Summary
نحن هنا وصف مقايسة البلعمة باستخدام الخلايا الجنينية فرقت من ذبابة الفاكهة . أنها تمكننا من تحديد بسهولة ودقة في مستويات البلعمة في الجسم الحي ، وتحديد جزيئات جديدة مطلوبة للبلعمة من الخلايا أبوبتوتيك.
Abstract
الآليات الجزيئية الكامنة وراء البلعمة من الخلايا المبرمج تحتاج إلى توضيح أكثر تفصيلا بسبب دورها في الأمراض المستعصية المناعية والالتهابية. نحن هنا وضعت طريقة تجريبية للتحقيق البلعمة كميا باستخدام ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ، والتي يتم الحفاظ على شبكة الجينات التي تسيطر على تفاعلات إفراز من الناحية الدستورية من الثدييات. من أجل الكشف بدقة والاعتماد ابتلاع و أون-فولشينغ البالعات باستخدام الحيوانات بأكملها، تم تجانس الأجنة ذبابة الفاكهة للحصول على الخلايا المشتتة بما في ذلك البالعات والخلايا الأبوطوزية. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات الكريات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي من الممكن لمراقبة جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة وتحديد بدقة مستوى البلعمة. وأكدنا أن هذه الطريقة تستنسخ تلك الدراسات السابقةالتي حددت الجينات المطلوبة لبلعمة الخلايا المبرمج. هذا الأسلوب يسمح إغراق الخلايا الميتة ليتم تحليلها، وعندما جنبا إلى جنب مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة ، وسوف تكشف عن تفاعلات البلعمة المعقدة تتألف من الهجرة، والاعتراف، إنغولفنت، وتدهور الخلايا الأبوطوزية من قبل البالعات.
Introduction
في الحيوانات ميتازوان، على سبيل المثال النيماتودا كينورهابديتيس ايليجانس ، ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، والفئران والبشر، وعدد كبير من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج أثناء التنمية لتشكيل أجسامهم وفي مرحلة البلوغ للحفاظ على التوازن 1 ، 2 . الخلايا الأبوطوزية تحتاج إلى إزالتها بسرعة لأنها تحفز الالتهاب في الأنسجة المحيطة بها عن طريق الإفراج عن المواد المناعية داخل الخلايا إذا لم تتم إزالتها تماما 3 . من أجل تسهيل الإزالة السريعة، والخلايا أبوبتوتيك الحاضر ما يسمى أكل لي إشارات التي يتم التعرف عليها من قبل مستقبلات إنغولفنت من البالعات، ويتم القضاء عليها من قبل البلعمة 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وهكذا، البلعمة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن المضيف، وبالتالي، توضيح الجزيئية آليات لار الكامنة وراء البلعمة من الخلايا الأبوطوزية أمر ذو أهمية.
ويبدو أن الآليات المسؤولة عن البلعمة من الخلايا أبوبتوتيك محفوظة من الناحية الدستورية بين الأنواع في الديدان الخيطية والذباب والفئران 7 . العديد من المقايسات البلعمة متوفرة حاليا لتقييم تجتاح الخلايا المبرمج في هذه الحيوانات نموذج. في C. ايليجانس ، 131 الخلايا الجسدية الخضوع لعملية موت الخلايا المبرمجة خلال التنمية، وجثث الخلايا هي فاغوسيتوسد الخلايا المجاورة، والتي هي البالعات غير المهنية 8 . وهكذا، عد عدد جثث الخلايا المتبقية في C. ايليجانس يشير إلى مستوى البلعمة في الجسم الحي . من خلال البحث عن المسوخ النيماتودا التي تظهر عددا متزايدا من الخلايا الميتة، تم تحديد العديد من الجينات اللازمة لبلعمة وميز وراثيا 9 ، 10 ،s = "كريف"> 11 ، 12 .
السابقين فيفو مقايسات البلعمة مع البالعات الثقافة الأولية، الضامة عموما، وغالبا ما تستخدم في الفئران. يتم إعداد الخلايا الأبوطوزية باستخدام خطوط الخلايا مثل خلايا جوركات، ويتم خلطها مع البالعات الأولية. بعد حضانة لعدة ساعات، يتم حساب العدد الإجمالي للبالعات والبكم البالعات من أجل تقييم مستوى البلعمة. كتعديل متطور لهذه الطريقة، وضعت مجموعة ناغاتا مقايسة البلعمة خارج الجسم الحي مع الخلايا معربا عن إيكاد مقاومة كاسباس (المانع من الدناز تفعيلها كاسباس)، التي الخلايا الخمجية لا تخضع لتجزئة الحمض النووي موت المبرمج، ولكن لا يزال المشقوق الحمض النووي عندما الخلايا هي فاغوسيتوسد. عندما يتم استخدام هذه الخلايا كأهداف أبوبتوتيك في فحص البلعمة، فقط الحمض النووي للخلايا أبوبتوتيك اجتاحت هو مجزأة، وملطخة من قبل توسط بوساطة دوتب نيك نهاية وضع العلامات (تونيل). لذلك، ليفلتر من إنبولفنت الخلايا الخلوية يقاس من خلال عد إشارات تونيل في خليط من الخلايا البالعات والخلايا أبوبتوتيك 13 .
في D. ميلانوغاستر ، البالعات المهنية اسمه خلايا الدم، الضامة ذبابة الفاكهة ، هي المسؤولة عن البلعمة من الخلايا المبرمج 14 ، 15 . بالإضافة إلى المقايسات في البلعمة في المختبر مع خطوط الخلايا الثقافة، في المقايسات في البلعمة الجسم الحي مع الأجنة ذبابة الفاكهة كلها متوفرة. الأجنة ذبابة الفاكهة هي أداة قوية لفحص مستوى انحلال الخلايا المبرمج لأن العديد من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج و فاجوسيتوسد من قبل خلايا الدم خلال التطور الجنيني 14 ، 15 ، 16 . مثال على في الجسم الحي فحص البلعمة هو الأسلوب الذي وضعته مجموعة الفرنك. في طريقتهم، هيموسيتس ديالتي يقودها المناعية من بيروكسيداسين، علامة الخلايا الهضمية، والملطخة الخلايا الأبوطوزية باستخدام الصبغة النووية، 7-أمينو أكتينوميسين D في الأجنة ذبابة الفاكهة كاملة، وعدد من الخلايا الإيجابية مزدوجة تحسب كإشارة من البلعمة 17 . ويستند مثال آخر على فحص البلعمة على الأجنة على مفهوم طريقة ناغاتا المذكورة أعلاه؛ ومع ذلك، يتم تقييمها في الجسم الحي البلعمة باستخدام أجنة dCAD (ذبابة الفاكهة كاسباس تنشيط الدناز) متحولة الذباب 18 و 19. هذه المقايسات في البلعمة الجسم الحي مفيدة لمراقبة مباشرة البلعمة في الموقع . ومع ذلك، ترتبط الصعوبات مع استبعاد أي تحيز ممكن في خطوة عد الخلايا البلعمة لأنه من الصعب أن نلاحظ جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة بسبب سمكه.
من أجل التغلب على هذا القيد، ونحن نطورإد مقايسة البلعمة الجديدة في الأجنة ذبابة الفاكهة . في طريقة لدينا، من أجل الاعتماد بسهولة هيموسيتس البلعمة، يتم تجانس الأجنة كلها لإعداد الخلايا الجنينية فرقت. يتم الكشف عن البالعات بواسطة المناعية من علامة البلعمة، ويتم الكشف عن الخلايا المبرمج بواسطة تونيل مع هذه الخلايا الجنينية المشتتة. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي يحدد بدقة مستوى البلعمة. ويمكن استخدام جميع الأنماط الجينية للذباب في هذا الفحص إذا تطورت إلى المرحلة 16 من الأجنة 20 ، والمرحلة التنموية التي إزالة الخلايا المبرمج من البلعمة هو الأكثر وفرة. هذه الطريقة لديها ميزة تقييم مستوى البلعمة كميا، وبالتالي، يمكن أن تسهم في تحديد جزيئات جديدة تشارك في البلعمة من الخلايا الأبوطوزية في الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
- إعداد لوحات أجار عصير العنب الطازج
- إضافة 100 مل من الماء إلى 4.4 غرام من أجار، وتسخين الخليط في فرن الميكروويف لحل آجار.
- إضافة 80 مل من عصير العنب الطازج، 5 مل من حمض الخليك، و 5 مل من الإيثانول إلى محلول أجار.
- صب حوالي 1.5 مل من الحل مع ماصة على كل شريحة زجاجية، والسماح لها لتصلب.
- إعداد 6 سم أطباق الاغاروز طبق
- إضافة 50 مل من الماء إلى 0.5 غرام من الاغاروز، وتسخين الخليط في فرن الميكروويف لذوبان الاغاروز.
- صب حوالي 2.5 مل من محلول الاغاروز على طبق 6 سم مع ماصة.
2. المرحلة 16 مجموعة الجنين
- جمع الذباب الكبار، وإضافة 200 أنثى و 200 من الذكور في أنبوب مخروطي 50 مل.
- وضع لوحة من أجار عصير العنب الطازج على الخميرة في أنبوب 50 مل، وإغلاق مع الإسفنج كاص.
- احتضان الذباب في 16 درجة مئوية في ضوء لمدة 2 - 3 أيام. تغيير لوحة مرة واحدة في اليوم.
- نقل الذباب إلى الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تغيير لوحة القديمة إلى واحدة جديدة دون الخميرة. السماح الذباب لوضع البيض لمدة 2 ساعة.
- جمع لوحة واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 26 ساعة.
- جمع الأجنة من لوحة مع فرشاة الطلاء في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
- غسل الأجنة مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
- من أجل إزالة المشيماء، إضافة 1.2 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم (2.2 - 3.4٪ كل) إلى الأجنة لمدة 3 دقائق.
- غسل الأجنة 4 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100.
- وضع الأجنة على طبق الاغاروز 6 سم طبق. التقاط المرحلة 16 الأجنة تحت المجهر كما هو موضح من قبل روبرتس 20 . جمع ما يقرب من 50 الأجنة في 1.5 مل تريف أنبوب الاختبار الجزئي مع ميكروبيبيت.
3. بريباحصص الخلايا الجنينية
- غسل الأجنة مرتين مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- التجانس الأجنة 30 مرات في 1.5 مل أنبوب الاختبار الجزئي وخلاط بيليه في وجود 200 ميكرولتر من كولاجيناز (0.25٪ (ث / ت)) في برنامج تلفزيوني.
- تفريق الخلايا الجنينية بيبتينغ 10 مرات، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي في 1400 × ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من التربسين (0.25٪ (ث / ت)) في برنامج تلفزيوني للخلايا. تفريق الخلايا الجنينية بواسطة بيبتينغ 50 مرة.
- رشح تعليق الخلية مع 70 ميكرون خلية مصفاة.
- من أجل وقف النشاط التربسين، إضافة 40 ميكرولتر الحرارة المعطل مصل البقري الجنين إلى تعليق الخلية المرسلة. إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 1400 x ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة سوبيرناتانت، وتعليق الخلايا عجلت في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في 1400 x ز في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف، وتعليق الخلايا عجلت في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- جبل تعليق خلية أعدت على الشرائح الزجاجية المغلفة ثلاثي أكسيدكسيلان أمينوبروبيل، والانتظار لمدة 10-15 دقيقة حتى تعلق الخلايا على الشرائح الزجاجية.
- إزالة الحل المتبقي على الشرائح الزجاجية مع ماصة. جبل 60 - 70 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ (ث / ت) بفا (بارافورمالدهيد) على الخلايا لمدة 10 - 15 دقيقة للتثبيت.
- إزالة الحل التثبيت، ووضع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لأكثر من 1 دقيقة.
4. تلطيخ من خلايا الدم
- إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت
- متسلسل نقع الشرائح الزجاجية في الميثانول لمدة 10 دقيقة، في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة، وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- جبل 20 ميكرولتر من 5٪ (الخامس / الخامس) المصل الخنازير كله في برنامج تلفزيوني احتواءنغ 0.2٪ (v / v) تريتون X-100 على الخلايا لحجب. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من مصل مضاد للفصيلة كروكيمورت 19 ، 21 (0.1٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا. احتضان الشرائح في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- جبل 20 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية المسمى المضادة للفئران مفتش (0.5٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 و 5٪ (ت / ت) مصل الخنازير كله على الخلايا في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
- نقع الشرائح الزجاجية في العازلة التي تحتوي على 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 لمدة 10 دقيقة.
- جبل محلول الركيزة الفوسفاتيز التي تحتوي على 0.23 ملغ / مل 5 برومو -4كلورو-3-إندوليل-فوسفات (بسيب) و 0.35 مغ / مل نيترو الأزرق تيترازوليوم (نبت) و 100 ملي تريس-هكل ودرجة الحموضة 9.5 و 100 ملي كلوريد الصوديوم و 50 ملي مغكل 2 على الخلايا.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر لالتلطيخ السليم. عندما تظهر إشارات الأرجواني قوية في حبيبات الخلايا الدموية، وإزالة الحل الركيزة، ونقع الشرائح الزجاجية في المخزن المؤقت تتكون من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 و 1 ملي إدتا. تلوين لحوالي 5-10 دقيقة ينصح.
- إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة غفب (خيار آخر لتلطيخ الخلايا الدموية)
- متسلسل نقع الشرائح الزجاجية في الميثانول لمدة 10 دقيقة، برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة، وبرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- جبل 20 ميكرولتر من 5٪ (الخامس / الخامس) المصل الخنازير كله في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا لحجب. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- إزالة الحل على الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة غفب الماوس (1٪ (الخامس / الخامس)) / برنامج تلفزيوني جالحصول على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 على الخلايا. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- جبل 20 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية المسمى المضادة للفأر مفتش (0.5٪ (الخامس / الخامس)) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 و 5٪ (ت / ت) مصل الخنازير كله على الخلايا في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ (ت / ت) تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة 5 مرات.
- نقع الشرائح الزجاجية في العازلة تتكون من 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 لمدة 10 دقيقة.
- جبل محلول الركيزة الفوسفاتيز تحتوي على 0.23 ملغ / مل بسيب، 0.35 ملغ / مل نبت، 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي مغكل 2 على الخلايا.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر لالتلطيخ السليم. عندما تظهر إشارات الأرجواني في هيموسيتس كاملة، وإزالة الحل الركيزة ونقع الشرائح في المخزن المؤقت تتكونمن 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، PH8.5 و 1 ملي إدتا. ويوصى تلطيخ لمدة 10-15 دقيقة تقريبا.
5. الخلايا الأبوطوزية وصمة عار بواسطة تونيل
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- كرر مع برنامج تلفزيوني جديد.
- جبل موازنة العازلة (انظر المواد الجدول) على الخلايا لمدة 10 دقيقة.
- إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، وجبل 20 ميكرولتر من حل تدت تحتوي على 5 ميكرولتر من محطة ديوكسينوكلأوتيديل ترانسفيراز و 15 ميكرولتر من رد فعل العازلة على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إزالة الحل من الشرائح الزجاجية، ونقع الشرائح في العازلة تتكون من 0.5 مل ستوب / غسل العازلة و 17 مل من الماء.
- نقع الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3 مرات.
- جبل 20 ميكرولتر من مكافحة ديغوكيجينين-بيروكسيداز على الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- نقع الشرائح الزجاجية في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 4 مرات.
- نقع الشرائح الزجاجية في محلول الركيزة البيروكسيديز تتكون من 30 مل من 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، pH7.5 كونتينغا كامل ملعقة صغيرة من 3،3'- ديامينوبنزيدين تيترايدريكلوريد (داب)، و 0.002٪ (V / V) H 2 O 2 لمدة 30 ثانية.
- كرر الخطوة 5.9 حتى الخلايا الملطخة هي البني الملون. نقع الشرائح الزجاجية في الماء لوقف رد فعل البيروكسيديز.
- أرفق الخلايا بالماء للمراقبة.
6. قياس مستوى البلعمة من الخلايا أبوبتوتيك
- مراقبة العينات تحت المجهر الضوئي من أجل تقييم مستوى البلعمة. عد الخلايا إيجابية كروكيمورت أو خلايا إيجابية غفب كما خلايا الدم، الخلايا الإيجابية تونيل والخلايا الأبوطوزية، وخلايا إيجابية مزدوجة كما هيموسيتس البلعمة.
- ويعرف مؤشر البلعمة على أنه عدد الخلايا الإيجابية المزدوجة إلى العدد الإجمالي للخلايا إيجابية كروكيمورت أو الخلايا إيجابية غفب. فمن المستحسن أن يلاحظ أكثر من 300 هيموسيتس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل دراسة البلعمة من الخلايا المبرمج، تم جمع الأجنة ذبابة الفاكهة من المرحلة التنموية 16 وأعدت الخلايا كما فرقت. كانت ملطخة الضامة، الضامة ذبابة الفاكهة ، من قبل إمونوسيتوشيميستري للعلامة كريات الخلايا "كروكيمورت" 17 ، 22 باستخدام الأجسام المضادة محددة 19 ، 21 ، وخلايا الأبوطوزية ملطخة بواسطة تونيل في الخلايا الجنينية فرقت ( الشكل 1A ). كروكيمورت، مستقبلات ذات الصلة ذبابة الفاكهة CD36، وأعرب على وجه التحديد على جميع خلايا الدم الجنينية 22 ، وقد ثبت وراثيا للمشاركة في إزالة الخلايا المبرمج في أجنة ذبابة الفاكهة 17 . الخلايا الإيجابية للروكيمورت لها إشارات أرجوانية في حبيبات صغيرة من خلاياها. تونيل إيجابية الخلايا تظهر أبإشارة التاج في مجملها. الخلايا التونيل إيجابية أصغر من الخلايا الأخرى، وبعضها داخل الخلايا إيجابية كروكيمورت، والتي تعتبر الخلايا الميتة فاغوسيتوسد. بين 2 و 10٪ خلايا إيجابية كروكيمورت وخلايا 1-5٪ تونيل إيجابية وعادة ما يلاحظ في جميع الخلايا الجنينية.
في ذبابة الفاكهة ، وهناك مسارين الإشارات لإبتلاع الخلايا الأبوطوزية. مستقبلات البلعمة اثنين من المسارات المقابلة، درابر و إنتغرين α PS3 β ν، والتعرف بشكل مستقل الخلايا الميتة 19 ، 21 ، 23 ، 24 ، 25 . درابر هو بروتين الغشاء الذي يمتلك غير نمطية عامل نمو البشرة (إغف) تسلسل يشبه في المنطقة خارج الخلية والزخارف الفسفورية اثنين نبكسي و يكسل في طنتراسيلولار جزء 26 . إنتغرين α PS3 β ν هو أيضا مستقبلات الغشاء تتكون من هيتيروديمر من α و β الوحدات الفرعية 25 . ويبين الشكل 1B نسبة الخلايا الدموية البلعمة إلى هيموسيتس الكلي في البرية من نوع أو دربر أو إتغبن الأجنة متحولة واحدة. من خلال عد جميع الخلايا إيجابية كروكيمورت (هيموسيتس الكلي) و كروكيمورت و تونيل مزدوج الخلايا الإيجابية (هيموسيتس بلعمية)، قمنا بحساب مؤشر البلعمة كما عدد الكريات البلعمة إلى العدد الإجمالي للالدمويات. وكان مؤشر البلعمة أقل في دربر أو إتجبن متحولة من في نوع البرية، في حين أن أعداد الخلايا الدموية والخلايا المبرمج كانت مماثلة ( الشكل 1C -D )، مشيرا إلى أن هذه الجينات اثنين مطلوبة ل إنبولفنت الخلايا المبرمج، كما كان سابقا reported.
عندما لا يتم العثور على الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت أو خطوط متحولة مع التعبير كروكيمورت تغيرت، ونحن بحاجة إلى تحديد خيار آخر للكشف عن خلايا الدم. الأجنة مع سائق GAL4 يسيطر عليها المروج محددة الخلايا الدموية ( سرفيمو-GAL4 )، والجين غفب التي تسيطر عليها تسلسل تفعيل المنبع (واس) بما في ذلك موقع الربط GAL4 ( واس-إغف )، لديها غمب المسمى خلايا الدم 27 ، والتي تمكننا من الكشف عن خلايا الدم باستخدام مكافحة غفب. ويبين الشكل 2A صورة تم الحصول عليها بعد الكشف عن خلايا الدم والخلايا المبرمج مع المناعية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة غفب، وتونيل في الخلايا الجنينية مع سرفيمو-GAL4UAS-إغف . في حين أن الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت بقع حبيبات صغيرة في الخلايا، والأجسام المضادة لمكافحة غفب البقع خلايا الدم كلها. على غرار الشكل 1A ، 2 - 6٪ غفب إيجابية الخلايا و 1 - 5٪ تونيل إيجابية ويلاحظ الخلايا في جميع الخلايا الجنينية. تم الكشف عن بعض الخلايا إيجابية تونيل داخل الخلايا إيجابية غفب، والتي تعتبر الخلايا الميتة فاغوسيتوسد. يتم تطبيق ضربة قاضية بوساطة رني بسهولة لتقييم أي جينات لمشاركتهم في البلعمة عن طريق عبور الذباب مع واس-الرنا المزدوج الجديلة من الجينات المرشحة مع سرفيمو-GAL4UAS-إغف . و ضربة قاضية رني بوساطة دربر أو إتغبن خفض مؤشر البلعمة ( الشكل 2B )، في حين أن أعداد خلايا الدم والخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية كانت قابلة للمقارنة ( الشكل 2C -2D )، مشيرا مرة أخرى إلى أن هذه المستقبلات البلعمة وتشارك في البلعمة من الخلايا الأبوطوزية. يتم الحصول على فهارس البلعمة مماثلة من كل من طرق الكشف عن الكريات الدموية، مما يشير إلى أن كلا متوافقة.
g "/>
الشكل 1 : تلطيخ الخلايا الجنينية من قبل الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت وتونيل. ( A ) صور الحقل مشرق من الخلايا الجنينية فرقت من سلالة 1118 ث بواسطة إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة كروكيمورت وتونيل. وتظهر آراء مكبرة من ممثل الملون بشكل إيجابي أو سالب الخلايا (أعلى 4 لوحات) ومجال الطاقة المنخفضة (لوحة أسفل). الحانات مقياس، 5 ميكرون (أعلى). 50 ميكرون (أسفل). تم تحليل (B) نسبة hemocytes Croquemort إيجابية مع الإشارة النفق لجميع hemocytes Croquemort إيجابية في drpr أو Itgbn متحولة مع الخلايا الجنينية المتفرقة. ( C ) تم تحليل نسبة الكريات البيض إيجابية الكروكيمورت لجميع الخلايا في دربر أو متحولة إتغبن مع الخلايا الجنينية فرقت. ( D ) نسبة الخلايا توتيل إيجابية الخلايا المبرمج لجميع الخلايا في دربر أوتم تحليل إتبن متحولة مع الخلايا الجنينية المشتتة. المورثات. ث 1118 (البرية من نوع السيطرة)، دربر Δ5 ( دربر متحولة)، و إيتجن 2 (إنتغرين β ν متحولة). وكانت البيانات ممثلة ثلاث تجارب مستقلة وتحليلها من قبل t- الاختبار. وقد لوحظت حوالي 300 هيموسيتس إيجابية كروكيمورت في كل تجربة، والقيم تمثل متوسط ± سد من ثلاثة مجالات المجهرية. *؛ ص <0.05، نس؛ الفرق ليست كبيرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تلطيخ الخلايا الجنينية بواسطة النملةi-غفب و تونيل. ( A ) صور الحقل مشرق من الخلايا الجنينية المشتتة من سلالة سرفيمو-GAL4UAS-إغف / + بواسطة إمونوستينينغ مع الأجسام المضادة لمكافحة غفب وتونيل. وتظهر آراء مكبرة من ممثل الملون بشكل إيجابي أو سالب الخلايا (أعلى 4 لوحات) ومجال الطاقة المنخفضة (لوحة أسفل). مقياس الحانات = 5 ميكرون (أعلى). 50 ميكرون (أسفل). ( B ) نسبة الخلايا الدموية غفب إيجابية مع إشارة تونيل لجميع الخلايا الدموية غفب إيجابية في ذباب ضربة قاضية رني بوساطة دربر أو تم تحليل إتغبن مع الخلايا الجنينية فرقت. ( C ) تم تحليل نسبة غمب إيجابية خلايا الدم إلى جميع الخلايا في ذباب ضربة قاضية رني بوساطة دربر أو إتغبن مع الخلايا الجنينية فرقت. ( D ) تم تحليل نسبة الخلايا المؤمدة إيجابية تونيل لجميع الخلايا في ذباب ضربة قاضية رني بوساطة دربر أو إتغبن مع الخلايا الجنينية المشتتة. المورثات. رني -: يو / w؛ سرفيمو-GAL4 واس-إغف / + ، رني دربر: يو / w؛ سرفيمو-GAL4 واس-إغف / +؛ واس-دربر-إر / +، رني إيتغبن : يو / w؛ سرفيمو-GAL4 واس-إغف / +؛ واس-إتغبن-إر / + . وكانت البيانات ممثلة ثلاث تجارب مستقلة وتحليلها من قبل t- الاختبار. وقد لوحظت حوالي 300 غمب إيجابية خلايا الدم في كل تجربة، والقيم تمثل متوسط ± سد من ثلاثة مجالات المجهرية. *؛ p <0.05، نس؛ الفرق ليست كبيرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا هنا مقايسة البلعمة باستخدام الأجنة ذبابة الفاكهة . باستخدام الخلايا الجنينية المتناثرة لقياس البلعمة كميا، يتم الكشف عن الخلايا الدموية، البالعات المهنية ذبابة الفاكهة ، إمونوستيند ل كروسيمورت علامة الكريات البيض أو غفب srpHemo- مدفوعة، وخلايا الأبوطوزية التي كتبها تونيل في هذا البروتوكول. ويعبر عن مستوى البلعمة كمؤشر البلعمة من خلال عد العدد الإجمالي للالدموية ودموية الكريات الدموية. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من مراقبة جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة وتحديد كميا على مستوى البلعمة. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا طريقة بالكشف عن الخلايا الكيمائية والخلايا المبرمج مع الأصباغ التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي، وليس المجهر مضان. هذا يسهل تقييم مستويات البلعمة لأنه من الممكن لمراقبة خلايا الدم والخلايا المبرمج في وقت واحد دون تغيير أي مرشح.
ve_content "> النقاط التالية حاسمة لتلطيخ الخلايا الجنينية.في خطوة التثبيت من الخلايا الجنينية، بفا جديدة أعدت في غضون أسبوعين يحتاج إلى استخدامها.في المناعية من كروكيمورت، تحتاج حضانة الخلايا مع مكافحة كروكيمورت أن يؤديها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في تلطيخ تونيل، يجب أن يتم تنفيذ حضانة الخلايا مع داب عن طريق فحص دقيق تحت المجهر لتجنب تلطيخ المفرط.ونيل تونيل تصور الحمض النووي مجزأة عن طريق الكشف عن 3'- أوه، والتي هي وفيرة في الخلايا أبوبتوتيك، الخلايا الطبيعية لديها أيضا 3'-أوه في 3'- محطة من الحمض النووي، ولكن على مستوى أدنى من ذلك في الخلايا المبرمج، وبالتالي، فإن حضانة الخلايا مع داب لفترة طويلة جدا وصمة عار ليس فقط الخلايا أبوبتوتيك، ولكن أيضا الخلايا الطبيعية ، ويوصى بمراقبة الخلايا كل 15 أو 30 ثانية خلال تلطيخ داب لمنع هذا.في هذا البروتوكول، على الرغم من أن الكمي من مستوى البلعمة سريع ودقيق، وبعض المعلومات سوتش كما يتم فقدان موقع إغراق أو توزيع الخلايا الدموية. أظهرنا سابقا أن هذا الفحص وفحص البلعمة في الموقع باستخدام الأجنة كلها أنتجت نتائج مماثلة من حيث مؤشر البلعمة 21 . ولذلك، فإننا نوصي بإجراء فحص البلعمة في الموقع في موازية من أجل تفسير دقيق للنتائج التي تم الحصول عليها في بعض الحالات.
ذبابة الفاكهة لديها آخر البلعمة المهنية، وخلايا الدبقية، في الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أننا لا نصف كيفية تقييم البلعمة من الخلايا العصبية أبوبتوتيك الخلايا الدبقية في الأجنة في هذا البروتوكول، ويتم تطبيق نفس البروتوكول لتحديد مستوى انغماس كما ذكرت من قبل كورايشي وآخرون. ، EMBO.J 21 . وبالمثل، فإن هذا الفحص يشير إلى أن الخلايا الإيجابية تونيل في أجنة ذبابة الفاكهة من المرجح أن تكون فاغوسيتوسد بواسطة البالعات غير المهنية. البلعمة من قبل هؤلاء مجهولي الهوية فأغوسيتس مع مستقبلات إنغولفمنت غير معروفة قد يفسر النتيجة ( الشكل 1D ) أن العدد الإجمالي للخلايا الأبوطوزية في الخلايا الجنينية يبدو أن لا يزيد في طفرة جينية البلعمة.
في الختام، وقد أدى هذا البروتوكول بنجاح إلى اكتشاف الجينات المطلوبة لبلعمة الخلايا المبرمج من قبل البالعات المهنية. 24 ، 25 ، 28 . استنادا إلى الحفاظ التطوري للآليات الجزيئية الكامنة وراء البلعمة 7 ، وكشف عن وظائف الجينات في الأجنة ذبابة الفاكهة التي تنطوي على ردود الفعل البلعمة المعقدة قد توفر رؤى ذات مغزى في إزالة البلعمة من الخلايا الميتة، والذي يرتبط بالاضطرابات الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية في الثدييات 29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لكاز ناغوسا وأكيكو شيراتسوتشي على مشورتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Stock center | Stock ID | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | - |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | - |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116 (2), 205-219 (2004).
- Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96 (2), 245-254 (1999).
- Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).
- Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).
- Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).
- Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).
- Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
- Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).
- Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).
- Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107 (1), 27-41 (2001).
- Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).
- Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
- Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117 (1), 29-43 (1993).
- Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).
- Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).
- Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
- Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).
- Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).
- Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).
- Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).
- Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).
- Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).
- Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).
- Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).
