Summary
アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) 表面の局所密度のナノスケール制御を許可、デンドリマーを用いた不均一な nanopatterns を取得するメソッドの記述方法や細胞接着と軟骨分化の研究に適用されます。
Abstract
細胞接着・分化は、大きな影響を持つローカルの濃度と細胞外マトリックス (ECM) コンポーネントのナノスケール処分によって調節されます。アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) の大規模な不均一な nanopatterns を取得する方法の紹介-ローカル RGD のナノスケール制御を許可するデンドリマー表面密度。Nanopatterns、初期濃度の異なる溶液からデンドリマーの表面吸着によって形成される水接触角 (CA)、x 線光電子分光 (XPS)、によって特徴付けられるし、走査プローブ顕微鏡技術など走査型トンネル顕微鏡 (STM)、原子間力顕微鏡 (AFM)。粒子間距離を最小の確率等高線図を用いた原子間力顕微鏡画像を用いた、細胞接着性応答と分化相関、RGD のローカル表面密度を測定します。ここで紹介したナノパターニング方法は大きな表面積を単純な方法でスケール アップすることができます簡単な手順です。それは細胞培養のプロトコルに完全に準拠ではこうして、細胞濃度依存性効果を発揮する他の配位子に適用することができます。
Introduction
ここで我々 はナノスケールで地元密着の制御を許可する細胞培養表面を取得するシンプルで汎用のデンドリマーを用いたナノパターニング手順をについて説明します。1,2,3と細胞接着のナノパターニング接着4に関連する細胞の要件への深い洞察を提供している ECM 組織のナノスケール詳細が報告されています。 5。ミセル リソグラフィ ベース nanopatterns を用いた実験は約 70 のしきい値を明らかに RGD ペプチド nanospacing、この値6,7,8 上が大幅に遅れている細胞接着の nm、9。これらの研究はまた、細胞接着9,10,11グローバル リガンド密度よりも地元の大きな影響を強調しました。
形態形成、時に、細胞周囲の環境との相互作用は、最初の分化のイベントは、最終的な複雑な組織構造が形成されている続行をトリガーします。この枠組みの中でナノパターン表面は形態形成に関する初期の細胞表面の相互作用の影響に取り組むために使用されています。68 の横方向の間隔とリソグラフィ ベース RGD nanopatterns β 型 Ti 40Nb nm 合金 95 150 nm 間の RGD nanospacings 強化の分化中12非コミット幹細胞の未分化の表現型を維持するためにヘルプ間葉系幹細胞の脂肪細胞/骨13,14,15と軟骨の運命16(MSCs)。また、ナノスケール信号合図17の建築規制を提供することによって細胞の接着および分化を指示する信号コンポーネントで変更された自己組織化高分子を示されています。この点で、外側の球18,19,代20の表面に細胞と相互作用する部分を備えたデンドリマーの沈着は細胞接着21,22, の研究に使用されています形態23,24、および移行イベント25,26。それにもかかわらず、これらの研究における表面キャラクタリゼーションの欠如の場合、デンドリマー表面形状と細胞応答間の相関関係を確立することは困難になります。
デンドリマーは、低イオン強度のソリューションから低料金面に吸着するとき、液体のような順序と定義された間隔デンドリマー nanopatterns を取得できます。27このプロパティに基づいてご紹介ローカル RGD 表面密度のナノスケール制御を許可する低料金の表面上の RGD 修飾デンドリマーの大規模な不均一な nanopatterns を取得するメソッド。水接触角 (CA)、x 線光電子分光法 (XPS) と走査型プローブ顕微鏡 (STM および原子間力顕微鏡 nanopatterns) の技術ショー ソリューションの初期デンドリマー濃度の変更をローカルのリガンド密度を調整できます。ローカル RGD 表面密度は粒子間距離を最小の確率コンター マップによる AFM 像から定量化し、細胞実験との相関します。他のナノパターニング技術4と比べると、デンドリマーを用いたナノパターニングは簡単で、大きな表面積、したがって細胞文化アプリケーションと完全に互換性がするスケール アップ。Nanopatterns は、大人の人間の MSCs の29の軟骨誘導細胞接着28ローカル RGD 表面密度の影響を評価する生理活性基板として使用されます。RGD デンドリマーを用いた nanopatterns が細胞の成長を維持し、高いローカル RGD 表面密度によって細胞の接着を補強するが分かった。分化実験では、基板に細胞の中間の接着性は、MSC 凝縮と初期軟骨分化を支持しました。使いやすさ、デンドリマーと周辺グループを変更できます、ためここで説明した方法は、他の ECM リガンド濃度依存性細胞に効果を発揮できるさらに拡張できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 基板の準備
-
1.4 x 1.1 cm au (111) 基板をアニールします。
- ガラス-セラミック ホブの au (111) 基板を置き、アルゴン雰囲気下で冷却する基板の 3 分許可ブタン炎でそれをアニールします。各 au (111) 基板には、この手順を繰り返します。
注: au (111) 基板は、アニール後すぐに使用ください。
- ガラス-セラミック ホブの au (111) 基板を置き、アルゴン雰囲気下で冷却する基板の 3 分許可ブタン炎でそれをアニールします。各 au (111) 基板には、この手順を繰り返します。
-
ポリ (L-乳酸) の作製 (PLLA)-ガラス基板をコーティングします。
- カットし、スライド ガラスを洗います。
- ダイヤモンド チップ カッターで 1.25 cm 1.25 cm x の 18 スライドに顕微鏡のスライドをカットします。上部と下部の側面を後で識別できるように、各スライドの下側に小さなくぼみを作る。
- スライドを 96% のエタノールに続いて脱イオン水で徹底的に洗います。風乾することできます。
- 2% 乳酸溶液を準備します。
- 1, 4-ジオキサン圧力管内の 10 mL にポリ乳酸の 200 mg を追加します。攪拌棒を追加し、チューブをしっかりと閉じます。
- グリセリン風呂 24 h の穏やかな攪拌下 60 ° C でホット プレート上に圧力管を置き、15 mL のバイアルにソリューションを転送します。
- ポリ乳酸の溶液でスライド ガラスをコーティングします。
- スライド ガラスとポリ乳酸溶液でバイアル 60 ° C でクリーン ホット プレート上に配置します。上向きスライドを配置することを確認し、必要な温度に達するまでに少なくとも 10 分間維持できるようにします。
- スピン コーターを準備し、表 1に指定されたプログラムを設定します。
- 真空システムを使用して、スピン コーターに表向きでスライドの 1 つを配置します。パスツール ピペットでポリ乳酸溶液 0.25 mL を表面全体が覆われていることを確かめて、スライドに適用します。コーティング プログラムを実行します。スライドごとにこの手順を繰り返します。
- カットし、スライド ガラスを洗います。
2. デンドリマー ナノパターニング
-
RGD 修飾デンドリマー (RGD-システイン-D1) 28溶液の調製。
- 6.494 mL の脱イオン水にデンドリマーの 5 mg を溶解します。これは、ソリューション a.
注: は、準備から 6 ヶ月以内デンドリマー原液を使用します。 - 10 分の溶液に超音波を照射し、B および C 以下の表 2のソリューションを準備します。
- 超音波 10 分解決 C と D、E および F の次の表 2のソリューションを準備します。
- 使用するまで 4 ° C で B、C、D、E および F のソリューションを保存します。溶液は、後で使用するための-20 ° C で保存できます。
- 6.494 mL の脱イオン水にデンドリマーの 5 mg を溶解します。これは、ソリューション a.
-
基板上に RGD Cys D1 デンドリマーのナノパターニング
- ティッシュ文化フードの基板を 13 分間紫外線を照射して滅菌します。
注: この手順のみ必要ですナノパターン基板が細胞培養基板として使用されることになります。この場合、次の手順のため無菌状態 (ティッシュ文化フード、滅菌材料、ソリューション ・技術) を維持します。 - ピンセットで慎重に処理するが、プレートの井戸の中をそれぞれの基板面を配置します。
- ソリューション B、C、D、E および F 10 分の超音波照射します。
- RGD Cys D1 デンドリマー ソリューションを基板 (2 mL/も) を含む井戸に直接注射器を使用して 0.22 μ m 径のフィルターを通過します。デンドリマー濃度あたりの少なくとも 3 つのレプリカをお勧めします。閉じるし、プレート シール 16 時間 (RT) 室温でそれを残します。
- 削除し、ソリューションを破棄します。基板乾燥と滅菌の脱イオン水を洗ってください。4 ° C で基板を格納します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
- ティッシュ文化フードの基板を 13 分間紫外線を照射して滅菌します。
3. コントロール基板の準備
注: 滅菌のティッシュ文化フードと滅菌材料のみのソリューションですべての手順を行ったし、技術が使用されました。少なくとも、6 は使用される (肯定的な制御の 3 つのレプリカ) と負の制御の 3 つのレプリカ基板を制御します。
- ティッシュ文化フードの基板を 13 分間紫外線を照射して滅菌します。
-
線維芽細胞の付着実験用制御基板。
- 負の制御として炎焼鈍 au (111) 基板を使用します。ゴールド28抗細胞接着特性をよく知られている蛋白質変性効果があります。すべてのソリューションを超音波し、基板の孵化前にフィルターします。
- 肯定的なコントロールの RGD 修飾 PEG チオール、Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene リコール モノラル-11-mercaptoundecanamide (RGD-ペグ-SH)30とトリエチレング リコール溶液で炎焼鈍 au (111) 基板を浸すモノラル-11-mercaptoundecyl エーテル (ペグ-SH) 96% エタノール室温 16 時間で 1: 100 のモル比で
- エタノールで基板を徹底的に洗浄し、アルゴンで乾かします。4 ° C で基板を格納します。
-
軟骨分化の制御基板です。
- 負の制御として原始的なポリ乳酸基板を使用します。任意の表面処理なしポリ乳酸は細胞と貧しい人々 のインタ フェースを示しています。31
- ポジティブ コントロール用リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.1 mg/mL フィブロネクチンの 5 mL を準備し、室温 1 時間フィブロネクチン溶液 1.6 mL 各ポリ乳酸基板を孵化させなさい
- 削除しフィブロネクチン液を捨て、PBS で基板を洗浄します。4 ° C で基板を格納します。
4. 表面キャラクタリゼーション
-
原子間力顕微鏡イメージング
- 粗さ解析のポリ乳酸基板上の AFM イメージングを実行します。デンドリマーは直径 4-5 nm、1 の粗さの値を持っているので 28awd-4 の適切な可視化の nm を取得する必要があります。また、28awd-4 の AFM イメージングを実行します。両方のケースでタッピング空気モード原子間力顕微鏡を実行します。
- シリコン片を選択ばね定数 k = 40 N/m および共振周波数 ν = 300 kHz と AFM 装置にマウントします。
- 原子間力顕微鏡のステージ上には、サンプルをマウントします。装置のセットアップによってチューニングとイメージングの仕様が異なる場合があります。製造元のハンドブックを参照してください。
- 顕微鏡の先端とサンプルの連絡先までアプローチします。
- 粗さ解析のためポリ乳酸の画像、3 つの独立した基板から基板ごと 20 x 20 μ m の少なくとも 4 つの代表的なエリアを選択します。画像のデンドリマー nanopatterns、1 つの条件 (初期デンドリマー濃度) 3 つの独立した基板から 5 × 5 μ m の基板あたりの少なくとも 3 つの代表的な画像を選択します。イメージング中にデンドリマー層を損傷しないように、最低限の力を保つためにセット ポイントを調整します。
注: イメージの領域の選択は、また圧電スキャナーの動作範囲に依存します。この点では、機器のマニュアルを参照してください。 - 原子間力顕微鏡高さ画像あてはめによるプロセス各多項式 AFM 装置の製造元の独自のソフトウェアを使用して機能を平準化するラインをスキャンし、表面粗さを計算するポリ乳酸からのそれらを分析します。根意味正方形 (RMS) 解析は、適切なオプションを提供可能性があります。
-
ローカル RGD 表面密度測定。
- 表面にデンドリマーを選択する処理した AFM 高さ画像のイメージのしきい値を取得します。
- 画像処理ソフトを使用してパーティクルの位置を決定し、最小の粒子間距離 (d分) を取得するそれらを使用します。
- D分確率コンター マップを取得する対応するパーティクルの位置にz d最小値をプロットします。最高のローカル RGD 表面密度 (d分< 70 nm) の領域を視覚化するプロットのカラー スケールを調整します。
- 最も高いローカル RGD 表面密度の画像処理ソフトを使用しての地域を定量化します。デンドリマー集計の領域を計算に含めます。
-
STM イメージング。
注: STM イメージングは、導電性 au (111) 基板上への nanopatterns に対してのみ実行できます。測定は、空中で行われます。- STM 装置の試料ホルダーにナノパターン基板を配置します。テスター サンプルとホルダー間の電気接続を確認します。
- 選択したプローブ材料 (すなわちヒントをエッチングします。Pt 0.8: Ir 0.2) STM 装置の頭の上の適切なフィットを保証する直径を持つ。手動切断または電気化学エッチング、エッチングを実行できます。32
注: 電気化学的エッチングは対称のヒントを表示します。 - STM 装置のヘッドの先端をマウントし、サンプルを接続します。
- 「現在の」フィードバック チャネルを設定 (このタイプの測定、現在はフィードバックをチューニングして一定になる)。バイアス電圧と現在のセット ポイントと先端のエンゲージも解決イメージを取得するスキャン サイズを調整します。
注: イメージの領域の選択は、また圧電スキャナーの動作範囲に依存します。この点では、機器のマニュアルを参照してください。 - STM 装置の製造元の独自のソフトウェアを用いた関数の多項式を平準化するには、各スキャン ラインのあてはめによる STM 地形画像処理。
-
CA の測定。
- 1 つの光学系で CA 条件 (初期デンドリマー濃度) 3 つの独立した基板の 3 つの異なる位置に静滴法によるナノパターン基板上メジャー CA。
- 脱イオン水で、変らずを入力し、1 μ L の滴を生成する CA ソフトウェアのパラメーターを設定します。
- サンプルをステージに配置して、試料の表面には、イメージング用のコンピューターに明確に表示されるようにします。
- 表面に近いを取得するまでマニピュレーターに注射器を移動し、表面上にドロップを分配します。液滴の安定化後すぐに画像を記録します。
注: CA 測定でそれは非常に再現性のある結果を達成するために湿度を制御することが重要です。 - CA 装置の製造元の独自のソフトウェアで測定した Ca を分析します。フィッティング法は、ユーザーの要件に調整できます。楕円のフィッティング法は、オプションをすることができます。
5. 細胞培養
注: すべての手順をティッシュ文化フードと滅菌材料のみのソリューションで実行したし、技術が使用されました。
-
線維芽細胞の付着実験。
- 高グルコース 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した NIH 3T3 マウス胚性線維芽細胞から 37 ° C、4.6% CO2な雰囲気、基礎培地で初期の通路 (< 10) 文化 1 %l-グルタミン、1% 1% とペニシリン-ストレプトマイシン ピルビン酸ナトリウム(成長中)。500,000 細胞成長培地 10 mL のフラスコあたりの総シードに T75 フラスコをお勧めします。
- 2 日ごと 10 mL のピペットで古いメディアを削除し、作りたての成長培地 10 mL に置き換えます。
- 細胞成長培地までは 80% の合流点、それから媒体の周りに到達し、トリプシン フラスコあたり 5 mL を加えます。確実に、フラスコの底から適切な細胞の剥離を 37 ° C で 5 分間細胞と接触してトリプシン溶液を維持します。
- フラスコあたり成長培地 5 mL を追加し、遠心管の細胞を収集します。470 x gで 5 分間削除で細胞培養上清を遠心し、成長培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します。診断を用いた細胞の濃度を決定します。
- よく扱わない組織培養 (非付着性) の板に基板を転送します。
- 培地に 4,000 細胞/cm2の密度で基板上に細胞を播くし、37 ° C および 10% の CO2の大気で 4.5 時間それらを孵化させなさい。
-
MSCs の軟骨誘導。
- 初期の通路から人間の MSCs の文化 (< 5) MSC 成長培地で 37 ° C で 4.6% の CO2雰囲気で。500,000 細胞成長培地 10 mL のフラスコあたりの総シードに T75 フラスコをお勧めします。
- (前述の 5.1.2) 中 3 日ごとに変更します。
- セルを trypsinize 前に 80% の合流点に達すると、遠心分離機し、(前述の 5.1.3) MSC 成長培地でそれらを再懸濁します。診断を用いた細胞の濃度を決定します。
- もう一度セルを遠心し、軟骨分化誘導培地 10 mL でそれらを再懸濁します。
- 組織培養 (非付着性) のために扱われていない新しいウェル プレートにプレートから基板を転送します。3,000 セル/cm2の密度で基板上に細胞を播きます。
- (前述の 5.1.2) 軟骨中 3 日ごとに変更します。
6. 細胞の固定と染色
注: 次の手順は、非滅菌状態で実行できます。
- メディアを取り出し、PBS でやさしく洗浄します。室温に 20 分間 10% ホルマリン溶液を追加することによってそれらを修正します。
- ホルマリンを削除し、PBS のセルを洗浄します。
- PBS で塩化アンモニウム (NH4Cl) の 50 ミリメートルのソリューションを追加することによって無料のアルデヒド グループをブロックします。ルート削除 NH4Cl ソリューションで 20 分のセルを残し、PBS のセルを洗浄します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルを PBS で 4 ° C で保存します。 - PBS を削除および PBS のセルした洗浄で 10 分ブロッキング液 (PBS で 1% アルブミン) にサポニンの 0.1% 溶液を追加してセルを permeabilize し、サンプルを新しいウェル プレートに転送します。
- 室温 1 時間ブロッキング液 (表 3) の一次抗体の溶液で細胞をインキュベートします。一次抗体のソリューションを削除し、PBS のセルを洗浄します。
- 室温 1 時間ブロッキング液 (表 3) の二次抗体と細胞をインキュベートします。
注: は、光を避けるための露出。 - 二次抗体溶液を取り外して洗浄セル PBS で乾燥します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。暗闇の中で 4 ° C で PBS でサンプルを格納します。 - 顕微鏡観察のためのサンプル実装: ダイヤモンド チップ カッターを使用して、サンプルに媒体をマウント顕微鏡 1.25 cm x 1.25 cm。 適用 50 μ l に coverslips をカットし、カット coverslips とそれらを優しくカバーします。
- サンプルを便利な受信者に転送、観測までアルミ箔と 4 ° C で暗闇の中の店でそれをカバーします。
7. 細胞イメージングとデータ分析
注: 不透明な au (111) および厚い microslide ベース基板、正立型顕微鏡を使用する必要があります。
-
線維芽細胞の付着実験。
- 落射蛍光顕微鏡の使用は、デジタル カメラと低 (すなわち 10 X) (すなわち 40 倍) の高倍率と目標を装備しました。空気の測定を実行します。
- 紫外励起、ヘキスト/DAPI 染色を視覚化する longpass 排出フィルターを使用して対物レンズ 10 倍のステージおよびイメージの細胞核にサンプルを配置します。
- イメージ セルの細胞骨格と焦点接着斑 (FAs) 40 × 対物、対応する抗体螢光色素仕様に一致する顕微鏡フィルターを選択します。
- FA の定量化、8 ビットのファイルに画像を変換するのに画像処理ソフトを使用します。しきい値を設定することによってバイナリに背景と変換画像を削除します。少なくとも 30 枚サンプルを計算し、計算の 1 μ m2から FAs をご検討ください。
-
MSCs の軟骨誘導。
- デジタル カメラと低い (すなわち10 X) を搭載した垂直落射蛍光顕微鏡と軟骨誘導 (< 5 日) の初期の段階で細胞の凝縮のイメージの倍率の目的。紫外線励起と longpass 排出フィルターを使用して、ヘキスト/DAPI 染色を視覚化します。
- 凝縮体の面積を測定するには、画像処理ソフトウェアを使用して、8 ビットのファイルに画像を変換、背景を削除する、集計の輪郭を強調するしきい値を選択します。粒子の面積を計算します。
- Fa、細胞骨格アクチン繊維と高倍率 (すなわち 40-60 X) で直立した共焦点顕微鏡を用いた軟骨コラーゲン タイプ II α 1 (COL2A1) の画像 immunostained のサンプル。代表的な間隔 (すなわち0.5-1 μ m) でセクションを収集します。
- スタックを処理するには、画像処理ソフトを使用します。8 ビットのファイルに画像を変換、背景を削除、しきい値を設定することによってバイナリようにします。1 つの 3 つの独立したサンプルの条件の 3 つのセル凝縮体の最小値を扱います。
- 染色細胞凝縮体の基底部からエリア FA 蛋白質を定量化し、エリアの画像からの細胞核数で割った値の対応するパーセンテージとして表現します。
- COL2A1 染色を測定するには、共焦点 z プロジェクションを使用して投影面積 (最大 COL2A1 サンプル面積) の合計を定量化します。対応する凝縮部に対して得られた面積の値を正規化します。
8. 逆写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 定量分析
注: RNase の混入を防ぐためには、プラスチックの食器を使い捨て、滅菌を使用し、使い捨て手袋を着用して、試薬と RNA を処理します。常に適切な微生物学的無菌技術を使用して、作業面と遠心分離機やピペットなどの非使い捨てアイテムから RNase の混入を削除する適切な汚染除去ソリューションを使用します。
- 総 RNA を隔離し、RNA の撹乱物質でそれを粉砕します。DNase の RNA サンプルを扱うし、cDNA、cDNA 合成キットを使用してに変換します。
- QRT PCR を行う転写因子SOX9のプライマーを使用します。Β 2-ミクログロブリン (B2M) とリボソームタンパク質 l 13 a (RPL13a) は、ハウスキーピング遺伝子として使用することができます。
- 発現レベルを計算、ネガティブ コントロール (PLLA) に対して正規化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
表面粘着性ナノスケール (図 1) で対処することができるナノパターニング法を提案します。RGD Cys D1 の化学構造を図 1 aに示します。デンドリマー表面高分解能 STM 特性の電気導電性 au (111) 表面に見られます。ソリューション (最大 10-5%w /w) 低デンドリマー濃度は、高濃度 (図 1) で形成された高いパック デンドリマー集計中 (図 1 b) 直径 4-5 nm の孤立したデンドリマーをレンダリングされます。Afm による表面評価 (図 1 D G上段) では、ソリューションの初期デンドリマー濃度の関数として RGD Cys D1 デンドリマーの表面分布を調整できることを明らかにしました。D分確率等高線図、表面 (図 1 の D ・ G・下段) に異なるローカル RGD ナノスケール密度でこの結果します。
細胞培養実験、約 10 の細胞膜受容体インテグリンの nm 径のデンドリマー周辺の RGD 配列を認識しました。1 つだけデンドリマーのサイズ (4-5 nm; STM による測定のためのインテグリンあたり交流デンドリマーあたり提供されたこのシーケンスの 8 個のコピーが図 1 b)。つまり、各デンドリマー単一サイト インテグリン結合のそれにより (AFM 画像に見られる)、デンドリマー分布から直接的な相関関係を許可して提供 RGD ディストリビューションの細胞粘着のためご利用。さらに、大きな変化が見つかりませんでした細胞接着29に影響を与える可能性があります異なるナノパターン構成 CA 値で。これらの特性は、デンドリマー nanopatterns 生体適合性表面、基板を調節する、細胞の挙動を研究します。
ナノパターン au (111) に細胞接着は、ナノパターン ポリ乳酸 (図 2 b) に線維芽細胞培養 (図 2 a) の最初の 24 時間以内と MSCs をテストされました。両方のケースでエリアのパーセンテージが染色 FA タンパク質 paxillin (pax) デンドリマーの濃度を段階的に増加のためローカル RGD 表面密度 ( d分70 nm のしきい値を下回ると、ナノパターン領域の割合効率的な細胞接着。表 4)。10-2%濃度が初期デンドリマー/wとポジティブ コントロール、エリアのパーセンテージ染色細胞減少あたりの人数、ナノパターンd分< 70 nm 領域の割合との相関が失われました。
D分が占める面積の割合 < 70 nm (図 1G下段および表 4) はローカル 10-5% /w初期デンドリマーまで nanopatterns の RGD 表面密度の目安濃度ではなく 10-2%w /w、デンドリマー凝集によるまでのそれらの。集計は、70 nm のしきい値 (図 1下段および表 4) 下d最小値と表面の小さな割合だけでの配位子の分布の面で非常に異種のサンプルを制作しました。XPS の結果を示した 10-5%w /wに匹敵するグローバル RGD 密度をこれらの表面に提示-nanopatterns28を派生しました。この観測は、デンドリマー集計を含んでいる領域の最大の RGD 密度が達成されたことd分によって占有された表面積の割合を示します < 70 nm はローカルの RGD 表面密度の代表ではないです。このケースでは。
ポジティブ コントロール (均一コーティング) 最大ローカル RGD 表面密度が細胞接着における予想される増加を示さなかった観測は、立体障害効果に帰することができます。これらの結果を示すが、細胞培養でよく使用される対応する均質な表面と比較して、RGD nanopatterns 維持細胞接着をより効率的に。この発見は、こうしてローカル リガンド密度との関連性を強調表示します。
形態形成における周囲の環境との相互作用は最初の細胞分化イベントをトリガーし、最終的な複雑な組織構造の確立までそれらを伝達します。Nanopatterns デンドリマーの細胞接着・分化に及ぼす影響を評価するには、モデルとして MSCs の軟骨細胞誘導を使用しました。軟骨、中にあるアクティブ マトリックスを改造、軟骨形成のさまざまな段階を経て細胞を監督に有益な役割を果たしています。
MSCs は、軟骨分化 28awd-4 (図 3) を施行した.軟骨分化細胞形態33高密度凝縮体の細胞間コミュニケーションと併用変更設立を形成する細胞の動員を含む細胞凝縮のステップから始まります。すべての基板とその凝縮体で発生した細胞の凝縮図 3Aショー増加デンドリマー濃度を上げると地区デンドリマーの凝縮エリアがその後再び減少した 10-8%w /w x 2.5 まで濃度 10-2%w /wと肯定的な制御のため。軟骨細胞凝縮段階には、細胞増殖の34の増加ではなくアクティブな細胞運動を通じてが行われます。この細胞の運動は基板とフレキシブル接着で愛用されて: 安定した癒着を細胞体に移動する牽引力を許可するように形成されるべきですし、同時にこれらの癒着は中に基板からセル発売を許可する十分な弱いする必要があります運動。2.5 x 10-8%w /wまでローカル RGD 表面密度で増加が支持する細胞凝縮-細胞接着と細胞運動とバランスの良い、nanopatterns を派生しました。10-2および肯定的な制御、ローカル RDG 表面密度が高すぎる、凝縮イベント損なうこと。
軟骨細胞分化による収入 prechondrogenic 凝縮: 凝縮体における細胞より丸くなり、軟骨の特定のマーカーの合成を開始する ECM タンパク質 COL2A1 と転写因子 SOX933,34,35です。 したがって、セル凝縮の形成を支持、中間接着性基板を示した高い COL2A1 染色 (図 3 b) とSOX9 mRNA の発現 (図 3) の高いレベル。
我々 の結果は、軟骨細胞分化の初期の段階で細胞間マトリックスの相互作用の影響を強調表示します。このような相互作用は、デンドリマーを用いた nanopatterns により簡単に対処できます。
| ステップ | 時間 (秒) | 速度 (rpm) | 加速度 (回転/秒) |
| 1 | 5 | 500 | 300 |
| 2 | 30 | 3,000 | 1,500 |
表 1: スピナー プログラム手順に調製したポリ乳酸溶液をスライド ガラスに塗るに使用します。均質化の第一歩は、5 の 300 rpm/s の加速度を 500 rpm で使用された 3,000 rpm 30 1,500 rpm/s の加速度の最後のステップが続く s. s.
| ソリューション | RGD-システイン-D1 (mg/mL) | RGD-システイン-D1 (mg) | MQ 水 (μ L) |
| A | 0.77 | 5 | 6,494 |
| RGD-システイン-D1 (w/w %) | ソリューション (μ L) | ||
| B | 10-2 | 779 | 5,220 |
| C | 10-5 | 0.78 | 6,000 |
| ソリューション C (μ L) | |||
| D | 2, 5 x 10-8 | 15.0 | 5,985 |
| E | 10-8 | 6.0 | 5,994 |
| F | 4 x 10-9 | 2.4 | 5,998 |
表 2:使用 RGD Cys D1 溶液の調製の詳細。RGD Cys D1 デンドリマーの原液は、そこから B や C のソリューション 10-2 10-5% /w濃度で調製 0.77 mg/mL (溶液) の最終的な集中で準備されました。溶液 C 10-5% /w RGD Cys D1 デンドリマーはそれぞれ 10-810-8と 4 x 10-9%/w、x 2.5 の最終濃度で D、E および F のソリューションを準備していました。
| 名 | (Μ l) | ブロック バッファー (mL) | |
| 主なミックス | Pax のウサギ mAb | 65 | 12.870 |
| COL2A1 にマウスのモノクローナル抗体 | 32.5 | ||
| セカンダリ ミックス | Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス | 13 | 12.961 |
| Alexa Fluor 568 ヤギ抗うさぎ | 13 | ||
| ヘキスト ・ ソリューション | 13 |
テーブル 3: 抗体溶液製剤。Pax ウサギの生産に対する一次抗体混合物に含まれるモノクローナル抗体希釈 1: 200 ではブロッキング液で希釈したマウスを 1: 400 で生産された COL2A1 に対するモノクローナル抗体ブロッキング液。二次抗体の混合物に含まれる細胞核染色ヘキストと二次抗体はマウスやウサギに対してヤギでそれぞれ生産 (Alexa Fluor 488 と 568 fluorophores が付いて、それぞれラベル)。
図 1: ローカル RGD 表面密度のナノスケール制御の RGD Cys D1 デンドリマー ナノパターニング。(A) RGD Cys D1 デンドリマー構造細胞接着 RGD ペプチドの最大 8 つのコピーを格納します。代表 STM 像 (バイアス = 200 mV、セット ポイント = 0.5 nA) 10-8%w /wの初期水溶液から au (111) 上の RGD Cys D1 nanopatterns の (スケールバー = 3 nm、 B)、破線で得られる対応する高さ距離分布と(B)および(C) 10-2%w /wデンドリマーの集計を示すに示されている地域 (スケールバー = 20 nm)。(D G)それぞれ 10 の-2%、2.5 x 10-8%、10-8%、4 x 10-9%w /wの対応するデンドリマー水溶液から得られるポリ乳酸の RGD Cys D1 nanopatterns の代表 AFM 画像 (スケールバー = 1 μ m)。対応する粒子間の最小距離 (d分) 確率の等高線地図を以下に示します各 AFM 像高密度濃い赤で示した RGD 領域 (d分< 70 nm)。デンドリマーとデンドリマーの凝集体は、わかりやすいように黒で描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: セルの RGD Cys D1 28awd-4 接着します。初期デンドリマー濃度基板 (左軸) と接触してセルのセルごとの FA 蛋白質 pax 染色領域の割合をプロットします。値ローカル RGD 表面密度 ( d最小値 70 nm のしきい値を含む 28awd-4 の表面積の割合) と比較されます (右軸) 陽性 (+ コントロール) に割り当てられている割合が 100 と 0 と負 (-それぞれ、コントロール) を制御します。文化の 4.5 時間後 au (111) 上のデンドリマー nanopatterns の(A)線維芽細胞の付着。(B) MSC 付着軟骨細胞誘導の 1 日目に評価されるポリ乳酸のデンドリマー nanopatterns。値は、標準偏差を平均値で指定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| RGD-システイン-D1 (w/w %) | エリア (< d分= 70 nm) (%) au (111) 上 | エリア (< d分= 70 nm) (%) にポリ乳酸 |
| 10-2 | 5 ± 1 | 2 ± 2 |
| 10-5 | 97 ± 2 | |
| 2、10-8 x 5 | 65 ± 11 | 90 ± 2 |
| 10-8 | 25 ± 16 | 45 ± 7 |
| 4 x 10-9 | 18 ± 11 |
表 4: 領域の割合d分値 70 以下 RGD Cys D1 デンドリマー蒸着 au (111) とポリ乳酸表面使用初期デンドリマー濃度の関数としての nm が得られた。
図 3: RGD Cys D1 28awd-4 MSCs の軟骨分化。(A)軟骨細胞誘導の 5 日後ポリ乳酸の RGD Cys D1 nanopatterns で培養した MSCs の凝縮。代表落射蛍光染色細胞核 (ヘキスト; の画像スケールバー = 300 μ m。上段) と異なる初期デンドリマー濃度から RGD Cys D1 nanopatterns で得られる細胞凝縮 (下段) の領域のプロット。特定軟骨細胞マーカーの発現と細胞凝縮手順から分化の進行: COL2A1 は対応する共焦点 z 突起から細胞の凝縮部で正規化された染色の領域の(B)割合軟骨細胞誘導の 5 日後に得られます。(C)相対SOX9発現 (マイナス コントロール) に対して軟骨細胞誘導の 3 日後。値は、 (B)および(C)の標準偏差を平均値で指定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
記述されていたプロトコルの開発、中にいくつかの重要な手順を検討してください。最初は、走査プローブ顕微鏡技術によるナノパターン特性を指します。28awd-4 を視覚化するパターンが生成される表面は、周辺にあるデンドリマーの直径以下の粗さの値を持つ必要があります 4-5 nm STM (図 1 b) によって測定されます。また、それは高分解能 STM イメージングの導電性基板、この場合は au (111) に制限されたアカウントに取られるべきです。スピン コーティング後、スライドのコーナーから高分子の解除は、生体適合性の接着剤を使用すれば修正できます。
デンドリマー ナノパターニングです達成するために使用するプロセス制御ナノスケールでローカル細胞接着。に基づいて、自己吸着による表面デンドリマー、このテクニックを必要としない任意の複雑なナノパターニング装置、リソグラフィ手法36,37,このように以前と対照的な説明38. デンドリマー ナノパターニング大きな表面積へのスケール アップ ・細胞培養のプロトコルに対応しています。
ここで説明したデンドリマー ナノパターニング方法は再生医療の将来のアプリケーションを検索できます。細胞接着のデンドリマー ナノパターニングによって加えられるコントロールはこの手法を最適の注入、これにより宿主組織への統合を促進する前に生体材料の調になります。また、どのデンドリマーと周辺部分を変更ことができます使いやすさはデンドリマー ナノパターニングを細胞に濃度依存性活性を発揮する他の配位子の適切ななります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、 d分定量化にオリオール フォント-バッハ、アルバート G. Castaño を認めます。彼らはまた生物医学著者が社内で映像を記録させる (IRB バルセロナ) で研究所の高度なデジタル顕微鏡ユニットを認めます。この作業によって、ネットワーク医学研究センター CIBER ()、スペインに対応しました。CIBER はイニシアチブによって資金を供給 VI 国家 R & D & 私プラン 2008年-2011 Iniciativa Ingenio 2010 Consolider プログラム、CIBER アクション、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、欧州地域開発基金の支援です。この仕事は、大学や研究部門の革新、大学、ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャの企業のための委員会によってサポートされている (2014 SGR 1442)。それはまたプロジェクト OLIGOCODES (号によって資金を供給されました。MAT2012-38573-C02) と CTQ2013-41339-P、INTERREG V-A スペイン ポルトガル 2014 年 2020 年 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) にスペイン経済省、競争力、さらに授与します。C.R.P. は、スペイン経済省と競争力のグラント号からの財政支援を認めています。IFI15/00151)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 - dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
