Summary
Bu makalede büyük ölçekli axenic yalıtım ve insan kan fluke Schistosoma mansoni free-swimming miracidia toplanması için bir protokol ve onların sonraki işlem vitro kültür içine giriş için.
Abstract
İnsan kan flukes, Schistosoma spp., bir salyangoz ara ve memeli son ev sahibi içinde eşeysiz ve cinsel Gelişim aşamaları sırasıyla içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. İzole etmek ve farklı yaşam döngüsü aşamaları vitro kültür koşullar altında sürdürmek yeteneği büyük ölçüde araştırmalar parazit büyüme, gelişme ve ana bilgisayar düzenleyen hücresel, biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları kolaylaştırdı etkileşimler. Sistozomyas iletimini eşeysiz üreme ve gelişme salyangoz ana bilgisayar içinde birden çok larva aşamaları gerektirir; Enfektif miracidium, insanlara infektif son cercarial aşaması için birincil ve ikincil sporocysts aracılığıyla. Bu yazıda biz kitle tarama ve izole Schistosoma mansoni miracidia yumurtadan karaciğerleri virüslü fareler ve onların sonraki giriş vitro kültür içine elde edilmesi için adım adım bir protokolü mevcut. Detaylı iletişim kuralı yeni araştırmacılar meşgul ve bu önemli alan paraziti araştırma genişletmek için teşvik edecek öngörülmektedir.
Introduction
İnsan flukes Schistosoma spp. kan, şistozomiyazis, ihmal edilen tropikal bir hastalık bir tahmini 230 milyon kişi dünya çapında1etkileyen etken ajanlardır. En yaygın tür, Schistosoma mansoni, Güney Amerika, Karayipler adalar, Orta Doğu ve alt-Sahra Afrika2coğrafi olarak dağıtılır. S. mansonive diğer schistosomes yaşam döngüsünün bir memeli kesin ana bilgisayar ve zorunlu ara konukçu olarak hizmet tatlı su Biomphalaria cinsi salyangoz içeren karmaşık bir şey.
S. mansoni erkek ve dişi yetişkin bağırsak mukoza küçük venüller içinde teslim olmak embryonated yumurta (ova) sürümü sonuçlanan yaşayan memeli ev sahibi çoğaltmak, posterior Mezenterik damarlarında çiftleri solucan. Yumurta sonra tatili gemi duvarları üzerinden Mukozal doku ile göç ve sonunda nerede dışkı ile hükümsüz intestinal Lümen girin. Ova tatlı su ve free-swimming larva (miracidia) kapağı girdiğinizde, onlar kısa sürede yaşam döngüsünün devam edebilmek için bulaştırmak için uygun bir Biomphalaria salyangoz bulmalısınız. Bu enfeksiyon işlem salyangoz'ın dış gövdesi yüzey aktif penetrasyon ve larva giriş ana bilgisayar takip miracidial eki içerir. Yakında girmesinden sonra miracidium sonraki larva sahne alanı, birincil ya da anne sporocyst'ın yeni dış yüzey (tegument) olacak bir syncytium formlar onun dış siliyer epidermal plakaları döken başlar. Eşeysiz üreme, her birincil sporocyst üretir ve ikinci nesil sporocysts, ikincil olarak adlandırdığı veya sırayla, oluşturmak ve son intramolluscan aşaması, cercaria3 çok sayıda yayın kızı sporocysts bültenleri . Salyangoz ana bilgisayardan kaçış, free-swimming cercariae için bağlama ve doğrudan bir insan veya diğer uygun memeli ana cildin derinlemesine yeteneğine sahiptirler. Yeni ev sahibi girdiği, üzerine cercariae parazit schistosomula Sahne Alanı'na dönüştürmek ve damar sistemi istila. Onlar, buna karşılık, akciğer ve sonra nerede yetişkin solucanlar için olgun, erkek ve dişi çiftleri oluşturmak ve onların yaşam döngüsünü tamamlamak için Mezenterik damarların seyahat hepatik ven göç.
Başarılı intramolluscan veya larva schistosomes gelişimi "Salyangoz aşama" için insan ana bilgisayar ana bilgisayar veri aktarımı döngüsünün devamlılık esastır. Salyangoz ev sahibi ve birincil sporocyst sahneye erken dönüştürmenin içine free-swimming miracidium dönem aşağıdaki girdiyi kritik önem taşımaktadır. Fizyolojik ve immünolojik arasında uyumluluğu sağlamak bağlı olarak ev sahibi ve parazit, larva gelişme bu aşamada o ilk başarı veya başarısızlık enfeksiyonlarına eğilimli kararlı4,5,6 kurmak için öyle . Birincil sporocysts sonra insan Enfektif cercariae oluşturmak, ikincil sporocysts eşeysiz üretebilen sonraki gelişimi daha fazla gereken tüm asıl olayın asalağın büyüme için sağlar bir keyfi fizyolojik ana ortamı ve üreme ihtiyacı var.
Bugüne kadar küçük temel hakkında fizyolojik, biyokimyasal bilinir ve moleküler süreçler, paraziti-salyangoz etkileşimleri kontrol özellikle molekülleri ve yollar larva gelişme ve üreme düzenleyen veya oransal olarak dahil ana bilgisayar bağışıklık yanıtı. Larva bu aşamaların deneysel düzenleme izni vitro kültür koşullar altında çok sayıda hazır erişim büyük gelişim yolları keşfi ve hücre büyüme, farklılaşma temel mekanizmaları kolaylaştırmak ve üreme. Kritik parazit yolları veya vitro deneyler tespit mekanizmaları, sonra larva büyüme/üreme salyangoz konak bozabilir ya da salyangoz konak immün mekanizmalar tanıma ve ortadan kaldırılması yer belirlemek için kullanılabilir miracidial veya sporocyst aşamaları.
Bu makale ve video sunumu, free-swimming S. mansoni çok sayıda izole bir yöntem ayrıntılı bir açıklama sağlamak için giriş sonra takip için deneysel tabi vitro kültür içine miracidia manipülasyon (iletişim kuralı iş akışı şematik bir bakış için bkz: şekil 1 ). Her ne kadar benzer yordamlarda açıklandığı daha önce7,8,9, biz ayrıntılı bir protokol bu modeli hala cevaplanmamış soruları ile ilgili gidermek için istihdam etmek isteyen araştırmacılar için yararlı olacağını hissettim intramolluscan larva geliştirme, hücresel proliferasyonu ve paraziti-salyangoz bağışıklık etkileşimleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım kolayca mesane-konut S. haematobium, karaciğer flukes veya akciğer kuyruk gibi tıbbi açıdan önemli diğer trematodes yumurtadan yalıtım için adapte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi iletişim kuralı altında tarafından onaylanmış yok. V005717. Bu protokol için tasvir paraziti aşamaları hiçbiri insanlar ya da diğer memeliler infektif olmasına rağmen aşağıdaki protokol bir seviye 2 (BSL2) tesis insan patojenler için çalışan içerir. Risk grubu 2 (RG2) insan patojenleri işlemek için kurumsal ilkeleri uygulayın.
Not: Biz böylece daha büyük yumurta yükleri verimli enfeksiyon10, onların daha yüksek duyarlılık nedeniyle kadın Swiss-Webster fareler (6 - eski hafta) kullanın. Tucker ve ark. bu modeli sistem11' kullanılan fare ve salyangoz enfeksiyon iletişim kurallarını açıklar. Malzemeler tablo tüm özel ekipman, malzeme, reaktifler ve hayvansal kaynaklar bu deneysel protokol taşımak için gerekli listeler.
1. enfekte karaciğerleri işlenmesi
- CO2 boğulma (dakika başına odası 's hacmi 10-%30 oranı) tarafından fareler, 6-7 hafta sonrası enfeksiyon, ötenazi. Fareler solunum ve kalp atışı kesilmesi için izleyin.
Not: Genellikle, belirli bir zamanda 20 fareler kadar işlenmiş. - Ötenazi fareler bir biyogüvenlik kabini aktarma sonra fare sırtlarını yerleştirin ve onların ventral yüzeyler % 70 etanol ile sprey. 1 dk. için emmek izin.
- Çimdik ve alt karın deri çekin ve boğumlu cilt Bankası arasında steril Cerrahi makas ile karın en yakın kesti. Çekin kesilen deri anteriorly (Yani, kafa doğru) karaciğer ortaya çıkarmak için. Karaciğeri genişlemiş ve bir yumurta kaynaklı Granülomatöz nedeniyle yanıt (şekil 2A) benekli olduğunu unutmayın.
- Karaciğer çıkarın ve 200 mL steril % 1.2 NaCl çözüm içeren kalem/strep içeren bir ölçek yerleştirin.
- 1.3 ve 1.4 kalan fareler ile adımları yineleyin.
Not: Yirmi fareler genellikle tek bir hasat işlenir. - Karaciğer içinde steril Petri kabına yerleştirin ve sigara-karaciğer yağ/bağ dokusu ile steril forseps kaldırın.
- Kesilmiş/temizlenmiş karaciğerleri ~ 200 mL steril % 1.2 NaCl çözeltisi ile kalem/strep içeren bir steril 250 mL santrifüj şişe aktarın.
- Şiddetle karaciğerleri içeren şişe sallamak ve steril bir tek kullanımlık pipet kullanarak, köpük/yüzen enkaz fazla yüzey kaldırın. Yavaş yavaş bir konteyner içine kalan tuz solüsyonu dökün veya içeren % 1 çamaşır suyu (dezenfektan) batmak.
- Karaciğer için ~ 200 mL taze tuz çözeltisi ekleyin ve 1.8 üç kez daha tekrarlayın.
2. karaciğer çıkarma ve miracidial yalıtım
- Karaciğerleri küçük steril paslanmaz çelik blender fincan içine yerleştirin ve ~ 2 mL % 1.2 NaCl çözeltisi (şekil 2B) ekleyin.
- Kapak folyo ve sızıntıları önlemek ve 1 dk. için düşük ve yüksek hız (20 s düşük hız/10 s yüksek hızlı; tekrar) alternatif tarafından karışımı bir petri kupa (şekil 2C).
- (4 şişe 20 karaciğerleri kullanmak için) steril 250 mL santrifüj şişe karıştırılan karaciğer süspansiyon dağıtabilmenizi.
- Antibiyotik steril serum fizyolojik ~ 200 mL toplam birim/şişe için ekleyin. Tartmak/şişe Santrifüjü önce denge.
- Santrifüj 290 x g 4 oC. yavaşça, 15 dakika, karışım karaciğerleri supernatants atarak önce çamaşır suyu ile bir kaba dökün.
- 2.4-2,5 bir kez yineleyin. Santrifüjü önce karaciğer tortu iyice resuspend emin olun.
- Son serum discarding sonra yıkayın (Adım 2.6), 200 mL steril Göl suyu ile kalem/strep pelleted karaciğer dokusu, tortu resuspend ve tamamen alüminyum ile kapsadığı steril 1-L volumetric flask süspansiyon aktarmak için sallamak için ekleyin folyo, üst boyun (şekil 2B) 3 cm dışında.
Not: 1-L şişe iki şişe (10 karaciğerleri =) kullanın. Göl suyu miracidial damızlık yumurtadan uyarmak için gerekli doğal tatlı su ortamına benzeyen. - Steril Göl suyu kullanarak, yaklaşık 3 cm boyunda kapsayan folyo yukarıda şişeye doldurun. Sonra gecikmeden (miracidia yakında başladığınızda yumurtadan), kalan köpük ve karaciğer dokusu yüzeye hızla ~ 12 mL kadar su birikintisi Su enkaz içeren pipetting tarafından yüzen kaldırmak ve ayrı bir atarak at tüp. Taze steril Göl suyu ile değiştirin.
- Tekrar temizlik adım 2.8, üç kez, miracidia at tüp varlığı için kontrol edin. Tekrarlama miracidia yıkama çözümde görünüyorsa, adım Temizleme keserler.
- Son yıkama sonra ~ 12 mL sıcak steril gölet su (30 oC önceden ısındı) üstüne ılık suyla temiz, steril bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş ekleyin.
Not: Bu en iyi yavaş yavaş karıştırma önlemek için şişe Boyun kenarındaki su boşaltma tarafından gerçekleştirilir. - Balonun açılış üzerinde bir küçük Petri kabına kapağını yerleştirin ve şişeye su üst yüzeyi aydınlatmak için folyo kapak yukarıda üstünde parlak bir ışık.
Not: Genellikle 5-10 dk içinde miracidia, ışığa, çekici yüzme çok sayıda Göl suyu (şekil 3A) içinde ilk 2-3 cm odaklanacaktır.
3. Miracidial hasat ve işleme
- 10 dakika sonra yüzeyde miracidia topladığı zaman, steril transfer damlalıklı kullanarak ~ 8 mL Göl suyu ve steril 15 mL santrifüj tüpü transfer kaldırın. Miracidia buz üzerinde içeren tüp yerleştirin.
- Sıcak steril Göl suyu volumetric flask iç boyunca arka 8 mL ekleyin ve başka bir 10 dakika bekleyin.
- Her seferinde yeni borular kullanarak, 3.1 ve 3.2 üç kez daha arasındaki adımları yineleyin. 4th toplandıktan sonra buz miracidia yerleşmek izin vermek 10 dakika için son tüp tutun. Tüpler bu dizi ilk hasat oluşmaktadır.
- Miracidia 290 x g 4 oC önceden soğutulmuş soğutmalı santrifüj, 1 dk. için de içeren santrifüj tüpleri.
- Hemen parazit Pelet (şekil 3B) bozmamaya dikkat edin süpernatant (~ 7 mL) çoğunu kaldırın.
- Tüm miracidia gelen bu ilk hasat içine bir tüp, tüm orijinal tüpleri ~ 1 mL steril su birikintisi su ile durulayın ve "havuz" tüp eklemek Havuzu.
- Parazitler buza ~ 5 min için yerleşmek izin verir ve tekrar 290 x g 4 oC., 1 dk. için parazitlere santrifüj kapasitesi
- Dikkatle süpernatant kaldırın ve 6-8 mL steril Chernin'ın dengeli tuz solüsyonu (CBSS +; bkz: malzemeler tablo) içeren kalem/strep ekleyin.
- Hafifçe miracidia ve onlara bir 24-şey kültür plaka (iyi başına 1 mL), takip tüp 6-8 mL CBSS + durulama ve her şey için durulama 1 mL ekleyerek aliquot askıya alma. 26 oC normoxic koşullar altında parazitlere kuluçkaya. İzole miracidia konsantrasyonları değişir, ancak genellikle ~ 7000/mL ortalamasını alır.
- Parazitler hala ışık kaynağından konsantre oldular adımları 3.1 3.9 için tarama geç miracidia hasat devam etmek için tekrar ancak 15-20 dk koleksiyonları arasındaki zaman aralığını artırın.
Not: İkinci hasat tüpler bu yeni kümesini temsil eder. Ancak, miracidial numaraları genellikle düşük olduğundan, larvaları üzerinden tüm tüpler genellikle de 2 mL CBSS + içeren tek bir kültürün içine havuza. - Yavaşça 24 h hasat sonrası ve yetiştirme, onların Wells sporocysts pipetting tarafından resuspend.
- Parazitler kuyuları altına yerleşmek izin vermek için birkaç dakika bekleyin. Bir kez onlar yerleşmiş, larva dönüştürme sırasında miracidia tarafından döken siliyer epidermal plakaları çoğunu içeren süpernatant (~1.5 mL), dikkatli bir şekilde çıkarın. Bu "dönüşüm" süpernatant ya atılan veya olabilir larva salgı ürünleri takip çalışmaları dahil.
- Taze CBSS + 1,5 mL her şey ve yavaşça pipet sporocysts resuspend ekleyin. Daha fazla yıkama veya farklı bir orta olarak değiştirmek isterseniz 3.12 adımları yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Miracidia büyük çoğunluğu genellikle ilk iki "Hasat" toplanmış. CBSS + izole miracidia kuluçka (Şekil 4A- C) miracidium sporocyst dönüşüm sürecini tetikler. İlk bir saat içinde CBSS +, yüzme miracidia kes (şekil 4A) çoğunluğu içeren aşağıdaki kültür aktarmak kuyuları. 6 h kültür, miracidia altındadır aktif onların siliyer epidermal plakaları (şekil 4B) dökülme sürecinde. Onlar için birincil sporocysts dönüştürmek gibi bu dökülme süreci ile çakışık, onların dış sinsisyal tegumental kaplama larva formu. Parazitler çoğunu 24-48 h sonrası ekimi CBSS + (şekil 4 c) tarafından sporocysts, tam olarak kurulan olma larva dönüşümü tamamlamış olacaksınız. CBSS + yalnız kültür 4 gün sonra sporocyst hayatta kalma ~ %80 azaltmak için beklenebilir. Ancak, sporocysts CBSS + 1 gün için kültürlü ve 3 gün genellikle daha iyi sağkalım oranları ve larvaları ile daha sağlam bir görünüm (şekil 4 d) neden için tam Bge (cBge) orta olarak transfer edilir. Sporocyst canlılığı genellikle bu süre içerisinde CBSS + için yalnız karşılaştırıldığında kültür larva büyüme sürekli artış ile cBge içinde 4 ve 7 gün arasında sabit kalır.
Resim 1 . İletişim kuralı iş akışı genel bakış. Yalıtım modunda büyük adımlar şematik özetini ve miracidia ekimi fareler insan kan fluke, S. mansoniile enfekte elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Virüslü karaciğerleri işleme. (A)fare karaciğer ağır S. mansoni yumurta ile enfekte. Genişlemiş boyutu, anormal renk ve Granülom (sağ) (sol) normal virüs bulaşmamış karaciğer için karşılaştırıldığında virüslü karaciğerde varlığı dikkat edin. (B) yıkanmış steril paslanmaz çelik blender Kupası transferden sonra karaciğerleri fare. Karaciğerleri sonra steril folyo ve Petri kabına böylece sızıntıları (C) kaçınarak Kupası kullanacak bir dakikalığına karıştırılmıştır. Karıştırma sonra yumurta, içeren karaciğer homogenate salin birkaç kez yıkanmış ve 1-L volumetric flask için transfer ediliyor (D) alüminyum folyo ile kaplı önce steril su birikintisi suda resuspended. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Hasat S. mansoni miracidia. Aktif miracidia cazibe ışığa hacimsel şişeye(a)üstündeki tarafından konsantre yüzme. 10 dk aralıklarla parazit tarafından pipet hasat ve 4 ° C de larvaları hareketsiz için yerleştirilir. Miracidia o zaman CBSS + Santrifüjü tarafından yıkanmış ve bir tek tüp (B) sadece dağıtım önce kültür plaka wells için toplanan. CBSS +; Chernin'ın dengeli tuz solüsyonu (Malzemeler tablo). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Miracidial dönüştürme birincil sporocysts ve bakım için vitro . S. mansoni miracidia ve sporocysts için farklı zamanlarda vitro kültür yerleştirilen sonrası hasat. Yeni hasat miracidia kültür CBSS +(a)1 saat içinde. Kültür 6 h sonra miracidia birincil sporocysts (B) dönüştürmek onların siliyer epidermal plakaları (oklar) döken başlamıştır. CBSS + 24 saat sonra miracidia çoğunu tamamen birincil sporocysts (C) dönüştürülmüş. Sporocysts CBSS + 24 h için dönüştürülmüş sonra transfer ve 3 gün (D) cBge ortamda yapılmaktadır. Sporocysts genellikle daha sağlam görünür ve 4 gün sonrası ekimi huzurunda cBge CBSS + için yalnız karşılaştırıldığında, daha yüksek sağkalım oranları sahip. CBSS +, Chernin'ın dengeli tuz solüsyonu; cBge orta, tam B. glabrata embriyonik hücre orta ( Tablo malzemelerigörmek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miracidia izole ve burada, açıklandığı gibi manipüle S. mansoni, sadece salyangoz ara ana bilgisayar enfekte olabilir ve bu nedenle insan bir biohazard larva gelişme bu aşamada temsil etmemektedir. Ancak, yanlışlıkla pozlama/in helezon bulaşmasını önlemek için duyarlı Biomphalaria salyangoz türleri mevcut veya tutulan nerede olabilir alanlardan farklı bir konumda miracidial izolasyonların gerçekleştirmek için özen gösterilmelidir. BSL2 alanı kayıtlı ayrı bir oda önerilir. Buna ek olarak, tüm yıkama karaciğer ve larva yalıtım işleme için kullanılan çözümler dezenfektan (örneğin, % 1 çamaşır suyu) elden çıkarmadan önce tedavi edilmelidir.
Bu fareler karaciğerleri cerrahi olarak çıkarılması enfekte ve onların sonraki işlem karıştırma/homojenizasyon önce aseptik koşullar altında bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) gerçekleştirilir unutulmamalıdır. Ancak, pratik nedenlerle (toplu örnekleri işleme kolaylığı) steril konteyner (örneğin, blender bardak, şişe, şişe ve tüpler, transfer pipets, vb) ve steril çözümleri kullanan bir dezenfekte benchtop üzerinde tüm diğer yordamlar yapılır antibiyotikler (serum fizyolojik, Göl suyu, CBSS) içeren. Antibiyotikler tüm çözümler tanıtıldı mikrobiyal kirlenme karşı daha fazla önlem olarak eklenir. Buna ek olarak, miracidial yalıtım ve adımları (iletişim kuralı Bölüm 2 ve 3) hasat sırasında ilk kaldırma sırasında dış kirlenme köpük/karaciğer enkaz ve sonraki transferi en aza indirmek için açılış şişesi üzerinde bir küçük Petri kabına kapak yer alıyor konsantre miracidia tüpler santrifüj kapasitesi balonun üzerinden.
Tipik olarak, biz miracidia üzerinden 20 virüslü fare karaciğerleri tek bir toplu iş içinden tahmin ettiğimiz karaciğer başına yaklaşık 5000 larva larva verimi hasat. Ancak, verimleri bireysel fareler toplu iş toplu iş varyasyon miracidial iyileşme sonuçlanan enfeksiyon yoğunluğu bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. İzolasyonların daha az başlangıç karaciğerleri kullanılarak yapılabilir, her ne kadar yöntemi biz anlatmıştık genellikle 10-20 karaciğerler için geçerlidir. 20 karaciğerleri işlendiğinde steril Göl suyu (iletişim kuralı bölümü 2, adım 2.7), karaciğer pellet son resuspension takip süspansiyonlar eşit iki 1000 mL şişe (2 şişe/şişesi) dağıtılmış. 10 karaciğerleri veya daha az kullanılması halinde, özgün karaciğer homogenates (iletişim kuralı Bölüm 2, adım 2.3) için 2 şişe dağıtılabilir ve sonra diğer işlemler tek volumetric flask transfer süspansiyonlar yıkadım. Bir veya 2 karaciğerleri aynı zamanda işleme, ama miktarlarda (birimler), ayıklama, yıkama ve çözümleri kuluçkalık azaltılmış orantılı olarak, ile sonda gelen tortu konsantre 10 mL folyo kaplı volumetric flask için aktarılan gölet suda yıkanmış miracidia.
Karaciğer enkaz kontaminasyon minimum miracidial verimi en üst düzeye çıkarmak için bu da aynı hızla ve verimli bir şekilde mümkün olduğunca gölet su yıkama (iletişim kuralı Bölüm 2, adımları 2,7-2,9) gerçekleştirmek önemlidir. Yumurta gölet suya maruz sonra ışık kaynağı ve şişe boyun larva görünüm 5-20 dk sonra damızlık değişebilir önce zaman başlar rağmen miracidial damızlık kısa bir süre sonra ortaya çıkar. Su birikintisi temizlik sırasında parazitler kaybı sınırlamak için balonun'ın boyun üst su tabakası içinde erken gelen miracidia için görsel olarak her Göl suyu kontrol etmek çok önemli adımlar yıkayın. Buna ek olarak, bir kez miracidia 15 mL koleksiyonu tüpler için transfer edilir ve buz üzerinde yerleştirilir, onlar etkinlik Yüzme ateşkes ve tüp altına yerleşmek. Ancak, larva (Bölüm 3, adımları 3.4-3,5) cips için Santrifüjü sonra miracidia tekrar su ısıtmak için izin verilip verilmediğini yüzmeyi başlayacak. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, ama ezelî Pelet rahatsız edici ya da parazit Yüzme pipetting Göl suyu kaldırmak önemlidir.
Daha önce belirtildiği gibi izole miracidia verimi yetişkin solucan çiftlerinin bireysel fareler (enfeksiyon yoğunluğu) mevcut sayısı ve tutarlılık ilk enfeksiyon iletişim kurallarının bağlı olarak değişir. Miracidia güçlü phototropic ve çoğunluk (% 80-90) ışık kaynağı ilk hasat döneminde odaklanacaktır. Miracidia kalan 10-20 oranında çatlamaya devam edecek ve daha yavaş yavaş ikinci hasat döneminde birikir. En (> % 95) kültür tanıtıldı ve 26 oC CBSS + orta yönü muhafaza miracidia 24-48 h ekiminin içinde birincil sporocysts için dönüştürülmüş. Şu anda, genellikle larva canlılığı > % 90. CBSS + 4 gün sonra yalnız canlılık önemli ölçüde düşer (% 70-80). Ancak, kültür ortamından Bge orta 24 h aşağıda tamamlamak için CBSS + anahtarlama daha yüksek sağkalım oranları ve daha güçlü büyüme ile ilk CBSS ekimi sonuçlanır. Biz düzenli olarak normoxic koşullar altında kısa vadeli sporocyst kültürleri korumak. Ancak, sporocysts oldukça duyarlı oksijen düzeyleri ve özellikle zararlı oksidatif hasar7indirebilmek Reaktif oksijen türleri vardır. C.J. Bayne4 ve diğer kültürler hipoksik koşullarda tutulan genel sağlık ve canlılık sporocysts vitro önemli ölçüde geliştirildi olduğunu bildirdi. Alçaltılmış oksijen düzeyleri (azot ile) bireysel closeable şişeler gaz veya azot zenginleştirme kuluçka makinesi4gaz aşamasının tarafından alınabilir.
Axenic izole edip paraziti kültür için yukarıda bahsedilen yöntemi olarak miracidia ve sporocysts daha önce tarif edilmistir. Erken miracidial phototropism çekmek ve yüzme larva konsantre için kullanılabilir ve bu izole miracidia hyperosmotic serum fizyolojik Çözümleri (120-160 ecek/Kg arasında)8' hızla immobilize olabilir kabul edildi. Daha fazla bakım tuzlu çözümlerinde birincil sporocysts, ilk intramolluscan larva sahne9,12miracidia dönüştürme sonuçlandı gözlendi. Karmaşık medya da uzun vadeli vitro büyüme ve gelişme hücrelerin yanı sıra S. mansoni sporocyst aşamaları9,13,14,15desteklemek için formüle salyangoz konaktan Biomphalaria glabrata16türetilmiş. Bu formülasyonları çeşitli ticari medya dahil ve amino asit, tuzları, lipitler, azalan bakiyeli ajanlar ve şeker ile birlikte. Komple medya formülasyonları da ısı inaktive fetal sığır veya at serum çeşitli konsantrasyonlarda dahil. Biz o uygun ısı-inactivation (hı) sporocyst hayatta kalma ve uzun vadeli kalkınma vitroiçin çok önemli olduğunu bulduk. Bu kuluçka serum (çözülmüş, 100 mL şişe) için 60 dk 60 oC waterbath içinde buldum, nazik her 10 min Isıtma üniforma için karıştırma ile çok başarılı oldu. Buna ek olarak, genellikle birkaç birçok bir sürü bir serum larva kültür uyumluluk için potansiyel bir tedarikçiden sınayın. Son olarak, ilk (ve şu anda sadece) otantik molluscan hücre satırı, B. glabrata embriyonik (Bge) hücre satırı Hansen16 tarafından kurulması önemli ölçüde kolaylaştırmıştır larva paraziti gelişmeler büyük bir atılım yapıldı. ekimi çabaları. S. mansoni miracidia, ortak kültürün içine birincil ikincil/kız sporocysts17ve sonunda son cercarial aşamada18,19geliştirilen Bge hücrelerle yerleştirildiğinde izole. Böylece, S. mansoni yaşam döngüsü tüm salyangoz aşamasının sürekli vitro ekimi elde etti. Bizim kültür sisteminde kullanılan Bge cep orta sporocyst büyüme/geliştirme ve Bge hücre Bakımı destekler.
Özetle, biz açıklanan ve görsel kitle axenic yalıtım ve S. mansonifree-swimming miracidial aşamasında tarımı için detaylı bir protokolü gösterilmiştir. Ne zaman uygun kültür koşullara tabi bu miracidia art arda gelen birincil ve ikincil sporocyst nesiller ve sonunda cercariae geliştirme yeteneğine sahip. Geliştirme ve sürekli iyileştirme araçları genler ve transgenik, RNA müdahale ve genom gen ifade vitro yönetmek için şu anda kullanılabilir düzenleme (örneğin, CRISPR/Cas9) yaklaşımlar, bu verimli öngörülen yalıtım ve miracidia çeşitli trematode türler20 ekimi yöntemleri daha fazla araştırma bu alanda ilerlemesi için malzeme temin etmek için gerekli olan devam edecektir. Bu yöntem güzel izole edip free-swimming cercariae memeli schistosomula sahne21, vitro dönüştürme için kolaylaştırmak için S. mansoni kültür için daha önce açıklandığı bir iletişim kuralı tamamlar nihai ekimi ovigerous yetişkin için22solucanlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Kısmen NIH grant RO1AI015503 tarafından finanse edilmektedir. Paraziti enfekte fareler, BEI kaynaklar üzerinden dağıtım için NIH NIAID sözleşme HHSN272201000005I NIAID sistozomyas Kaynak Merkezi Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (Rockville, MD) tarafından verilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
