Summary
En metod för att erhålla dendrimer-baserade ojämn nanopatterns som tillåter nanoskala kontroll av lokala arginin-glycin-aspartic acid (RGD) Ytors beskrivs och tillämpas för studien av celldifferentiering vidhäftning och chondrogenic.
Abstract
Cellulär adhesion och differentiering villkoras av nanoskala disposition av extracellulär matrix (ECM) komponenter, med lokala koncentrationer med en större verkan. Här presenterar vi en metod för att få storskaliga ojämna nanopatterns av arginin-glycin-asparaginsyra (RGD)-functionalized tåååålamooooooood som tillåter nanoskala kontroll av lokala RGD yta densitet. Nanopatterns bildas genom ytan adsorption av tåååålamooooooood från lösningar vid olika initiala koncentrationer och kännetecknas av vatten kontaktvinkel (CA), X-ray fotoelektronen spektroskopi (XPS), och skanning sond mikroskopi tekniker såsom scanning tunneling microscopy (STM) och atomic force microscopy (AFM). Lokala Ytors av RGD mäts med hjälp av AFM bilder med hjälp av sannolikhet konturkartor av interparticle minimiavstånd och sedan korrelerade med cell adhesion svar och differentiering. Metoden nanopatterning som presenteras här är en enkel procedur som kan skalas på ett okomplicerat sätt att stora ytor. Det är således fullt kompatibel med cell kultur protokoll och kan tillämpas på andra ligander som utövar koncentrationsberoende effekter på celler.
Introduction
Här beskriver vi en enkel och mångsidig dendrimer-baserade nanopatterning förfarande för att erhålla cell kultur ytor som tillåter kontroll av lokala vidhäftning på nanonivå. Nanoskala Detaljer för ECM organisation har rapporterats,1,2,3 och nanopatterning cell adhesion ytor har lämnat djupa insikter i de cellulära krav relaterade till vidhäftning4, 5. Experiment med micellar litografi-baserade nanopatterns visade ett tröskelvärde på runt 70 nm för RGD peptid nanospacing, celladhesion försenas avsevärt över detta värde6,7,8 ,9. Dessa studier visade också större påverkan av lokal än global ligand densitet cell adhesion9,10,11.
Under morfogenes utlösa cell interaktioner med omgivningen första differentiering händelserna, som fortsätta tills sista komplex vävnad strukturer har bildats. Inom denna ram, har nanopatterned ytor använts för att ta itu med påverkan av de inledande cellyta interaktioner på morfogenes. Litografi-baserade RGD nanopatterns med en lateral avstånd 68 nm i β-typ Ti-40Nb legeringar bidra till att upprätthålla den odifferentierade fenotypen av icke-begått stamceller12, medan RGD nanospacings för mellan 95 och 150 nm förbättra differentieringen av mesenkymala stamceller (MSC) mot adipogena/Osteogena13,14,15 och chondrogenic öden16. Också, egen montering makromolekyler modifierad med signalering komponenter har visat att rikta celladhesion och differentiering genom att tillhandahålla nanoskala arkitektoniska förordning av signalering cues17. I detta avseende har nedfall av tåååålamooooooood med cell-interagera beståndsdelarna i deras yttre sfär18,19,20 på ytor använts för att studera cell adhesion21,22, morfologi23,24, och migration händelser25,26. Trots gör bristen på ytan karakterisering i dessa studier det svårt att fastställa något samband mellan dendrimer yta konfiguration och cellssvar.
Dendrimer nanopatterns med vätska-liknande ordning och definierade avstånd kan erhållas när tåååålamooooooood adsorberas till låg laddade ytor från lösningar med låga Joniska styrkor. 27 på grundval av denna egendom, här presenterar vi en metod för att få storskaliga ojämna nanopatterns av RGD-functionalized tåååålamooooooood på låg laddade ytor som tillåter nanoskala kontroll av lokala RGD Ytors. Vatten kontaktvinkel (CA), X-ray fotoelektronen spektroskopi (XPS) och skanning sonden mikroskopi tekniker (STM och AFM nanopatterns) Visa att lokala ligand tätheter kan justeras ändra den inledande dendrimer koncentrationen i lösning. Lokala RGD Ytors är kvantifieras från AFM bilder av sannolikhet konturkartor av interparticle minimiavstånd och sedan korrelerade med cell experiment. Jämfört med andra nanopatterning tekniker4, dendrimer-baserade nanopatterning är okomplicerat och enkelt kan skalas till stora ytor, vilket är fullt kompatibel med cell kultur-program. Nanopatterns används som bioaktiva substrat för att utvärdera effekten av lokala RGD Ytors på cell adhesion28 och chondrogenic induktion av vuxen människa MSCs29. Våra resultat visar att RGD dendrimer-baserade nanopatterns upprätthålla cellernas tillväxt och att celladhesion förstärks av höga lokala RGD ytan tätheter. I experiment som differentiering gynnade mellanliggande vidhäftning av celler till substratesna MSC kondens och tidig chondrogenic differentiering. På grund av den lätthet med vilken dendrimer perifera grupper kan ändras, kan den metod som beskrivs här förlängas ytterligare till andra ECM-ligander som utövar koncentrationsberoende effekter på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. substrat förberedelse
-
Glödgning 1,4 x 1,1 cm Au(111) på Mica substrat.
- Placera Au(111) substratet på glaskeramik spis och glödga det med butan låga för 3 min. Tillåt substratet svalna under en argon-atmosfär. Upprepa detta steg för varje Au(111) substrat.
Obs: Au(111) substrat bör användas omedelbart efter glödgning.
- Placera Au(111) substratet på glaskeramik spis och glödga det med butan låga för 3 min. Tillåt substratet svalna under en argon-atmosfär. Upprepa detta steg för varje Au(111) substrat.
-
Beredning av Poly (L-mjölksyra) (PLLA)-belagda glas substrat.
- Skär och tvätta glasskivor.
- Skär mikroskopi glider in 18 diabilder av 1,25 x 1,25 cm med en diamant-tip cutter. Göra en liten inbuktning på undersidan av varje bild, så att de övre och nedre sidorna kan särskiljas senare.
- Tvätta bilderna med avjoniserat vatten följt av 96% etanol. Låta dem lufttorka.
- Bered den 2% PLLA.
- Lägga till 200 mg av PLLA 10 ml av 1,4-dioxan i ett tryck-rör. Lägga till en uppståndelse och Stäng tuben tätt.
- Placera tryck röret i ett glycerin bad på en värmeplatta vid 60 ° C under skonsam omrörning för 24 h och sedan överför lösningen till en 15 mL injektionsflaska av glas.
- Beläggning glas glasen med PLLA lösning.
- Placera glasskivor och flaskan med lösningen PLLA på en ren värmeplatta i 60 ° C. Se till att placera glasen uppåt och tillåta dem att stanna kvar i minst 10 min att nå den nödvändiga temperaturen.
- Förbereda den spin coater och ange det program som anges i tabell 1.
- Placera en av diabilder ansikte upp på den spin coater, använder ett vakuumsystem. Med en Pasteur-pipett, tillämpa 0,25 mL av den PLLA lösningen till bild, se till att hela ytan täcks. Kör programmet beläggning. Upprepa detta steg för varje bild.
- Skär och tvätta glasskivor.
2. Dendrimer Nanopatterning
-
Beredning av RGD-Functionalized Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 lösningar.
- Lös 5 mg av dendrimer i 6.494 mL avjoniserat vatten. Detta är lösningen A.
Obs: Använd dendrimer stamlösning inom 6 månader av förberedelser. - Sonikera lösning A i 10 min och förbereda lösningar B och C efter tabell 2.
- Sonikera lösning C i 10 min och förbereda lösningar D, E och F efter tabell 2.
- Lagra lösningar B, C, D, E och F vid 4 ° C fram till användning. Lösning A kan förvaras vid-20 ° C för senare användning.
- Lös 5 mg av dendrimer i 6.494 mL avjoniserat vatten. Detta är lösningen A.
-
Nanopatterning av RGD-Cys-D1 tåååålamooooooood på substratesna
- I en vävnadskultur huva, sterilisera substratesna av bestråla dem med UV-ljus för 13 min.
Obs: Detta steg är bara nödvändigt när nanopatterned substrat kommer att användas som cell kultur substrat. I det här fallet, upprätthålla de sterila förhållandena (vävnadsodling huva, sterila material, lösningar och tekniker) för följande steg. - Placera varje substrat ansikte upp i brunnarna platta, hantera dem försiktigt med pincett.
- Sonikera lösningar B, C, D, E och F i 10 min.
- Passera de RGD-Cys-D1 dendrimer lösningarna genom ett 0,22 µm diameter filter med en spruta direkt i brunnarna som innehåller substratesna (2 mL per brunn). Minst tre repliker per dendrimer koncentration rekommenderas. Nära och täta plattan och lämna det i rumstemperatur (RT) för 16 h.
- Avlägsna och kassera lösningarna. Tvätta substratesna med sterilt avjoniserat vatten och torr. Lagra substrat vid 4 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här.
- I en vävnadskultur huva, sterilisera substratesna av bestråla dem med UV-ljus för 13 min.
3. beredning av kontroll substrat
Obs: Alla åtgärder utfördes i en steril vävnadsodling huva och endast sterila material, lösningar och tekniker användes. Åtminstone styra sex substrat var används (tre repliker av den positiva kontrollen) och tre repliker av den negativa kontrollen.
- I en vävnadskultur huva, sterilisera substratesna av bestråla dem med UV-ljus för 13 min.
-
Kontroll substrat för Fibroblast vidhäftning Experiment.
- Använda flame-glödgas Au(111) substrat som den negativa kontrollen. Guld har en välkänd protein-denaturering effekt som ger anti självhäftande Cellegenskaper28. Sonikera alla lösningar och filtrera före substrat inkubation.
- För de positiva kontrollerna, fördjupa flame-glödgas Au(111) substrat i en lösning av RGD-modifierade PEG tiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glykol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 och tiethylene glykol mono-11-mercaptoundecyl eter (PEG-SH) i förhållandet 1: 100 molar i 96% etanol för 16 h på RT.
- Tvätta substrat i etanol och torka dem med argon. Lagra substrat vid 4 ° C.
-
Kontroll substrat för kondrogenes.
- Använda orörda PLLA substrat som den negativa kontrollen. Utan någon ytbehandling visar PLLA dålig samverkan med levande celler. 31
- För de positiva kontrollerna, förbereda 5 mL av 0,1 mg/mL Fibronektin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera varje PLLA substrat med 1,6 mL av Fibronektin lösningen för 1 h på RT.
- Ta bort och kassera Fibronektin lösningen och tvätta substratesna med PBS. Lagra substrat vid 4 ° C.
4. ytan karakterisering
-
AFM Imaging
- Utföra AFM avbildning av PLLA substrat för en strävhet analys. Eftersom tåååålamooooooood har en diameter på 4-5 nm, strävhet värden 1 nm bör erhållas för korrekt visualisering av nanopatterns. Dessutom utför AFM avbildning av nanopatterns. I båda fallen utför AFM i att trycka på mode i luften.
- Välj en silicon fribärande med en fjäder konstant k = 40 N/m och en resonant frekvensen ν = 300 kHz och montera det på AFM utrustningen.
- Montera provet på scenen av mikroskopet atomic force. Beroende på utformningen av apparaten, kan tuning och imaging specifikationer variera. Konsultera tillverkarens handbok.
- Närma provet med spetsen på mikroskopet tills kontakt.
- För att bilden PLLA för ojämnheter analys, välj minst fyra representativa områden 20 x 20 µm per substrat från tre oberoende substrat. Bild dendrimer nanopatterns, välja minst tre representativa bilder av 5 × 5 µm per substrat från tre oberoende substrat per tillstånd (inledande dendrimer koncentration i lösning). Undvik att skada det dendrimer lagret medan imaging, justera börvärdet för att hålla kraften på ett minimum.
Obs: Valet av området imaging beror också på arbetsområde piezoelektriska skannern. Vänligen konsultera manualen instrument i detta avseende. - Processen AFM höjden bilder genom att montera varje Skanna linje till polynom utjämning funktioner med hjälp av egenutvecklade programvaran från tillverkaren av AFM apparaten och analysera de från PLLA att beräkna ytjämnhet. Root-mean square (RMS) analysen kan ge ett lämpligt alternativ.
-
Lokala RGD Ytors mätning.
- Få bilden tröskelvärdena för de bearbetade AFM höjd bilderna att välja tåååålamooooooood på ytan.
- Bestämma de partikel positioner med hjälp av ett bildbehandlingsprogram och använda dem för att få de minsta interparticle avstånd (dmin).
- Rita dmin värden i z till motsvarande partikel positioner att få sannolikheten konturkartor för dmin. Justera färgskalan av tomten att visualisera regionerna i högsta lokala RGD Ytors (dmin < 70 nm).
- Kvantifiera området i regionerna med högsta lokala RGD Ytors använder ett bildbehandlingsprogram. Inkludera områdena av dendrimer aggregat i beräkningen.
-
STM Imaging.
Obs: STM avbildning kan utföras endast för nanopatterns på ledande Au(111) substrat. Mätningar görs i luften.- Placera nanopatterned substratet i provhållaren STM utrustning. Kontrollera den elektriska förbindelsen mellan prov och innehavaren med en testare.
- Etch en spets av valda sonden material (dvs. PT 0,8: Ir 0,2) med en diameter som säkerställer riktig montering på huvudet av utrustningen som STM. Etsning kan utföras antingen genom manuell skärning eller elektrokemisk etsning. 32
Obs: Elektrokemisk etsning återger mer symmetrisk tips. - Montera spetsen i huvudet av STM utrustningen och ansluta provet.
- Ange 'current' i feedbackkanal (i denna typ av mätning, nuvarande kommer att vara konstant genom feedback tuning). Justera bias spänning och aktuella börvärde och skanningsstorlek att uppnå en väl löst bild när spetsen är engagerade.
Obs: Valet av området imaging beror också på arbetsområde piezoelektriska skannern. Vänligen konsultera manualen instrument i detta avseende. - Processen STM topografiska bilder genom att montera varje scan-line till polynom utjämning fungerar med hjälp av egenutvecklade programvaran från tillverkaren av STM apparaten.
-
CA mått.
- Mått CA på de nanopatterned substratesna av de fastsittande-släpp-metoden i tre olika positioner på tre oberoende substrat per skick (inledande dendrimer koncentration i lösningen) med ett optiskt CA-system.
- Fyll i mikrosprutan med avjoniserat vatten och ställa in parametrar i programvaran CA att producera droppar 1 µL.
- Placera provet på scenen så att ytan av provet syns tydligt på datorn för avbildning.
- Flytta sprutan med micromanipulator tills det blir nära ytan och fördela droppa på ytan. Spela in bilden omedelbart efter droplet stabilisering.
Obs: I CA mätningar, det är mycket viktigt att kontrollera luftfuktighet för att få reproducerbara resultat. - Analysera CAs mätt med egenutvecklade programvaran från tillverkaren av CA apparaten. Metoden montering kan justeras till användarnas krav. Den elliptiska passande metoden kan vara ett alternativ.
5. cellkultur
Obs: Alla åtgärder utfördes i en vävnadskultur huva och endast sterila material, lösningar och tekniker användes.
-
Fibroblast vidhäftning Experiment.
- Kultur NIH 3T3 mus embryonala fibroblaster från tidig passager (< 10) vid 37 ° C och 4,6% CO2 atmosfär i basal medium med hög glukos kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin och 1% natrium pyruvat (odlingsmedium). T75 kolvar för en total sådd av 500 000 celler per kolv i 10 mL odlingsmedium rekommenderas.
- Ta bort gamla medium med pipett 10 mL varannan dag och Ersätt med 10 mL nyberedd odlingsmedium.
- Kultur celler i odlingsmedium tills de når runt 80% sammanflödet, sedan ta bort mediet och tillsätt 5 mL av trypsin per kolv. För att säkerställa korrekt cell lösgörande från botten av kolven, upprätthålla trypsin lösningen kommer i kontakt med cellerna för 5 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 5 mL odlingsmedium per kolv och samla in cellerna i ett centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 470 x g i 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 mL odlingsmedium. Bestämma koncentrationen av celler med hjälp av en hemocytometer.
- Överföra substratesna väl plattor inte behandlats för vävnadsodling (icke-anhängare).
- Utsäde cellerna på substratesna med en täthet av 4 000 celler/cm2 i odlingsmedium och inkubera dem i 4,5 h vid 37 ° C och 10% CO2 atmosfär.
-
Chondrogenic induktion av MSCs.
- Kultur mänskliga MSCs från tidig passager (< 5) vid 37 ° C och 4,6% CO2 atmosfär i MSC odlingsmedium. T75 kolvar för en total sådd av 500 000 celler per kolv i 10 mL odlingsmedium rekommenderas.
- Ändra medium var 3 dagar (enligt beskrivningen i 5.1.2).
- Trypsinize celler innan 80% sammanflödet nås, och centrifugera och resuspendera dem i MSC odlingsmedium (enligt beskrivningen i 5.1.3). Bestämma koncentrationen av celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera cellerna igen och återsuspendera dem i 10 mL kondrogenes-inducerande medium.
- Överföra substratesna från plattorna till nya plattor inte behandlats för vävnadsodling (icke-anhängare). Kärna ur cellerna på substratesna med en täthet av 3 000 celler/cm2.
- Ändra chondrogenic mediet var 3 dagar (enligt beskrivningen i 5.1.2).
6. cell fixering och immunfärgning
Obs: Följande åtgärder kan utföras i icke-sterila förhållanden.
- Ta bort media och tvätta cellerna försiktigt med PBS. Åtgärda dem genom att lägga till en 10% formalin lösning för 20 min på RT.
- Ta bort formalin och tvätta cellerna med PBS.
- Blockera gratis aldehyd grupper genom att lägga till en 50 mM lösning av ammoniumklorid (NH4Cl) i PBS. Lämna cellerna i 20 min på RT. bort NH4Cl lösningen och tvätta cellerna med PBS.
Obs: Protokollet kan pausas här. Lagra prover i PBS vid 4 ° C. - Ta bort PBS och permeabilize cellerna genom att lägga till en 0,1% lösning av saponin i blockerande lösningen (1% albumin i PBS) i 10 min på RT. Wash cellerna med PBS och överföra prover till en ny väl platta.
- Inkubera cellerna med en lösning av primära antikroppar i den blockerande lösningen (tabell 3) för 1 h på RT. Ta sedan bort primär antikropp lösningen och tvätta cellerna med PBS.
- Inkubera cellerna med sekundära antikroppar i den blockerande lösningen (tabell 3) för 1 h på RT.
Obs: Undvik ljus exponering. - Ta bort sekundär antikropp lösningen och tvätta cellerna med PBS och torr.
Obs: Protokollet kan pausas här. Lagra proverna i PBS vid 4 ° C i mörker. - Prov montering för Mikroskop observation: använder en diamant-tip cutter, skär coverslips i 1,25 cm x 1,25 cm. gäller 50 µL av mikroskopi montering medium på proverna och täcka dem försiktigt med den skurna coverslips.
- Överföra proverna till en bekväm mottagare, täck den med aluminiumfolie och förvaras i mörker vid 4 ° C tills observation.
7. cell Imaging och dataanalys
Obs: För ogenomskinlig Au(111) och tjocka microslide-baserade substrat, ett upprätt Mikroskop måste användas.
-
Fibroblast vidhäftning Experiment.
- Använd ett epifluorescensmikroskop utrustad med en digital kamera och låg (dvs. 10 X) och hög (dvs 40 X) förstoring mål. Utför mätningar i luft.
- Placera provet på de scenen och bild cellkärnorna med målsättningen för 10 X som använder en ultraviolett magnetisering, longpass utsläpp filter att visualisera Hoechst/DAPI fläcken.
- Bild cell cytoskelettet och fokal sammanväxningar (FAs) med de 40 X-objektiv, att välja filtret Mikroskop som matchar motsvarande antikropp fluorokrom specifikationer.
- För FA kvantifiering, använda ett bildbehandlingsprogram för att konvertera bilder till 8-bitars filer. Ta bort bakgrund och konvertera bilder till binära genom att ange ett tröskelvärde. Beräkna minst 30 bilder per prov och överväga FAs från 1 µm2 för beräkning.
-
Chondrogenic induktion av MSCs.
- Bild cell kondensat på de inledande skedena av chondrogenic induktion (< 5 dagar) med ett upprätt epifluorescensmikroskop utrustad med en digitalkamera och en låg (dvs. 10 X) förstoring mål. Använda ultraviolett excitation och longpass utsläpp filter att visualisera Hoechst/DAPI fläcken.
- För att mäta området kondensat, använder en bildbehandling programvara, konvertera bilder till 8-bitars filer, ta bort bakgrunden och välj ett tröskelvärde som belyser den sammanlagda konturen. Beräkna område av partiklarna.
- Bild immunostained prover för FAs, cytoskelettet aktin fibrer och brosk-specifika kollagen typ II alpha 1 (COL2A1) med ett upprätt confocal Mikroskop vid hög förstoring (dvs. 40-60 X). Samla delar vid ett representativt intervall (dvs 0,5 – 1 µm).
- Använda ett bildbehandlingsprogram för att bearbeta bunten. Konvertera bilder till 8-bitars filer, ta bort bakgrunden och göra dem binära genom att ange ett tröskelvärde. Behandla minst tre cell kondensat per villkora av tre oberoende prover.
- Kvantifiera FA proteinet missfärgade områden från den basala zonen av cell kondensat och uttrycka dem i motsvarande procent av området dividerat med antalet cellkärnor i bilden.
- För att mäta COL2A1 färgning, Använd confocal z-projektionerna och kvantifiera summan av den projicerade ytan (maximal COL2A1 område per prov). Normalisera område värdet erhålls mot området i motsvarande kondensatet.
8. kvantitativ omvänd Transkription-polymerasen kedjar reaktion (qRT-PCR) analys
Obs: För att förhindra RNase kontaminering, använda disponibla, sterila plastartiklar och Använd engångshandskar vid hantering av reagenser och RNA. Alltid använda rätt mikrobiologiska aseptisk teknik och använder en lämpliga dekontaminerings lösning ta bort RNase kontaminering från arbetsytor och icke-engångstyp poster såsom centrifuger och pipetter.
- Isolera total-RNA och pulverisera det i en RNA-ämnen. Behandla RNA prover med DNAS och omvandla dem till cDNA med en cDNA syntes kit.
- Genomföra qRT-PCR med primers för Transkriptionfaktorn SOX9. Beta-2-mikroglobulin (B2M) och ribosomala proteinet L13a (RPL13a) kan användas som städning gener.
- Beräkna uttrycksnivåerna och normalisera dem mot den negativa kontrollen (PLLA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar en nanopatterning metod som möjliggör ytans vidhäftningsförmåga tas upp på nanonivå (figur 1). RGD-Cys-D1 kemiska struktur visas i figur 1A. Tåååålamooooooood var mönstrad på elektriskt ledande Au(111) ytor för högupplösta STM karakterisering. Låg dendrimer koncentration i lösning (upp till 10-5% w/w) återges isolerade tåååålamooooooood av 4-5 nm i diameter (figur 1B), medan mycket packade dendrimer aggregat bildas vid högre koncentrationer (figur 1 c). AFM ytan karakterisering (Siffrorna 1 D-G, övre raden) avslöjade att ytan fördelningen av RGD-Cys-D1 tåååålamooooooood kan justeras som en funktion av den ursprungliga dendrimer koncentrationen i lösning. På sannolikheten kontur kartor för dminresulterar detta i olika lokala RGD nanoskala tätheter på ytan (Siffrorna 1 D-G, nedre raden).
I cell kultur experiment, i cellmembranet receptorn integriner cirka 10 nm i diameter erkända RGD sekvensen tåååålamooooooood periferi. Trots åtta exemplar av denna sekvens lämnats per dendrimer, interagerat endast en dendrimer per integrin på grund av dess storlek (4-5 nm mätt med STM; Figur 1B). Det vill säga föreskrivs varje dendrimer en enda plats integrin bindande, därmed möjliggör en direkt korrelation från dendrimer distribution (som sett i AFM bilder) och RGD distribution tillgänglig för celladhesion. Dessutom hittades inga betydande variationer i de CA-värden som erhållits för de olika nanopattern-konfigurationer som kan påverka cell adhesion29. Dessa egenskaper gör dendrimer nanopatterns på biokompatibla ytor lämpliga substrat som modulerar och studera cell beteende.
Celladhesion till nanopatterned Au(111) testades med fibroblaster inom de första 24 h av kultur (figur 2A) och MSCs på nanopatterned PLLA (figur 2B). I båda fallen procentandelen av området färgas för den FA proteinet paxillin (pax) ökade successivt med dendrimer koncentration, liksom lokala RGD Ytors (andelen nanopatterned område med dmin under tröskeln 70-nm för effektiv celladhesion; (Se tabell 4). För en inledande dendrimer koncentration av 10-2% w/w och positiva kontroller, procentandelen av området färgas för pax per cell minskade och sambandet med procentandelen av nanopatterned område med dmin < 70 nm förlorades.
Procentandelen av ytan upptas av dmin < 70 nm (figur 1 d-G nedre raden och tabell 4) är en bra indikation på lokala RGD Ytors för nanopatterns upp till 10-5% w/w inledande dendrimer koncentration men inte av de upp till 10-2% w/w, på grund av dendrimer aggregation. Aggregation produceras mycket heterogena prover i form av liganden distribution, med endast en liten andel av ytan med dmin värden under tröskeln 70-nm (figur 1 d nedre raden och tabell 4). XPS resultaten visade att dessa ytor presenterar en global RGD densitet jämförbar med 10-5% w/w-härledda nanopatterns28. Denna observation visar att maximal RGD densitet uppnåddes i de regioner som innehåller dendrimer aggregat och att andelen yta upptas av dmin < 70 nm är inte representativ för lokala RGD Ytors i detta fall.
Observationen att positiva kontroller (homogen beläggningar) med högsta lokala RGD Ytors inte visade den förväntade ökningen i celladhesion kan hänföras till en sterisk hinder effekt. Dessa resultat tyder på att, jämfört med motsvarande homogena ytor vanligen används i cellkultur, RGD nanopatterns upprätthålla celladhesion mer effektivt. Detta konstaterande belyser således relevansen av lokala ligand densitet.
Interaktion med den omgivande miljön i morfogenes utlösa första cell differentiering händelserna och sprida dem till upprättandet av de slutliga komplexa vävnad strukturerna. För att utvärdera effekterna av dendrimer nanopatterns på celladhesion och differentiering, använde vi chondrogenic induktion av MSCs som en modell. Under kondrogenes finns aktiv matris remodeling, som spelar en lärorik roll i att styra celler genom olika stadier av brosk bildas.
MSCs genomgick kondrogenes på nanopatterns (figur 3). Chondrogenic differentiering börjar med en cell kondens steg, som innebär att cellen rekrytering för att bilda täta kondensat, inrättandet av cell-till-cell kommunikation och samtidig förändringar i cell morfologi33. Figur 3A visar cellen kondens inträffade i alla substratesna och att kondensat ökade i området med ökande dendrimer koncentrationen upp till 2,5 x 10-8% w/w området kondensat minskade därefter igen för en dendrimer koncentration av 10-2% w/w och för den positiva kontrollen. Cell kondens steget i kondrogenes uppstår genom aktiv cell rörelse snarare än genom en ökning av cell spridning34. Denna cell rörelse gynnas av flexibla vidhäftning med substratet: stabil sammanväxningar bör bildas för att tillåta traction krafter att flytta cellkroppen, och på samma gång, dessa sammanväxningar bör vara tillräckligt svag för att tillåta cellen release från underlaget under rörelse. Cell kondens gynnas av en ökning i lokala RGD Ytors upp till 2.5x10-8% w/w-härledda nanopatterns, med en bra balans mellan celladhesion och cellers rörelser. För 10-2 och den positiva kontrollen var lokala Läsvärdet Ytors för hög och därmed försämra händelsen kondens.
Chondrogenic differentiering intäkter från prechondrogenic kondensat: celler i kondensat blir mer rundade och starta syntesen av brosk specifika markörer såsom proteinet ECM COL2A1 och transkription faktorn SOX933, 34 , 35. Följaktligen substrat med en mellanliggande vidhäftning, gynnar bildandet av cell kondensat och visade högre COL2A1 färgning (figur 3B) och högre nivåer av SOX9 mRNA uttryck (figur 3 c).
Våra resultat belysa påverkan av cell-cell matrix interaktioner under de tidiga stadierna av chondrogenic differentiering. Sådana interaktioner kan enkelt hanteras genom dendrimer-baserade nanopatterns.
| Steg | Tid (s) | Varvtal (rpm) | Acceleration (rpm/s) |
| 1 | 5 | 500 | 300 |
| 2 | 30 | 3 000 | 1 500 |
Tabell 1: Spinner programstegen används för att bestryka glas glasen med den beredda lösningen PLLA. Ett första homogenisering steg användes på 500 rpm med en acceleration av 300 rpm/s för 5 s. följt av en sista steget vid 3.000 rpm med en acceleration av 1.500 rpm/s till 30 s.
| Lösning | RGD-Cys-D1 (mg/mL) | RGD-Cys-D1 (mg) | MQ vatten (µL) |
| A | 0,77 | 5 | 6,494 |
| RGD-Cys-D1 (% w/w) | Lösning ett (µL) | ||
| B | 10-2 | 779 | 5,220 |
| C | 10-5 | 0,78 | 6.000 |
| Lösning C (µL) | |||
| D | 2,5 x 10-8 | 15,0 | 5,985 |
| E | 10-8 | 6.0 | 5,994 |
| F | 4 x 10-9 | 2.4 | 5,998 |
Tabell 2: Detaljer för utarbetandet av de RGD-Cys-D1 lösningar används. En stamlösning av RGD-Cys-D1 tåååålamooooooood var beredd med en slutlig koncentration på 0,77 mg/mL (lösning A), som utarbetades lösningar B och C på 10-2 och 10-5% w/w koncentrationer. C lösning med en 10-5% w/w koncentration av RGD-Cys-D1 dendrimer användes för att utarbeta lösningar D, E och F i slutliga koncentrationer på 2,5 x 10-8, 10-8 och 4 x 10-9%w/w, respektive.
| Namn | Volym (µL) | Blockerande buffert (mL) | |
| Primära mix | Kanin mAb till pax | 65 | 12.870 |
| Mus mAb till COL2A1 | 32,5 | ||
| Sekundära mix | Alexa Fluor 488 get antimus | 13 | 12.961 |
| Alexa Fluor 568 get anti-kanin | 13 | ||
| Hoechst lösning | 13 |
Tabell 3: antikropp lösning förberedelse. Den primär antikropp blandning innehöll monoklonal antikroppen mot pax produceras i kanin utspädd 1: 200 i blockerande lösningen med monoklonal antikropp mot COL2A1 som produceras i mus utspädd 1: 400 i blockerande lösningen. Sekundära antikroppar blandningen innehöll cell atomkärnor fläcken Hoechst och de sekundära antikropparna produceras i get mot mus och kanin respektive (märkt med Alexa Fluor 488 och 568 fluorophores, respektive).
Figur 1 : RGD-Cys-D1 dendrimer nanopatterning för nanoskala kontroll av lokala RGD Ytors. (A) RGD-Cys-D1 dendrimer struktur som innehåller upp till åtta exemplar av cell självhäftande RGD peptiden. Representant STM bilder (bias = 200 mV, börvärde = 0,5 nA) av RGD-Cys-D1 nanopatterns på Au(111) från en inledande vattenlösning av 10-8% w/w (skalstapeln = 3 nm, B) och motsvarande höjd-avstånd profil framställs på den streckade regionen som anges i (B)och (C) 10-2% w/w visar dendrimer aggregation (skalstapeln = 20 nm). (D-G) Representant AFM bilder av RGD-Cys-D1 nanopatterns på PLLA erhålls från de motsvarande dendrimer vattenlösningar av 10-2%, 2,5 x 10-8%, 10-8%och 4 x 10-9% w/w, respektive (skalstapeln = 1 µm). Motsvarande interparticle minimiavstånd (dmin) sannolikheten konturen kartan visas nedanför varje AFM bilden, med hög densitet RGD regioner som visas i mörkröd (dmin < 70 nm). Tåååålamooooooood och dendrimer aggregat är avbildad i svart för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cell adhesion på den RGD-Cys-D1 nanopatterns. Rita av procentandelen av området färgas för FA protein pax per cell för cellerna i kontakt med substratet (vänster axel) med inledande dendrimer koncentration. Värden jämförs med lokala RGD Ytors (procent av ytan i den nanopatterns som innehåller dmin värden under tröskeln 70 nm) (höger axel) med 100 och 0 procentsatser som tilldelats positivt (+ kontroll) och negativa (- Control) kontrollerar, respektive. (A) Fibroblast vidhäftning på dendrimer nanopatterns på Au(111) efter 4,5 h av kultur. (B) MSC vidhäftning på dendrimer nanopatterns på PLLA utvärderas på dag 1 av chondrogenic induktion. Värdena anges som medelvärdet med standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| RGD-Cys-D1 (% w/w) | Område (< dmin = 70 nm) (%) på Au(111) | Område (< dmin = 70 nm) (%) på PLLA |
| 10-2 | 5 ± 1 | 2 ± 2 |
| 10-5 | 97 ± 2 | |
| 2, 5 x 10-8 | 65 ± 11 | 90 ± 2 |
| 10-8 | 25 ± 16 | 45 ± 7 |
| 4 x 10-9 | 18 ± 11 |
Tabell 4: andel av området med d min värden under 70 nm erhållits för RGD-Cys-D1 dendrimer nedfall på Au(111) och på PLLA ytor som en funktion av de ursprungliga dendrimer koncentrationer används.
Figur 3 : Chondrogenic differentiering av MSCs på den RGD-Cys-D1 nanopatterns. (A) kondensation av MSCs odlade på RGD-Cys-D1 nanopatterns på PLLA efter 5 dagar av chondrogenic induktion. Representativ epifluorescence bilder av färgade cellkärna (Hoechst; Skalstapeln = 300 µm; övre raden) och tomt på området i cell kondensat (nedre raden) erhålls på RGD-Cys-D1 nanopatterns från olika inledande dendrimer koncentrationer. Differentiering fortsätter från cell kondens steg med uttryck för specifika chondrogenic markörer: (B) andelen området av COL2A1 färgning normaliserade med området av cell kondensatet från motsvarande confocal z-projektionerna erhållits efter 5 dagar av chondrogenic induktion. (C) relativ SOX9 mRNA uttryck (mot negativ kontroll) efter 3 dagar av chondrogenic induktion. Värdena anges som medelvärdet med standardavvikelsen i (B) och (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under utvecklingen av protokollet beskrivs övervägas ett antal kritiska åtgärder. Först avser nanopattern karakterisering med scanning sonden mikroskopi tekniker. För att visualisera nanopatterns, ytan där mallning produceras måste ha ojämnheter värde understiger genomsnittlig diametern på den tåååålamooooooood, vilket är omkring 4 – 5 nm mätt med STM (figur 1B). Också, det bör beaktas att hög upplösning STM imaging är begränsad till ledande substrat, i detta fall Au(111). Några lyft av polymeren från hörnen på bilden efter spin-beläggningen kan rättas med biokompatibel lim.
Dendrimer nanopatterning är en process genom vilken att uppnå kontrollerad lokala cell vidhäftning på nanonivå. Baserat på den självmontering av tåååålamooooooood på ytan av adsorption, denna teknik kräver inte någon utrustning för komplexa nanopatterning, således kontrasterar mot tidigare beskrev litografi-baserade metoder36,37, 38. Dendrimer nanopatterning enkelt kan skalas till stora ytor och är fullt kompatibel med cell kultur protokoll.
Den dendrimer nanopatterning metod som beskrivs här kan hitta framtida tillämpningar inom regenerativ medicin. Den kontroll som utövas av dendrimer nanopatterning på cell vidhäftning gör denna teknik lämpar sig för villkora av biomaterial före implantation, därmed underlätta deras integrering värd vävnader. Dessutom gör den lätthet med vilken dendrimer perifera delarna kan ändras dendrimer nanopatterning lämplig för andra ligander som utöva koncentrationsberoende aktivitet på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Oriol Font-Bach och Albert G. Castaño för deras hjälp i dmin kvantifiering. De erkänner också avancerad Digital mikroskopi enheten vid Institutet för forskning inom biomedicin (IRB Barcelona) att låta författarna spela in video i sina lokaler. Detta arbete stöds av de nätverk biomedicinsk forskning Center (CIBER), Spanien. CIBER är ett initiativ som finansieras av den VI nationella R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER åtgärder och Instituto de Salud Carlos III, med stöd från Europeiska regionalutvecklingsfonden. Detta arbete har stötts av kommissionen för universitet och forskning av Institutionen för Innovation, universitet, och företaget av Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Det har också finansierats av projekt OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) och CTQ2013-41339-P, delas ut av det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft, i tillägg till INTERREG V-A Spanien-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkänner ekonomiskt stöd från det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft grant (nr. IFI15/00151).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 - dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
