Summary
Метод для получения на основе дендример неравномерным nanopatterns, что разрешение контроль наноразмерных местных аргинин глицин аспарагиновой кислоты (РГД) поверхностной плотности определяется и применяется для изучения адгезии и хондрогенном дифференцировки клеток.
Abstract
Клеточной адгезии и дифференциация обусловлена распоряжения наноразмерных компонентов внеклеточного матрикса (ECM), с местными концентрации, имеющих существенное влияние. Здесь мы представляем метод для получения широкомасштабных неровный nanopatterns аргинин глицин аспарагиновой кислоты (РГД)-функционализированных Дендримеры, позволяющие наноразмерных контроля местных РСЗ поверхностную плотность. Nanopatterns образуются на поверхности адсорбции дендримеров из растворов в различных начальных концентраций и характеризуются угол контакта воды (CA), Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS), и сканирование зонд микроскопии методы такие, как Сканирующий туннельный микроскопии (СТМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Местные поверхностная плотность РСЗ измеряется с помощью АСМ изображения с помощью вероятности контурные карты минимальный interparticle расстояний и затем коррелирует с ответ адгезии клеток и дифференциации. Метод nanopatterning, представленные здесь является простая процедура, которую можно вычислить по маштабу простым способом для больших поверхностей. Он таким образом полностью совместим с протоколы культуры клетки и может быть применен к другим лиганды, которые оказывают воздействие зависит от концентрации на клетки.
Introduction
Здесь мы опишем простой и универсальный nanopatterning на основе дендример процедура получения поверхности культуры клеток, которые позволяют контролировать местные клейкости на наноуровне. Были зарегистрированы наноразмерных детали организации ECM,1,2,3 и nanopatterning клеток сцепления поверхностей оказывает глубокое понимание в клеточных требования, относящиеся к адгезии4, 5. Эксперименты с использованием мицеллярной среде на основе литография nanopatterns показали пороговое значение около 70 Нм для РСЗ пептидные nanospacing, клеточной адгезии значительно задерживается выше это значение6,,78 ,9. Эти исследования также подчеркнул большее влияние местных чем глобальные лигандом плотность клеток адгезии9,10,11.
В ходе морфогенеза взаимодействие клетки с окружающей средой триггер первая дифференциация события, которые продолжают до тех пор, пока окончательный комплекс тканевых структур были созданы. В рамках этого nanopatterned поверхности были использованы для решения влияние первоначального взаимодействия клетк поверхности на морфогенеза. На основе литография RGD nanopatterns с боковой интервал 68 Нм в β-тип Ti-40Nb сплавов помогают поддерживать недифференцированные фенотип12-совершенные стволовых клеток, в то время как RGD nanospacings от от 95 до 150 Нм повысить дифференциация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) к адипогенном/Остеогенные13,,1415 и хондрогенном судьбы16. Кроме того, самостоятельной сборки макромолекул, модифицированные с сигнальных компонентов показали направлять клеточной адгезии и дифференциации, предоставляя наноразмерных архитектурных регулирование сигнализации сигналы17. В этой связи осаждение дендримеров с взаимодействующих клеток постановление в их внешней сферы19,18,20 на поверхности был использован для изучения клеток адгезии21,22, Морфология23,24и миграции события25,26. Тем не менее отсутствие поверхностных характеристик в этих исследованиях делает его сложно установить корреляции между дендример поверхности конфигурации и клеточный ответ.
Катионные nanopatterns с жидкостью как порядка и определенных интервалов могут быть получены, когда дендримеров абсорбируются малонаполненных поверхностей из растворов с низкой ионной силы. 27 на основании этого свойства, здесь мы представляем метод для получения широкомасштабных неровный nanopatterns РГД функционализированных дендримеров на малонаполненных поверхностях, которые позволяют наноразмерных контроля местных РСЗ поверхностной плотности. Углом контакта воды (CA), Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) и сканирование зонд микроскопии методов (СТМ и AFM nanopatterns) показывают что местные лигандом плотности можно отрегулировать изменения первоначального дендример концентрации в растворе. Местные РСЗ поверхностная плотность количественно от АСМ изображения на вероятность контурные карты минимальный interparticle расстояний и затем коррелирует с клеток экспериментов. По сравнению с другими nanopatterning методами4, на основе дендример nanopatterning прост и может быть легко масштабируются для большой площади поверхности, таким образом, полностью совместима с приложениями культуры клеток. Nanopatterns используются в качестве биологически субстратов для оценки эффекта местных РСЗ поверхностной плотности на ячейку адгезии28 и хондрогенном индукции взрослого человека MSCs29. Наши результаты показывают, что РГД на основе дендример nanopatterns поддерживать рост клеток и клеточной адгезии подкрепляется высокой местной РСЗ поверхностной плотностью. В экспериментах дифференциации промежуточные адгезии клеток к субстратам благоприятствования MSC конденсации и раннего хондрогенном дифференцировки. Из-за легкости, с которой дендример периферийных групп могут быть изменены метод, описанный здесь может быть продлен с другими ECM лиганды, которые оказывают воздействие зависит от концентрации на клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка основания
-
Отжиг 1,4 х 1,1 см Au(111) на подложки слюды.
- Место Au(111) субстрата на стеклокерамической плитой и отжига его с Бутан пламени на 3 мин разрешить субстрат для охлаждения в атмосфере аргона. Повторите этот шаг для каждого Au(111) субстрата.
Примечание: Au(111) субстратов должны использоваться сразу же после отжига.
- Место Au(111) субстрата на стеклокерамической плитой и отжига его с Бутан пламени на 3 мин разрешить субстрат для охлаждения в атмосфере аргона. Повторите этот шаг для каждого Au(111) субстрата.
-
Подготовка поли (L-молочная кислота) (PLLA)-покрытием стеклянные подложки.
- Вырезать и мытья стеклянных скольжениях.
- Вырежьте микроскопии слайды в 18 слайды 1,25 х 1,25 см с резец Алмазный наконечник. Сделайте небольшой отступ на нижней стороне каждого слайда, чтобы верхняя и нижняя стороны можно выделить позднее.
- Слайды тщательно промойте деионизованной водой следуют Этанол 96%. Позвольте им высохнуть.
- Подготовьте 2% раствор PLLA.
- Добавьте 200 мг PLLA 10 мл 1,4-диоксана в трубе давления. Добавьте строку перемешать и плотно закрыть трубку.
- Место труб давление в глицерин ванну на горячей плите при 60 ° C под нежное перемешивании за 24 часа и затем передать решение стекла 15-мл флаконе.
- Покрытие стекла слайды с PLLA раствором.
- Место стекла слайды и флакон с раствором PLLA на чистой горячей плите при температуре 60 ° C. Убедитесь в том поместить слайды вверх и позволяют им оставаться по крайней мере 10 минут до достижения необходимой температуры.
- Подготовить coater спин и установить программы, указанные в таблице 1.
- Разместите один из слайдов лицом вверх на спин coater, с помощью вакуумной системы. С пипетка Пастера применяются 0,25 мл PLLA раствора к слайду, убедившись, что вся поверхность покрыта. Запустите программу покрытия. Повторите этот шаг для каждого слайда.
- Вырезать и мытья стеклянных скольжениях.
2. дендример Nanopatterning
-
Подготовка решений 28 РГД функционализированных катионные (РГД КМС D1).
- Растворяют 5 мг дендример 6.494 мл деионизованной воды. Это решение а.
Примечание: Используйте дендример Стоковый раствор в течение 6 месяцев подготовки. - Sonicate решение A для 10 мин и подготовки решений, B и C после таблицы 2.
- Sonicate решение C 10 мин и подготовить решения D, E и F после таблицы 2.
- Хранить решения B, C, D, E и F на 4 ° C до использования. Решение A может храниться при температуре-20 ° C для последующего использования.
- Растворяют 5 мг дендример 6.494 мл деионизованной воды. Это решение а.
-
Nanopatterning дендримеров РГД КМС D1 на подложках
- В культуре ткани капюшоном стерилизация субстрата облучения их с УФ-излучения для 13 мин.
Примечание: Этот шаг необходим, только когда nanopatterned субстратов будет использоваться в качестве субстратов культуры клеток. В этом случае поддерживать стерильные условия (Культура ткани капот, стерильных материалов, решения и методы) для следующих шагов. - Место каждого субстрата лицом вверх в скважинах тарелку, тщательно их обработки с помощью пинцета.
- Sonicate решения B, C, D, E и F на 10 мин.
- Передайте решения дендример РГД-КМС-D1 через фильтр диаметр 0,22 мкм, с помощью шприца непосредственно в скважинах, содержащие субстратов (2 мл/хорошо). Рекомендуется по меньшей мере три реплики на катионные концентрации. Закройте и уплотнение пластину и оставить его при комнатной температуре (RT) для 16 h.
- Снимите и выбросьте решения. Вымойте субстратов с стерильных деионизированной водой и сухой. Хранить подложках при 4 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
- В культуре ткани капюшоном стерилизация субстрата облучения их с УФ-излучения для 13 мин.
3. Подготовка поверхности управления
Примечание: Все шаги были выполнены в стерильных культуры ткани капот и только стерильные материалы, решения и методы были использованы. По крайней мере шесть управления субстратов используется (три реплики позитивных элемента управления) и три реплики отрицательного контроля.
- В культуре ткани капюшоном стерилизация субстрата облучения их с УФ-излучения для 13 мин.
-
Управление субстраты для фибробластов адгезии эксперимент.
- Используйте пламени отожженная Au(111) субстратов в качестве отрицательного контроля. Золото имеет эффект хорошо известных денатурации белков, который наделяет адгезивные свойства анти ячейки28. Sonicate все решения и фильтра до инкубации субстрата.
- Для положительных элементов управления погружайте пламени отожженная Au(111) субстратов в растворе тиоловых РГД модифицированные PEG, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene гликоль моно-11-mercaptoundecanamide (РГД-PEG-SH)30 и триэтиленгликоль моно-11-mercaptoundecyl эфира (PEG-SH) в соотношении 1: 100 Молярная в 96% этанола для 16 h на RT.
- Тщательно промойте субстратов в этаноле и высушите их аргоном. Хранить подложках при 4 ° C.
-
Управление субстраты для Chondrogenesis.
- Используйте нетронутой PLLA субстратов в качестве отрицательного контроля. Без поверхностной обработки PLLA показывает плохое взаимодействие с живых клеток. 31
- Для положительных элементов управления подготовить 5 мл 0,1 мг/мл фибронектин в фосфат амортизированное saline (PBS) и инкубировать каждый PLLA субстрат с 1,6 мл раствора фибронектин для 1 h на RT.
- Удаление и отменить решение фибронектин, мыть субстратов с PBS. Хранить подложках при 4 ° C.
4. поверхности характеристика
-
АСМ изображения
- Выполните AFM изображений PLLA субстратов для анализа шероховатости. Так как дендримеров диаметром 4-5 Нм, значения шероховатости 1 Нм должно быть получено для правильной визуализации nanopatterns. Кроме того выполните AFM изображений nanopatterns. В обоих случаях выполняют AFM в выстукивать режим в воздухе.
- Выберите консольные кремния с весны константа k = 40 Н/м и резонансной частоты ν = 300 кГц и смонтировать его на AFM оборудования.
- Установите образец на сцене атомно-силового микроскопа. В зависимости от настройки аппарата тюнинг и визуализации характеристики могут различаться. Проконсультируйтесь с производителем справочник.
- Подход образца с кончика микроскопа до контакта.
- Чтобы изображение PLLA для анализа шероховатости, выберите по крайней мере четыре представителя области 20 x 20 мкм на подложке из трех независимых субстратов. Для изображения дендример nanopatterns, выберите по крайней мере три представителя изображения 5 × 5 мкм на подложке из трех независимых субстратов в состояние (первоначальный дендример концентрации в растворе). Чтобы избежать повреждения дендример слоя во время обработки изображений, настройте набор точку сохранить силы на минимальном уровне.
Примечание: Выбор области изображения также зависит от Рабочий диапазон пьезоэлектрический сканера. Обратитесь к руководству инструментом в этом отношении. - Процесс AFM высоты фото путем установки каждого сканирования линии для полиномиальных функций с помощью несвободных программ производителя аппарата АСМ разравниванием и анализировать те от PLLA для вычисления шероховатости поверхности. Корень среднего квадратный (RMS) анализ может дать подходящий вариант.
-
Измерение поверхностной плотности местные РГД.
- Получите изображение порогов обработанных AFM Высота изображений для выбора дендримеров на поверхности.
- Определить положение частицы с помощью программного обеспечения для обработки изображения и использовать их для получения минимального расстояния interparticle (минd).
- Участок dмин значения z в соответствующих позициях частиц для получения вероятность контурные карты для dмин. Отрегулируйте цветовой шкале участка для визуализации в регионах высоких местных РГД-поверхностная плотность (dмин < 70 нм).
- Определить области регионов с высоким местных РСЗ плотность поверхности с помощью программного обеспечения для обработки изображения. Включите области дендример агрегатов в расчет.
-
СТМ изображений.
Примечание: СТМ изображений могут быть выполнены только для nanopatterns на токопроводящих подложках Au(111). Измерения выполняются в воздухе.- Место nanopatterned субстрата в держателе образца оборудования STM. Проверьте электрическое подключение между образцом и держатель с тестером.
- Etch кончик выбранного probe материала (т.е. PT 0,8: ИК 0,2) с диаметром, что обеспечивает правильное фитинга на голову STM оборудования. Травление может выполняться либо путем ручной резки электрохимического травления. 32
Примечание: Электрохимического травления оказывает более симметричной советы. - Установите наконечник в голову STM оборудования и подключите образца.
- Значение «текущий» в канал обратной связи (в этом тип измерения, текущий будет постоянной настройки обратной связи). Настройка напряжения смещения и текущий набор точки и размер сканирования для получения хорошо решен изображения после того, как Совет занимается.
Примечание: Выбор области изображения также зависит от Рабочий диапазон пьезоэлектрический сканера. Обратитесь к руководству инструментом в этом отношении. - Процесс STM топографических изображений путем установки каждой строки Полиномиальные выравнивания функции с помощью несвободных программ производителя аппарата STM.
-
CA измерения.
- Мера CA на подложках nanopatterned методом скальный капля в трех различных позициях на три независимых субстратов в состояние (первоначальный дендример концентрации в растворе) с оптической системой CA.
- Заполните microsyringe деионизированной водой и установите параметры в CA программное обеспечение для получения капель в 1 мкл.
- Поместите образец на сцене, чтобы поверхности образца видны на компьютере для изображений.
- Переместить шприц с микроманипулятор, до тех пор, пока он получает близко к поверхности и обойтись падение на поверхность. Запись изображения сразу после стабилизации капли.
Примечание: В CA измерений, очень важно для контроля влажности для достижения воспроизводимость результатов. - Анализируйте CAs, измеренная с патентованного программного обеспечения производителя аппарата CA. Метод установки может корректироваться к требованиям пользователя. Метод эллиптических фитинг может быть вариантом.
5. клеточная культура
Примечание: Все шаги были выполнены в культуре ткани капот и только стерильные материалы, решения и методы были использованы.
-
Фибробласт адгезии эксперимент.
- Культура низ 3T3 мыши эмбриональных фибробластов от ранних пассажей (< 10) при 37 ° C и 4,6% CO2 атмосферы в базальной среде с высоким глюкозы с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% L-глютамином, пируват натрия 1% пенициллина и стрептомицина и 1% (средний рост). Рекомендуется T75 колбы для всего заполнения 500000 клеток за флакон 10 мл среднего роста.
- Удалить старые среды с пипеткой 10 мл каждые 2 дня и заменить 10 мл свежеприготовленные роста средних.
- Культуры клеток в среде рост до тех пор, пока они достигают около 80% слияния, а затем удалить носитель и добавить 5 мл трипсина за флакон. Для обеспечения правильной ячейке отрешенности от нижней части колбы, поддерживать раствор трипсина контакт с клетки на 5 минут при 37 ° C.
- Добавьте 5 мл средний рост за флакон и собирать клетки в пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 470 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл среднего роста. Определите концентрацию клеток с использованием Горяева.
- Передача субстратов хорошо пластины, не рассматривается для культуры тканей (non сторонник).
- Семян клетки на подложках на плотности 4000 клеток/см2 в среднего роста и проинкубируйте 4,5 ч при 37 ° C и 10% CO2 атмосферы.
-
Хондрогенном индукция MSCs.
- Культура человека MSCs от ранних пассажей (< 5) при 37 ° C и 4,6% CO2 атмосферы в MSC среднего роста. Рекомендуется T75 колбы для всего заполнения 500000 клеток за флакон 10 мл среднего роста.
- Изменение среднего каждые 3 дня (как описано в 5.1.2).
- Trypsinize клетки, до 80% слияния будет достигнута и центрифуги и Ресуспензируйте их в MSC среднего роста (как описано в 5.1.3). Определите концентрацию клеток с использованием Горяева.
- Центрифуга клетки снова и Ресуспензируйте их в 10 мл chondrogenesis заставить среды.
- Передать подложек из пластин новых хорошо пластины, не рассматривается для культуры тканей (non сторонник). Заполнение ячеек на подложках на плотности 3000 клеток/см2.
- Изменение среднего хондрогенном каждые 3 дня (как описано в 5.1.2).
6. ячейка фиксации и иммуноокрашивания
Примечание: Следующие действия могут выполняться в нестерильных условиях.
- Удалите средства массовой информации и вымыть клетки мягко с PBS. Их исправить, добавив раствором формалина 10% для 20 мин на RT.
- Удаление формалином и вымыть клетки с PBS.
- Блокирование свободной альдегидной группы, добавляя 50 мм раствором хлорида аммония (NH4Cl) в PBS. Оставьте клетки для 20 минут, удалить NH4Cl RT. решения и мыть ячейки с PBS.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Хранить образцы в PBS на 4 ° C. - Удаление PBS и разрушения клеток, добавив 0,1% раствора сапонина блокирования решения (1% альбумина в PBS) для 10 мин на RT. мыть ячейки с PBS и передавать образцы новой пластины хорошо.
- Инкубировать клетки с решением первичных антител в решении блокировки (Таблица 3), за 1 ч на RT. Затем удалите раствор первичных антител и вымыть клетки с PBS.
- Инкубировать клетки с вторичные антитела в решении блокировки (Таблица 3), за 1 ч на RT.
Примечание: Избегайте света воздействия. - Удаление решения вторичного антитела и вымыть клетки с PBS и сухой.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Храните образцы в PBS на 4 ° C в темноте. - Пример монтажа для Микроскоп наблюдения: используя резец Алмазный наконечник, нарезать 1,25 см x 1,25 см. применить 50 мкл микроскопии монтажа средних на образцы coverslips и покрыть их аккуратно вырезать coverslips.
- Передача образцов удобный получателю, накрыть алюминиевой фольгой и хранить в темноте при температуре 4 ° C до наблюдения.
7. ячейка обработки изображений и анализа данных
Примечание: Для непрозрачной Au(111) и толстые субстратов на основе микрослайдовому, должен использоваться вертикально Микроскоп.
-
Фибробласт адгезии эксперимент.
- Использование помощью эпифлуоресцентного микроскопа оборудован цифровой камеры и низкой (например, 10 X) и высокой (т.е. 40 X) увеличение целей. Выполнения измерений в воздухе.
- Поместите образец на сцене и изображения клеточных ядер с 10 X задачи с помощью ультрафиолетовой возбуждения, longpass выбросов фильтр для визуализации Хехст/DAPI пятно.
- Цитоскелета клетки изображения и фокуса спаек (ФАС) с целью 40 X, выбрав фильтр Микроскоп, который соответствует соответствующий спецификации флюрохром антител.
- Для количественной оценки FA используйте обработки изображений программное обеспечение для преобразования изображения в 8-битные файлы. Удалите фон и конвертировать изображения в двоичное, установив порог. Вычислить по крайней мере 30 изображений на сэмпл и считают ФАС от 1 мкм2 для расчета.
-
Хондрогенном индукция MSCs.
- Изображение клетки конденсата на начальных этапах хондрогенном индукции (< 5 дней) с помощью вертикально эпифлуоресцентного микроскопа с цифровой камеры и низкий (т.е. 10 X) цель увеличения. Использование ультрафиолетового фильтра выбросов возбуждения и longpass для визуализации Хехст/DAPI пятно.
- Для измерения области конденсат, использовать программное обеспечение для обработки изображений, конвертировать изображения в 8-битные файлы, удалить фон и выберите порог, который подчеркивает совокупных контур. Вычислите площадь частиц.
- Immunostained примеры изображений для ФАС и Цитоскелет актина волокон коллагена хряща конкретного типа II альфа-1 (COL2A1) с вертикально Конфокальный микроскоп с высоким увеличением (то есть 40-60 X). Собирайте секции представитель интервалом (т.е. 0,5 – 1 мкм).
- Для обработки стека, используйте программное обеспечение для обработки изображения. Преобразование изображения в 8-битные файлы, удалить фон и сделать их двоичные, установив порог. Рассматривать как минимум три ячейки конденсаты за состояние трех независимых выборок.
- Количественно FA белка, окрашенных областей от зоне базальной клетки конденсата и выразить их как соответствующий процент площади, деленное на количество клеточных ядер в изображении.
- Для измерения COL2A1 окрашивание, использовать конфокальный z прогнозы и подсчитать сумму проектируемого района (максимальная площадь COL2A1 на сэмпл). Нормализовать области значение, полученное против района соответствующего конденсата.
8. количественные обратный транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализ
Примечание: Для предотвращения загрязнения РНКазы, использовать одноразовые, стерильные пластиковая посуда и носить одноразовые перчатки при обработке реагентов и РНК. Всегда использовать правильные методы микробиологических асептических и использовать соответствующие обеззараживания решение для удаления загрязнения РНКазы с рабочих поверхностей и предметов не disposable центрифуг и пипетки.
- Изолировать всего РНК и распылить его в аннулятор РНК. Лечить образцов РНК с DNase и конвертировать их в cDNA, используя набор для синтеза cDNA.
- Проводить qRT ПЦР с праймерами для транскрипционного фактора SOX9. Бета-2-микроглобулина (B2M) и рибосомных белка L13a (RPL13a) может использоваться в качестве уборки генов.
- Рассчитать уровни выражения и нормализации их против отрицательного контроля (PLLA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем nanopatterning метод, который позволяет поверхности клейкости решаться на наноуровне (рис. 1). Химическая структура РГД-КМС-D1 показан на рисунке 1A. Дендримеры были узорной на электрических проводящих поверхностей Au(111) для высокого разрешения характеристика STM. Катионные низкой концентрации в растворе (до 10-5% w/w) вынесла изолированных дендримеров 4-5 Нм в диаметре (рис. 1B), при этом весьма Упакованные дендример агрегатов, сформированные при более высоких концентрациях (рис. 1 c). Поверхностные характеристики AFM (Цифры 1 D-G, верхний ряд) показали, что поверхности распределение РГД-КМС-D1 дендримеров может регулироваться как функция первоначального дендример концентрации в растворе. На вероятность контурные карты для dминэто приводит к в различных местных РСЗ наноразмерных плотности на поверхности (Цифры 1 D-G, Нижняя строка).
В экспериментах культуры клеток, интегринов рецептор клеточной мембраны около 10 Нм в диаметре признал РСЗ последовательность на периферии дендримеров. Хотя за дендример были представлены восемь копии этой последовательности, только один дендример взаимодействовали за Интегрин из-за его размера (4-5 Нм, измеряется STM; Рисунок 1B). То есть каждый дендример предусмотрено одного сайта Интегрин привязки, тем самым позволяя прямая зависимость от дендример распределения (как видно на изображениях AFM) и РГД распределения для клеточной адгезии. Кроме того в CA значения, полученные для разных nanopattern конфигураций, которые могут влиять на клетки адгезии29были найдены без существенных различий. Эти характеристики делают дендример nanopatterns на подходящие субстратов биосовместимых поверхностей через который модулировать и изучить поведение клеток.
Клеточной адгезии к nanopatterned Au(111) была протестирована с фибробластов в течение первых 24 ч культуры (рисунок 2A) и MSCs на nanopatterned PLLA (рис. 2B). В обоих случаях процент области витражи для Англии белок paxillin (чел) увеличивалось с дендример концентрации, как местные РСЗ поверхностная плотность (процент от nanopatterned области смин dниже порога 70-Нм для эффективного клеточной адгезии; Таблица 4). Для первоначального дендример концентрации 10-2% w/w и позитивные элементы, процент области окрашенных чел в клетку снизился и корреляции с процент nanopatterned области с dмин < 70 Нм был потерян.
Доля площади занимаемых dмин < 70 Нм (рис. 1 d-G нижний ряд и Таблица 4) является хорошим показателем местных РСЗ поверхностной плотности для nanopatterns до 10-5% w/w первоначальный дендример концентрации, но не из тех, кто до 10-2% w/w, благодаря дендример агрегации. Агрегирование производится весьма разнородных образцы с точки зрения распределение лиганда с только небольшой процент поверхности с значенийmin dниже порога 70-Нм (рис. 1 d нижний ряд и Таблица 4). XPS результаты показали, что эти поверхности представляют глобальную РСЗ плотности сопоставимы с 10-5% w/w-производные nanopatterns28. Это наблюдение указывает, что максимальная плотность РГД был достигнут в регионах, содержащие дендример агрегатов и что процент площади поверхности оккупирована dмин < 70 нм не является представителем местного РСЗ поверхностной плотности в Этот случай.
Наблюдения, что позитивные элементы (однородных покрытий) с максимальной местной РСЗ поверхностная плотность не показывать ожидаемое увеличение в клеточной адгезии может объясняться их пространственной помех эффект. Эти результаты свидетельствуют о том, что, по сравнению с соответствующей однородной поверхности, обычно используется в культуре клеток, RGD nanopatterns поддержания клеточной адгезии более эффективно. Таким образом этот вывод подчеркивает значимость местных лигандом плотности.
Взаимодействие с окружающей средой в морфогенеза активировать первый события дифференцировки клеток и распространять их до создания окончательного комплекса тканевых структур. Для оценки воздействия дендример nanopatterns на клеточной адгезии и дифференциации, мы использовали хондрогенном индукции MSCs как модель. Во время chondrogenesis есть активная матрица ремоделирования, который играет роль поучительным в режиссуре клетки через различные этапы формирования хрящей.
MSCs прошли chondrogenesis на nanopatterns (рис. 3). Хондрогенном дифференциация начинается с шага конденсации ячейки, которая включает в себя набор клеток сформировать густой конденсаты, установление коммуникации к ячейке и сопутствующие изменения в ячейке морфология33. Рисунок 3A показывает, что клетки конденсация происходит все субстраты и что конденсаты увеличилось в районе с растущей концентрации дендример до 2,5 x 10-8% w/w районе конденсата затем снизилась на катионные концентрация 10-2% w/w и позитивных элемента управления. Шаг конденсации клеток в chondrogenesis происходит через активную ячейку движение, а не увеличение распространения клеток34. Это движение клеток благоволят гибкое сцепление с подложкой: стабильная спайки должны быть сформированы разрешить тяговой силы для перемещения тела клетки, и в то же время, эти спайки должно быть достаточно слабы, чтобы позволить клетки релиз от субстрата во время движение. Ячейки конденсации благоприятствует увеличению в местных РСЗ поверхностная плотность до 2, 5х10-8% w/w-производные nanopatterns, с хорошим балансом между клеточной адгезии и клеточного движения. Для 10-2 и положительный контроль местные RDG поверхностная плотность был слишком высоким, тем самым уменьшается конденсации событие.
Хондрогенном дифференциация доходов от prechondrogenic конденсата: клетки в конденсаты становятся более округлые и начать синтез хрящевой определенных маркеров, такие как белок ECM COL2A1 и транскрипции фактор SOX933, 34 , 35. соответственно, субстратов с промежуточных клейкости, в пользу формирования клеток конденсатов, показали выше, COL2A1 окрашивание (рис. 3B) и более высокий уровень экспрессии мРНК SOX9 (рис. 3 c).
Наши результаты подчеркивают влияние ячеек матрицы взаимодействия на ранних стадиях дифференцировки хондрогенном. Такое взаимодействие может легко решаться на основе дендример nanopatterns.
| Шаг | Время (ов) | Скорость (об/мин) | Ускорение (об/мин/сек) |
| 1 | 5 | 500 | 300 |
| 2 | 30 | 3000 | 1500 |
Таблица 1: Spinner программы шаги, используемые для покрытия стекла слайды с приготовленным раствором PLLA. Первый шаг гомогенизации был использован на 500 об/мин с ускорением 300 об/мин/сек для 5 s. последовал последний шаг при 3000 об/мин с ускорением 1500 об/мин/с для 30 s.
| Решение | РГД КМС D1 (мг/мл) | РГД КМС D1 (мг) | MQ воды (мкл) |
| A | 0,77 | 5 | 6,494 |
| РГД КМС D1 (% w/w) | Решение (мкл) | ||
| B | 10-2 | 779 | 5,220 |
| C | 10-5 | 0.78 | 6000 |
| Решение C (мкл) | |||
| D | 2,5 x 10-8 | 15,0 | 5,985 |
| E | 10-8 | 6.0 | 5,994 |
| F | 4 x 10-9 | 2.4 | 5998 |
Таблица 2: Детали подготовки решений РГД-КМС-D1. Стоковый раствор РГД-КМС-D1 дендримеров был подготовлен в конечной концентрации 0.77 мг/мл (раствор A), из которого были подготовлены решения B и C на 10-2 и 10-5% w/w концентрации. Решение C с 10-5% w/w концентрации РГД-КМС-D1 дендример был использован для подготовки решения D, E и F на окончательный концентрации 2,5 x 10-8, 10-8 и 4 x 10-9%w/w, соответственно.
| Имя | Объем (мкл) | Блокирует буфер (мл) | |
| Основной микс | Кролик МАБ в pax | 65 | 12.870 |
| МАБ мышь для COL2A1 | 32.5 | ||
| Вторичные микс | Alexa Fluor 488 коза анти мышь | 13 | 12.961 |
| Alexa Fluor 568 коза анти кролик | 13 | ||
| Решение "Хёхст" | 13 |
Таблица 3: подготовка раствор антител. Смесь содержит основное антитело моноклональные антитела против pax, производимых в кролика разводят 1: 200 в решении блокировки с моноклональные антитела против COL2A1, производится в мыши разводят 1: 400 в решении блокировки. Вторичное антитело смесь содержит пятно ядер клеток Hoechst и вторичные антитела производится в козла против мыши и кролик соответственно (помечены с Alexa Fluor 488 и 568 флуорофоров, соответственно).
Рисунок 1 : RGD-КМС-D1 дендример nanopatterning для управления наноразмерных местных РСЗ поверхностной плотности. (A) РГД-КМС-D1 дендример структура, содержащая до восьми копий клей РСЗ пептидных клеток. Представитель STM изображения (смещения = 200 МВ, уставка = 0,5 НС) из РГД-КМС-D1 nanopatterns на Au(111) от первоначального водный раствор 10-8% w/w (шкалы бар = 3 Нм, B) и соответствующего профиля высоты расстояние, полученные на пунктирной региона, указанных в (B)и (C) 10-2% w/w показаны дендример агрегации (шкала бар = 20 Нм). (D-G) Представитель АСМ изображения РГД-КМС-D1 nanopatterns на PLLA получил от соответствующих водных растворов дендример 10-2%, 2,5% x 10-8, 10-8%и 4 x 10-9% w/w, соответственно (шкалы бар = 1 мкм). Соответствующее минимальное расстояние interparticle (минd) вероятность контурная карта показан ниже каждого АСМ изображения, с высокой плотностью РСЗ областей, изображенных в темно-красный (dмин < 70 нм). Дендримеры и катионные агрегатов изображены в черном для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Сотовый адгезии на РГД-КМС-D1 nanopatterns. Участок процент области, витражи для Англии белка pax на ячейку для ячеек при контакте с субстрата (левая ось) с начальной дендример концентрации. Значения сравниваются с местными РСЗ поверхностная плотность (процент площади поверхности в nanopatterns, содержащий значениямин dниже порога 70 нм) (правая ось) с 0 и 100 процентами, назначен к положительному (+ контроль) и отрицательных (- управляет элемент управления), соответственно. (A) фибробластов адгезии на катионные nanopatterns на Au(111) после 4,5 ч культуры. (B) MSC адгезии на катионные nanopatterns на PLLA, оценивается в 1 день хондрогенном индукции. Значения даны как среднее со стандартным отклонением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| РГД КМС D1 (% w/w) | Площадь (< dмин = 70 нм) (%) на Au(111) | Площадь (< dмин = 70 нм) (%) на PLLA |
| 10-2 | 5 ± 1 | 2 ± 2 |
| 10-5 | 97 ± 2 | |
| 2, 5 x 10-8 | 65 ± 11 | 90 ± 2 |
| 10-8 | 25 ± 16 | 45 ± 7 |
| 4 x 10-9 | 18 ± 11 |
Таблица 4: доля области с d мин значения ниже 70 нм получены для РГД-КМС-D1 дендример осаждения на Au(111) и на PLLA поверхности как функция используется концентрации первоначального дендример.
Рисунок 3 : Хондрогенном дифференцировки МСК на nanopatterns РГД-КМС-D1. (A) конденсацией MSCs, культивируемых на РГД-КМС-D1 nanopatterns на PLLA после 5 дней хондрогенном индукции. Представитель эпифлуоресцентного образы окрашенных клеточных ядер (Hoechst; Шкалы бар = 300 мкм; Верхняя строка) и участок области ячейки конденсата (нижний ряд) получил РГД-КМС-D1 nanopatterns из различных первоначальных дендример концентрации. Дифференциация доходов от конденсации шаг ячейки с выражением конкретных хондрогенном маркеров: (Б) процент от области COL2A1 окрашивания нормализованной с областью ячеек конденсата из соответствующего конфокальный z прогнозы полученные после 5 дней хондрогенном индукции. (C) относительная SOX9 мРНК выражение (против отрицательного контроля) после 3 дней хондрогенном индукции. Значения даны как среднее со стандартным отклонением (B) и (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В ходе разработки описанных протокола должны рассматриваться ряд важных шагов. Первое относится к nanopattern характеристика с сканирования методы микроскопии зонд. Для визуализации nanopatterns, где производится структурирования поверхности должен иметь значение шероховатости ниже среднего диаметра Дендримеры, которая составляет около 4-5 Нм, как измеряется STM (рис. 1B). Кроме того следует учитывать, что высоким разрешением СТМ изображений ограничен на токопроводящих подложках, в данном случае Au(111). Любая отмена полимера от углов слайда после отжима покрытие может быть исправлено с помощью биосовместимых клея.
Катионные nanopatterning это процесс, посредством которого для достижения под контролем местной ячейки клейкости на наноуровне. На основе самостоятельной сборки дендримеров на поверхности путем адсорбции, эта техника не требуют каких-либо сложных nanopatterning оборудования, таким образом, контрастируя с ранее описанные методы, основанные на литографии36,37, 38. nanopatterning дендример может быть легко масштабируются для больших поверхностей и полностью совместим с протоколы культуры клетки.
Катионные nanopatterning метод, описанный здесь можно найти будущих приложений в регенеративной медицине. Элемент управления, оказываемое дендример nanopatterning на адгезии клеток делает этот метод подходит для кондиционирования биоматериалов до имплантации, способствуя тем самым их интеграции в ткани узла. Кроме того легкость, с которой дендример может быть изменен периферийных постановление делает дендример nanopatterning подходит для других лиганды, которые оказывают деятельности зависят от концентрации на клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают Oriol шрифта-Бах и Альберт G. Кастаньо, за их помощь вмин dколичественная оценка. Они также признают Advanced цифровой микроскопии блок в Институте исследований в области биомедицины (IRB Барселона), чтобы позволить авторам записывать видео в их помещениях. Эта работа получила поддержку от сетей биомедицинских исследований центр (CIBER), Испания. CIBER является инициатива финансируется на VI национальном R & D & я план на 2008-2011, инициатива Инхенио 2010, Consolider программы, CIBER действия и Instituto de Salud Карлоса III, при поддержке Европейского регионального фонда развития. Эта работа была поддержана Комиссией для университетов и научно-исследовательский отдел инноваций, университетов и предприятий Женералитата Каталонии (2014 SGR 1442). Он финансируется проектов OLIGOCODES (No. MAT2012-38573-C02) и CTQ2013-41339-P, награжден испанским министерством экономики и конкурентоспособности, в дополнение к ИНТЕРРЕГ V-A Испания-Португалия 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. признает финансовую поддержку от испанского министерства экономики и конкурентоспособности Грант (No. IFI15/00151).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 - dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
