert over kolbe åpning for å minimere utenfor forurensing under første fjerning av skum/leveren rusk og påfølgende overføring av konsentrert miracidia fra flasken til sentrifuge rør.
Vanligvis høster vi miracidia fra 20 infisert musen lever i en enkelt satsvis, som vi anslår larver avkastning av ca 5000 Larvene per leveren. Imidlertid kan gir variere betydelig avhengig av infeksjon intensiteten av personlige mus resulterer i parti til parti variasjon i miracidial inngang. Isolasjoner kan utføres ved hjelp av færre Start lever, selv om metoden vi har beskrevet er generelt gjelder for 10-20 lever. Når 20 lever behandles, etter den siste rørets av leveren pellets i sterilt dammen vann (protokollen inndeling 2, trinn 2.7), bør suspensjoner fordeles likt i to 1000-mL flasker (2 flasker/kolbe). Hvis 10 lever eller færre, den opprinnelige lever homogenates (protokollen del 2, trinn 2.3) kan distribueres til 2 flasker og vasket suspensjoner deretter overført til en enkelt volumetriske kolbe for videre behandling. Ett eller 2 lever også kan behandles, men antall (volumer) utvinning, vask og klekking løsninger skal reduseres forholdsmessig, med siste vasket sedimenter i dammen vann overføres til en 10-mL folie-dekket volumetriske kolbe å konsentrere miracidia.
For å maksimere miracidial avkastning med minst leveren rusk forurensning, er det også viktig å utføre dammen vann vasker (protokollen del 2, trinn 2.7-2.9) så raskt og effektivt som mulig. Når eggene er utsatt for dammen vann, oppstår miracidial klekking like etter selv om tiden før larver opptreden på lyskilden i kolbe halsen kan variere fra 5-20 min etter klekking begynner. For å begrense tap av parasitter under dammen vann rengjøring vask trinnene er det avgjørende å visuelt se hver dammen vann for tidlig ankommer miracidia i det øvre laget av kolbes nakke. Dessuten, når miracidia overføres til 15-mL samling rør og plasseres på is, vil de opphøre svømming aktivitet og bosette til bunnen rør. Imidlertid etter sentrifugering til pellets Larvene (del 3, trinn 3.4-3,5), vil miracidia igjen begynne å svømme om vann er tillatt å varme. Derfor er det viktig å fjerne dammen vannet raskt, men uten forstyrrende pellet eller pipettering opp svømming parasitter.
Som tidligere nevnt, gir av isolerte miracidia kan variere avhengig av antall voksen orm par i individuelle mus (infeksjon intensitet) og konsekvens av innledende infeksjon protokoller. Fleste (80-90%) vil konsentrere på lyskilden over harvest perioden Miracidia er sterkt phototropic. De resterende 10-20% av miracidia vil fortsette å klekkes og mer samle sakte i andre harvest perioden. Mest (> 95%) miracidia introdusert i kultur og vedlikeholdes på 26 oC i CBSS + medium vil har omgjort til primære sporocyster innen 24-48 timer dyrking. På denne tiden, larver levedyktighet er vanligvis > 90%. Etter 4 dager i CBSS + alene levedyktighet synker betydelig (70-80%). Imidlertid resulterer bytte kultur medium fra CBSS + å fullføre Bge middels 24 h følgende innledende CBSS dyrking i høyere overlevelse og mer robust vekst. Vi opprettholder rutinemessig kortsiktige sporocyst kulturer under normoxic forhold. Sporocyster er imidlertid ganske følsom oksygen, og spesielt reaktive oksygen arter som kan være skadelige oksidative skader7. CJ Bayne4 og andre har rapportert at den generelle helsen og levedyktigheten til sporocyster i vitro betydelig forbedret ved kulturer opprettholdes under hypoxic forhold. Senket oksygennivået fås ved gassing (med nitrogen) personlige closeable flasker eller nitrogen-anriking av gassform av inkubator4.
Som sitert ovenfor, metoder for axenic isolere og dyrking av schistosome har miracidia og sporocyster blitt beskrevet tidligere. Det ble anerkjent tidlig at miracidial phototropism kan brukes til å samle og konsentrere svømming larver og den isolerte miracidia kunne raskt immobilisert i hyperosmotic saltvann løsninger (mellom 120-160 mOs/Kg)8. Videre ble det observert at vedlikehold i saltvann løsninger resulterte i transformasjonen av miracidia til primære sporocyster, den første intramolluscan larvestadiet9,12. Komplekse media har også vært formulert for å støtte langsiktig i vitro vekst og utvikling av S. mansoni sporocyst trinn9,13,14,15, i tillegg til celler avledet fra sneglen verten Biomphalaria glabrata16. Disse formuleringene innlemmet ulike kommersielle medier, og kan ha vært supplert med aminosyrer, salter, lipider, reduksjonsmidler og sukker. Komplett formuleringer også inkludert inaktivert fosterets storfe eller hest serum i ulike konsentrasjoner. Vi har funnet den riktige varme-inaktivering (HI) var avgjørende for sporocyst overlevelse og langsiktig utvikling i vitro. Vi fant at inkubering av serum (tinte, 100 mL flasker) i en 60 oC waterbath for 60 min, med milde blande hvert 10 min for uniform oppvarming var mest effektive. Dessuten, teste vi vanligvis flere masse serum fra en potensiell leverandør for larver kultur kompatibilitet. Til slutt, etableringen av den første (og foreløpig bare) autentisk bløtdyr celle linjen, B. glabrata embryonale (Bge) cellen linjen av Hansen16 var et stort gjennombrudd som betydelig lettere fremskritt i larver schistosome dyrking innsats. Isolerte S. mansoni miracidia, når den plasseres i co kultur med Bge celler utviklet fra grunnskole til videregående/datter sporocyster17, og til slutt til cercarial sluttfasen18,19. Derfor er kontinuerlig i vitro dyrking av hele sneglen fase av levetid S. mansoni oppnådd. Bge celle mediet som brukes i vår kultur-systemet støtter både sporocyst vekst/utvikling og vedlikehold av Bge cellen linje.
I sammendraget, har vi beskrevet og visuelt illustrert en detaljert protokollen for mass axenic isolasjon og dyrking av frittlevende miracidial scenen S. mansoni. Disse miracidia, når utsatt for aktuelle oppdrettsforholdene, er i stand til å utvikle påfølgende primære og sekundære sporocyst generasjoner, og til slutt cercariae. Med utvikling og kontinuerlig forbedring av verktøy tilgjengelig for å manipulere gener og gene uttrykk i vitro gjennom transgene, RNA-interferens og genom redigering (f.eks CRISPR/Cas9) tilnærminger, det seg så effektiv metoder for isolasjon og dyrking av miracidia fra trematode artsmangfoldet20 vil fortsette å være nødvendig for å skaffe materialer for videre utvikling av forskning i dette feltet. Denne metoden passer pent en tidligere beskrevet protokoll for å isolere og dyrking frittlevende cercariae av S. mansoni tilrettelegge i vitro transformasjon pattedyr schistosomula scenen21, for eventuelle dyrking til ovigerous voksen ormer22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Delfinansiert av NIH grant RO1AI015503. Schistosome-infiserte mus ble levert av NIAID Schistosomiasis ressurssenteret ved Biomedical Research Institute (Rockville, MD) gjennom NIH-NIAID kontrakt HHSN272201000005I for distribusjon via BEI ressurser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
