Summary
我们在此描述使用果蝇分散的胚胎细胞的吞噬作用。它使我们能够容易且准确地量化体内吞噬水平，并确定凋亡细胞吞噬所需的新分子。
Abstract
由于其在免疫和炎症难治性疾病中的作用，需要更详细地阐明凋亡细胞吞噬作用的分子机制。我们本文开发了一种使用果蝇果蝇定量研究吞噬作用的实验方法，其中基因网络控制吞噬反应是从哺乳动物进化保守的。为了准确地检测和计数使用全部动物吞噬和吞噬吞噬细胞，将果蝇胚胎匀浆以获得包括吞噬细胞和凋亡细胞的分散细胞。使用分散的胚胎细胞使我们能够测量体内吞噬水平，就像我们进行体外吞噬作用测定一样，可以观察全胚胎中的所有吞噬细胞和凋亡细胞，并精确定量吞噬水平。我们确认这种方法再现了以前的研究确定了凋亡细胞吞噬所需的基因。这种方法允许吞噬死细胞，当与强大的果蝇遗传学结合时，将揭示吞噬细胞凋亡细胞的迁移，识别，吞噬和降解所引起的复杂的吞噬反应。
Introduction
在后生动物， 如 线虫 ，果蝇果蝇和小鼠和人类，大量细胞的发育过程中发生凋亡来塑造自己的身体，并在成年后保持动态平衡1，2。凋亡细胞需要快速去除，因为它们通过释放免疫原性的细胞内物质而在周围组织中引起炎症3 。为了便于快速去除，本凋亡细胞所谓吃我信号由吞噬细胞的吞噬受体识别，并通过吞噬作用3，4，5，6被消除。因此，吞噬作用在维持宿主体内平衡方面起关键作用，因此阐明了分子凋亡细胞吞噬的潜在机制是重要的。
负责凋亡细胞的吞噬功能的机制似乎在线虫，果蝇和小鼠7种之中进化上保守的。目前可以使用几种吞噬作用来评估这些模型动物中凋亡细胞的吞噬。在秀丽隐杆线虫中 ，131个体细胞在发育期间经历程序性细胞死亡，细胞尸体被非专业吞噬细胞的相邻细胞吞噬8 。因此，计数线虫中剩余细胞尸体的数量表示体内吞噬水平。通过搜索线虫突变体，显示死细胞数量的增加，吞噬作用所需的几个基因已被鉴定和基因表征9，10，S =“外部参照”> 11,12。
原代培养吞噬细胞（通常是巨噬细胞）的离体吞噬作用常常用于小鼠。使用细胞系如Jurkat细胞制备凋亡细胞，并与原代吞噬细胞混合。孵育数小时后，计数吞噬细胞和吞噬吞噬细胞的总数，以评估吞噬水平。作为这种方法的一个复杂的变形例中，永田的小组开发的体外吞噬作用测定与细胞中表达一个抗胱天蛋白酶ICAD（抑制剂胱天蛋白酶活化的DNA酶），其中凋亡细胞不进行细胞凋亡的DNA片段化，但DNA仍裂解时细胞被吞噬。当这些细胞在吞噬作用测定中用作凋亡靶点时，只有吞噬凋亡细胞的DNA被破碎，并通过TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。所以，水稻通过在吞噬细胞和凋亡细胞的混合物中计数TUNEL信号来测量凋亡细胞吞噬13 。
在果蝇 ，名为血细胞，巨噬细胞果蝇 ，专业的吞噬细胞负责细胞凋亡14，15的吞噬作用。除了与培养的细胞系在体外吞噬作用测定法， 体内用全果蝇胚胎的吞噬作用测定法是可用的。 果蝇胚胎是用于检查凋亡细胞吞噬的水平，因为许多细胞发生凋亡和胚胎发育14，15，16时由血细胞吞噬的有力工具。 体内吞噬试验的一个实例是法国集团开发的方法。在他们的方法中，血细胞是de通过免疫染色过氧化物酶，血细胞标志物，凋亡细胞用核染料，7-氨基放线菌素D在整个果蝇胚胎中染色，双阳性细胞数被计为吞噬信号17 。对胚胎的吞噬作用测定的另一个例子是基于上述Nagata方法的概念;然而， 在体内的吞噬作用是使用DCAD的胚胎进行评估（ 果蝇胱天蛋白酶活化的DNA酶）突变体蝇18,19。这些体内吞噬试验可用于原位直接观察吞噬作用。然而，难以排除计数吞噬细胞步骤中的任何可能的偏差，因为由于其厚度难以观察全胚胎中的所有吞噬细胞和凋亡细胞。
为了克服这个限制，我们开发了在果蝇胚胎中进行新的吞噬作用测定。在我们的方法中，为了容易地计数吞噬血细胞，将整个胚胎均匀化以制备分散的胚胎细胞。通过吞噬细胞标志物的免疫染色检测吞噬细胞，并用这些分散的胚胎细胞用TUNEL检测凋亡细胞。使用分散的胚胎细胞使我们能够测量体内吞噬作用水平，好像我们进行了精确量化吞噬水平的体外吞噬作用。如果它们发展到胚胎20的第16阶段，则吞噬作用的凋亡细胞清除率最丰富的发育阶段，则可以在该测定中使用所有基因型的苍蝇。该方法具有定量评估吞噬水平的优点，因此有助于鉴定参与体内凋亡细胞吞噬的新分子。
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Protocol
准备
- 新鲜葡萄汁琼脂平板的制备
- 加入100毫升水至4.4克琼脂，加热微波炉中的混合物溶解琼脂。
- 向琼脂溶液中加入80 mL新鲜葡萄汁，5 mL乙酸和5 mL乙醇。
- 用移液管将约1.5 mL的溶液倒入每个载玻片上，使其固化。
- 6厘米培养皿琼脂糖板的制备
- 向0.5g琼脂糖中加入50mL水，并在微波炉中加热混合物以溶解琼脂糖。
- 将大约2.5 mL琼脂糖溶液倒入带有移液管的6 cm盘中。
第16期胚胎收集
- 收集成年苍蝇，并将200只雌性和200只雄性添加到50mL锥形管中。
- 将一盘新鲜的葡萄汁琼脂放在酵母中放入50 mL管中，并用海绵盖上页。
- 在16°C的温度下孵育苍蝇2 - 3天。每天更换一次板。
- 在25°C将苍蝇移至黑暗1 h。
- 将旧板更换为新的，不含酵母。让苍蝇放鸡2小时。
- 收集板并在16℃孵育26小时。
- 用油漆刷将板从板上收集到含有0.2％（v / v）Triton X-100的1mL PBS中。
- 用含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS洗涤胚胎两次。
- 为了去除绒毛膜，向胚胎中加入1.2mL次氯酸钠溶液（2.2-3.4％Cl）3分钟。
- 用含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS洗涤胚胎4次。
- 将胚胎放置在6厘米盘的琼脂糖板上。在罗伯茨20所述的显微镜下拿起16号胚胎。用微量移液管在1.5 mL的Treff微量试管中收集大约50个胚胎。
准备胚胎细胞配给
- 用150μLPBS清洗胚胎两次。
- 在PBS中用200μL胶原酶（0.25％（w / v））存在下，在1.5mL微量试管和沉淀混合器中使胚胎均质30次。
- 通过移液10次分散胚胎细胞，并将细胞悬液移至1.5mL管中。在37℃下在水浴中孵育细胞1分钟。重复此步骤两次。
- 在1400×g下添加PBS的800μL细胞悬浮液，和离心机在4℃下5分钟。
- 取出上清液，加入PBS中的200μL胰蛋白酶（0.25％（w / v））至细胞。通过移液分离胚胎细胞50次。
- 用70μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
- 为了停止胰蛋白酶活性，向过滤的细胞悬浮液中加入40μL热灭活的胎牛血清。加入800μLPBS，4℃下以1400× g离心5分钟。
- 去除超新星个nt，暂停沉淀的细胞在PBS中的200μL，和离心机在1400×g下在4℃下5分钟。
- 去除上清液，并将沉淀的细胞悬浮在30μL的PBS中。
- 将制备的细胞悬浮液装载在氨基丙基三乙氧基硅烷涂覆的玻璃载片上，并等待10 - 15分钟，直到细胞附着在载玻片上。
- 用移液器移除玻璃载玻片上的剩余溶液。将60-70μL含有4％（w / v）PFA（多聚甲醛）的PBS悬浮在细胞上10-15分钟进行固定。
- 取出固定溶液，并将玻璃载玻片放入PBS中超过1分钟。
4.血细胞染色
- 用抗Croquemort抗体进行免疫染色
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的载玻片在甲醇中连续浸泡10分钟，然后在PBS中10分钟。
- 在PBS中装载20μL的5％（v / v）全猪血清ng 0.2％（v / v）Triton X-100在细胞上进行阻断。在室温下孵育玻片20分钟。
- 移除玻璃载片上的溶液中，并在含有0.2％PBS安装抗Croquemort抗血清19，21（0.1％（V / V））的20μL（V / V）的Triton X-100细胞上。在4℃下孵育载玻片过夜。
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的载玻片浸泡10分钟5次。
- 在PBS中浸泡玻片10分钟。
- 在室内的细胞上装载含有0.2％（v / v）Triton X-100和5％（v / v）全猪血清的PBS中的20μL碱性磷酸酶标记的抗大鼠IgG（0.5％（v / v）温度1 h。
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的载玻片浸泡10分钟5次。
- 将含有100mM Tris-HCl，pH9.5,100mM NaCl和50mM MgCl 2的缓冲液中的载玻片浸泡10分钟。
- 含有0.23mg / mL 5-溴-4的载体磷酸酶底物溶液（BCIP），0.35mg / mL硝基蓝四唑（NBT），100mM Tris-HCl，pH9.9,100mM NaCl和50mM MgCl 2 。
- 在显微镜下观察细胞是否正常染色。当血细胞颗粒中出现强烈的紫色信号时，取出底物溶液，并将载玻片浸泡在由10mM Tris-HCl，pH8.5和1mM EDTA组成的缓冲液中。建议染色约5 - 10分钟。
- 用抗GFP抗体进行免疫染色（血细胞染色的另一种选择）
- 将载玻片在甲醇中连续浸泡10分钟，含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS 10分钟，PBS 10分钟。
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的5％（v / v）全猪血清装入20μL用于阻断的细胞上。在室温下孵育玻片20分钟。
- 取出载玻片上的溶液，安装20μL小鼠抗GFP抗体（1％（v / v））/ PBS c在细胞上培养0.2％（v / v）Triton X-100。在室温下孵育玻片一夜。
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的载玻片浸泡10分钟5次。
- 在PBS中浸泡玻片10分钟。
- 在室内的细胞上装载含有0.2％（v / v）Triton X-100和5％（v / v）全猪血清的PBS中的20μL碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG（0.5％（v / v）温度1 h。
- 将含有0.2％（v / v）Triton X-100的PBS中的载玻片浸泡10分钟5次。
- 将载玻片在100mM Tris-HCl，pH9.9,100mM NaCl和50mM MgCl 2组成的缓冲液中浸泡10分钟。
- 将含有0.23mg / mL BCIP，0.35mg / mL NBT，100mM Tris-HCl，pH9.9,100mM NaCl和50mM MgCl 2的磷酸酶底物溶液装载在细胞上。
- 在显微镜下观察细胞是否正常染色。当紫色信号出现在全血细胞中时，取出底物溶液，并将缓冲液中的载玻片浸泡10mM Tris-HCl，pH8.5和1mM EDTA。建议染色约10 - 15分钟。
5. TUNEL染色细胞凋亡细胞
- 将PBS在PBS中浸泡5分钟。
- 用新的PBS重复。
- 将平衡缓冲液（见材料表）放在细胞上10分钟。
- 从玻片上取出溶液，并在37℃下将20μL含有5μL末端脱氧核苷酸转移酶的TdT溶液和15μL反应缓冲液装入细胞1小时。
- 从玻片上取出溶液，并将缓冲液浸入缓冲液中，缓冲液由0.5 mL STOP / Wash Buffer和17 mL水组成。
- 在PBS中浸泡载玻片5分钟3次。
- 在室温下将20μL抗地高辛 - 过氧化物酶载于细胞上30分钟。
- 将载玻片在PBS中浸泡5分钟4次。
- 将载玻片浸泡在30mL含有pH7.5的50mM Tris-HCl的过氧化物酶底物溶液中3,9'-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）和0.002％（v / v）H 2 O 2的全微微铲30秒。
- 重复步骤5.9直到凋亡细胞染成棕色。将水玻片浸泡在水中以停止过氧化物酶反应。
- 用水封闭细胞观察。
6.测量凋亡细胞的吞噬水平
- 观察样品在光学显微镜下，以评估吞噬的水平。计数Croquemort阳性细胞或GFP阳性细胞作为血细胞，TUNEL阳性细胞作为凋亡细胞，双重阳性细胞作为吞噬血细胞。
- 吞噬指数定义为双重阳性细胞数与Croquemort阳性细胞或GFP阳性细胞总数的数量。建议观察超过300个血细胞。
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Representative Results
为了检测凋亡细胞的吞噬作用，收集了发育阶段16的果蝇胚胎，并作为分散细胞制备。血细胞，巨噬细胞果蝇 ，进行免疫细胞化学对血细胞标记“Croquemort” 17，22使用特异性抗体19,21染色，凋亡细胞通过TUNEL在分散的胚胎细胞（ 图1A）染色。 Croctemort，一种果蝇 CD36相关受体，在所有胚胎血细胞22上被特异性表达，并且已被遗传地显示参与果蝇胚胎17中凋亡细胞的清除。 Croquemort阳性细胞在其细胞的小颗粒中具有紫色信号。 TUNEL阳性细胞显示ab整个语料库中的rown信号。 TUNEL阳性细胞比其他细胞更小，有些细胞在Croquemort阳性细胞内，被认为是吞噬死细胞。在所有胚胎细胞中通常观察到2％至10％的克隆克隆阳性细胞和1至5％TUNEL阳性细胞。
在果蝇中 ，凋亡细胞吞噬有两种信号通路。两个吞噬受体相应的通路，和Draper的整合素αPS3βν，独立地识别死细胞19，21，23，24，25。 Draper是跨膜蛋白，其在细胞外区域具有非典型表皮生长因子（EGF）样序列，并且i中的两个可磷酸化基序NPxY和YxxL细胞外部分26 。整合素αPS3βν也是由α和β亚基25的异源二聚体的跨膜受体。 图1B显示了野生型或drpr或Itgbn单个突变体胚胎吞噬血细胞与总血细胞的比例。通过计数所有Croquemort阳性细胞（总血细胞）和Croquemort-和TUNEL-双阳性细胞（吞噬血细胞），我们计算吞噬指数作为吞噬血细胞数与血细胞总数。吞噬指数在drpr或Itgbn突变体中低于野生型，而血细胞和凋亡细胞数量相似（ 图1C- D ），表明这两个基因是凋亡细胞吞噬所必需的，如前所述eported。
当抗Croquemort抗体不可用或检测到具有改变的Croquemort表达的突变体系时，我们需要选择另一种方法来检测血细胞。具有由血细胞特异性启动子（ srpHemo-GAL4 ）控制的GAL4驱动的胚胎和由包含GAL4结合位点（ UAS-EGFP ）的上游激活序列（UAS）控制的GFP基因具有GFP标记的血细胞27 ，这使我们能够使用抗GFP检测血细胞。 图2A显示了使用抗GFP抗体的免疫染色检测血细胞和凋亡细胞后获得的图像，以及在具有srpHemo-GAL4UAS-EGFP的胚胎细胞中的TUNEL。虽然抗Croquemort抗体染色细胞中的小颗粒，但抗GFP抗体染色整个血细胞。类似于图1A ，2-6％GFP阳性细胞和1-5％TUNEL阳性在所有胚胎细胞中都观察到细胞。在GFP阳性细胞内检测到一些TUNEL阳性细胞，被认为是吞噬死细胞。通过与srpHemo-GAL4UAS-EGFP的候选基因的UAS-dsRNA交叉苍蝇来容易地应用RNAi介导的敲低来评估它们参与吞噬作用的任何基因。通过RNAi介导的drpr或Igbn敲除降低了吞噬指数（ 图2B ），而胚胎细胞中血细胞和凋亡细胞的数量相当（ 图2C -2D ），再次表明这些吞噬受体参与吞噬作用凋亡细胞。从两种血细胞检测方法获得相似的吞噬指数，表明两者兼容。
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图1 ： 抗Croctemort抗体和TUNEL染色胚胎细胞。 （A）明场分散胚胎细胞的从W 1118株通过用抗Croquemort抗体和免疫染色TUNEL图像。示出了代表性的正或负染色的细胞（前4个小组）和低功率场（底图）的放大图。刻度棒，5μm（上）; 50μm（底）。 （ B ）使用分散的胚胎细胞分析Croquemort阳性血细胞与TUNEL信号与drpr或Itgbn突变体中所有Croquemort阳性血细胞的比例 。 （ C ）用分散的胚胎细胞分析drep或Igbn突变体中Croquemort阳性血细胞与所有细胞的比例 。 （ D ）TUNEL阳性凋亡细胞与drpr中所有细胞的比例用分散的胚胎细胞分析重组突变体。基因型; 瓦特1118（野生型对照），drprΔ5（drpr突变体），和Itgbn 2（整联βν突变体）。数据代表三个独立实验，并由学生的t检验进行分析。在每个实验中观察到约300个Croquemort阳性血细胞，值表示三个微观场的平均值± SD。 *; p <0.05，ns;差异不显着请点击此处查看此图的较大版本。
图2： 蚂蚁染色胚胎细胞i-GFP和TUNEL。 （ A ）通过用抗GFP抗体和TUNEL进行免疫染色从srpHemo-GAL4UAS-EGFP / +菌株分散的胚胎细胞的明亮的图像。示出了代表性的正或负染色的细胞（前4个小组）和低功率场（底图）的放大图。刻度棒=5μm（上）; 50μm（底）。 （B）在drpr或Itgbn的RNAi介导的敲低苍蝇TUNEL信号到所有GFP阳性血细胞的GFP阳性血细胞的比率与分散的胚胎细胞进行分析。 （ C ）使用分散的胚胎细胞分析GFP-阳性血细胞与drpr或Itgbn的 RNAi介导的敲除苍蝇中的所有细胞的比例。 （ D ）用分散的胚胎细胞分析了TUNEL阳性凋亡细胞与drpr或Igbn的 RNAi介导的敲除苍蝇中的所有细胞的比例。基因型; RNAi -： yw / w srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + ，RNAi drpr：yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +， RNAi Itgbn ： yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + 。数据代表三个独立实验，并由学生的t检验进行分析。在每个实验中观察到大约300个GFP阳性血细胞，值代表三个微观场的平均值± SD。 *; p <0.05，ns;差异不显着请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们在此描述了使用果蝇胚胎的吞噬作用。通过使用分散的胚胎细胞定量测量吞噬作用，将血细胞， 果蝇专业吞噬细胞免疫染色用于血细胞标记Croquemort或srpHemo-驱动的GFP，并且在该方案中通过TUNEL检测凋亡细胞。吞噬水平通过计数血细胞总数和吞噬血细胞来表达为吞噬指数。使用分散的胚胎细胞使我们能够观察全胚胎中的所有吞噬细胞和凋亡细胞，并精确量化吞噬水平。此外，我们的方法可以用光学显微镜观察到的染料检测血细胞和凋亡细胞，而不是荧光显微镜。这有助于吞噬作用水平的评估，因为可以同时观察血细胞和凋亡细胞而不改变任何过滤器。
在胚胎细胞的固定步骤中，需要在两周内制备新鲜的PFA，在Croquemort的免疫染色中，需要进行具有抗Croquemort的细胞的孵育在TUNEL染色中，细胞与DAB的孵育需要通过在显微镜下仔细检查以避免过度染色，TUNEL通过检测凋亡细胞中丰富的3'-OH可视化片段化DNA，正常细胞在DNA的3'末端也具有3'-OH，但在凋亡细胞的水平较低，因此，细胞与DAB的孵育时间过长，不仅会染色凋亡细胞，而且会染色正常细胞建议在DAB染色期间每15或30秒观察一次细胞，以防止这种情况。在这个协议中，虽然吞噬水平的量化是快速和准确的，ch作为血细胞吞没或分布的部位丢失。我们以前表明，此法和原位吞噬试验使用产自吞噬指数21方面类似的结果全胚胎。因此，我们建议并行进行原位吞噬试验，以准确解释在某些情况下获得的结果。
果蝇具有另一种专业的吞噬细胞，胶质细胞，在中枢神经系统中。虽然我们没有描述如何评估这个方案中胚胎中胶质细胞凋亡神经元的吞噬作用，但是应用相同的方案来量化由Kuraishi 等人报道的吞噬水平。 ， EMBO.J 21 。同样，该测定表明果蝇胚胎中的TUNEL阳性细胞可能被非专业吞噬细胞吞噬。吞噬由那些身份不明的ph具有未知吞噬受体的哺乳动物可能解释了结果（ 图1D ），吞噬基因突变体中胚胎细胞中的凋亡细胞总数似乎没有增加。
总之，该方案成功地导致了专业吞噬细胞吞噬凋亡细胞吞噬所需的基因。 24，25，28。基于吞噬作用的分子机制的进化保守7 ，揭示涉及复杂吞噬反应的果蝇胚胎中的基因功能可能对死细胞的吞噬清除提供有意义的见解，这与哺乳动物的炎性疾病和自身免疫疾病有关29 。
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Disclosures
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
感谢Kaz Nagaosa和Akiko Shiratsuchi的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Stock center | Stock ID | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | - |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | - |
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