Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Abstract

Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan moleküler mekanizmalar, bağışıklık ve inflamatuar dirençli hastalıklarda rolünden dolayı daha ayrıntılı olarak açıklığa kavuşturulmalıdır. Burada, fide soğurumunu kontrol eden gen şebekesinin memelilerden evrimsel olarak korunduğu Drosophila meyve sineği kullanılarak kantitatif olarak fagositozu araştırmak için deneysel bir yöntem geliştirdik. Tam hayvanlar kullanılarak engulfing ve un-engulfing fagositleri doğru tespit etmek ve saymak için Drosophila embriyoları, fagositler ve apoptotik hücreler de dahil olmak üzere dağılmış hücreler elde etmek üzere homojenize edildi. Dağıtılmış embriyonik hücrelerin kullanımı, in vitro fagositoz düzeylerini, bütün embriyolardaki tüm fagositleri ve apoptotik hücreleri gözlemlemek ve fagositoz düzeyini tam olarak ölçmek mümkün olan bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçebilir. Bu yöntemin daha önceki çalışmaların yöntemlerini ürettiğini doğruladıkBu, apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli genleri belirledi. Bu yöntem, ölü hücrelerin parçalanmasını sağlar ve Drosophila'nın güçlü genetiği ile birleştirildiğinde, fagositler tarafından apoptotik hücrelerin migrasyonu, tanınması, yutulması ve parçalanması ile oluşan karmaşık fagositik reaksiyonları ortaya çıkaracaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metazoan hayvanlarda, örneğin nematod Caenorhabditis elegans , meyve sinek Drosophila melanogaster ve fare ve insanlar, çok sayıda hücre vücutlarını şekillendirmek için gelişme döneminde ve erişkinlikte homeostazı 1 , 2 korumak için apoptoz geçirir. Apoptotik hücrelerin hızla çıkartılması gerekir çünkü bunlar, tamamen çıkarılmasa bile, immünojenik hücre içi materyalleri serbest bırakarak çevreleyen dokularda iltihap oluştururlar 3 . Hızlı kaldırmayı kolaylaştırmak için, apoptotik hücreler, fagositlerin yutulma reseptörleri tarafından tanınan ve yememe sinyalleri olarak adlandırılırlar ve fagositoz 3 , 4 , 5 , 6 ile ortadan kaldırılırlar. Böylece, fagositoz ana homeostazın korunmasında hayati bir rol oynar ve bu nedenle molekülün aydınlatılması Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan mekanizmalar önemlidir.

Apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumlu mekanizmalar, nematodlar, sinekler ve farelerdeki türler arasında evrimsel olarak korunmuş gibi gözükmektedir 7 . Bu model hayvanların apoptotik hücrelerin soğumasını değerlendirmek için çeşitli fagositoz testleri mevcuttur. C. elegans içinde, 131 somatik hücre gelişimi sırasında programlanmış hücre ölümü ve hücre cesetleri profesyonel olmayan fagositler 8 olan komşu hücreler tarafından fagosite edilen. Böylece, C. elegans'taki kalan hücre cesetlerinin sayısının sayılması, in vivo fagositoz seviyesini gösterir. Ölü hücrelerin artan sayısını gösteren nematod mutantlarını araştırarak, fagositoz için gereken birkaç gen tespit edildi ve genetik olarak 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Birincil kültür fagositleri (genellikle makrofajlar) ile ex vivo fagositoz testleri, farelerde sıklıkla kullanılır. Apoptotik hücreler, Jurkat hücreleri gibi hücre hatları kullanılarak hazırlanır ve primer fagositlerle karıştırılır. Birkaç saat inkübasyondan sonra fagositoz seviyesini değerlendirmek için toplam fagosit sayısı ve sindirim fagosit sayısı hesaplanır. Bu yöntemin sofistike bir modifikasyonu olan Nagata'nın grubu, apoptotik hücrelerin apoptotik DNA fragmantasyonuna maruz kalmadığı, ancak kaspaza dirençli bir ICAD (kaspazla aktive DNaz inhibitörü) eksprese eden hücrelerle ex vivo fagositoz testi geliştirdi; ancak DNA hala kesildiğinde Hücreler fagositozlanır. Bu hücreler, bir fagositoz tahlilinde apoptotik hedefler olarak kullanıldığında, sadece sarmalanmış apoptotik hücrelerin DNA'sı parçalanır ve TdT aracılı dUTP nick uç etiketlemesi (TUNEL) ile boyanır. Bu nedenle, leveL apoptotik hücre yutulması, bir fagosit ve apoptotik hücre karışımı 13 içinde TUNEL sinyallerinin sayılmasıyla ölçülür.

D. melanogaster'da , hemocytes adında profesyonel fagositler, Drosophila makrofajları, 14 , 15 apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumludur. Kültür hücresi soyları ile yapılan in vitro fagositoz analizlerine ek olarak , bütün Drosophila embriyolarıyla in vivo fagositoz analizleri mevcuttur. Drosophila embriyolar birçok hücreleri apoptozise uğrar ve embriyonik gelişim 14, 15, 16 boyunca hemocytes tarafından fagosite edilir çünkü apoptotik hücre yutulma seviyesinin incelenmesine yönelik güçlü bir araçtır. Bir in vivo fagositoz tahliline bir örnek, Franc'in grubu tarafından geliştirilen yöntemdir. Yöntemlerinde hemositler deBir hemosit işareti olan peroksidazenin immüno-lekelemesi ile tespit edilen apoptotik hücreler, bütün Drosophila embriyolarında 7-amino aktinomisin D nükleer boya kullanılarak lekelenmiş ve çift pozitif hücrelerin sayısı, fagositoz 17 sinyali olarak sayılmıştır. Embriyolarda bir fagositoz tahlili için bir başka örnek, yukarıda tarif edilen Nagata metodu kavramına dayanır; Bununla birlikte, in vivo fagositoz, dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) mutant sinekler 18 , 19'un embriyoları kullanılarak değerlendirilir. Bu in vivo fagositoz testleri doğrudan in situ fagositoz gözlemlemek için yararlıdır. Bununla birlikte, zorluklar, fagosit hücrelerini sayma aşamasındaki muhtemel yanlılıkların hariç tutulması ile ilişkilidir; çünkü kalınlığından ötürü bütün embriyoların tüm fagositlerini ve apoptotik hücrelerini gözlemlemek zordur.

Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için,Drosophila embriyolarında yeni bir fagositoz testi yaptı. Yöntemimizde, fagositozan hemositleri kolayca sayabilmek için, bütün embriyolar dağınık embriyonik hücreleri hazırlamak için homojenize edilir. Fagositler, bir fagosit markörünün immün boyaması ile tespit edilir ve apoptotik hücreler, bu dağınık embriyonik hücreler ile TUNEL tarafından saptanır. Dağıtılan embriyonik hücrelerin kullanılması, in vivo fagositoz düzeylerini, fagositoz düzeyini tam olarak ölçen bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçmenizi sağlar. Bunlar embriyo 20 16 fagositozla olan apoptotik hücre mesafesi en bol gelişimsel aşama aşama için gelişirse sinekler tüm genotipler Bu deneyde kullanılabilir. Bu yöntem, fagositoz seviyesini kantitatif olarak değerlendirmenin avantajına sahiptir ve bu nedenle apoptotik hücrelerin in vivo fagositozunda yer alan yeni moleküllerin tanımlanmasına katkıda bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hazırlık

  1. Taze üzüm suyu agar plakalarının hazırlanması
    1. 4.4 g agarda 100 mL su ilave edin ve karışımı mikrodalga fırında ısıtarak agarı çözün.
    2. 80 mL taze üzüm suyu, 5 mL asetik asit ve 5 mL etanol, agar solüsyonuna ilave edin.
    3. Her cam slayt üzerine bir pipet ile yaklaşık 1.5 mL çözelti dökün ve katılaşmasına izin verin.
  2. 6 cm çanak agaroz plakalarının hazırlanması
    1. 0.5 g agaroza 50 mL su ilave edin ve agarozu çözmek için mikrodalga fırında ısıtın.
    2. Bir pipet ile 6 cm'lik bir tabağa yaklaşık 2.5 mL agaroz çözeltisi dökün.

2. Evre 16 Embriyo Koleksiyonu

  1. Yetişkin sinekler toplayın ve 200 mL dişiler ve 200 erkek bir 50 mL konik tüp ekleyin.
  2. Maya üzerine taze üzüm suyu agarı bir tabak 50 mL tüp içine koyun ve bir sünger cas.
  3. Sinekleri ışık altında 16 ° C'de 2 - 3 gün inkübe edin. Plakayı günde bir kez değiştirin.
  4. Sinekleri karanlıkta 25 ° C'de 1 saat hareket ettirin.
  5. Eski tabağı mayasız yeni bir tabakaya değiştirin. Uçaklara 2 saat yumurta bırakmasına izin ver.
  6. Plakayı toplayın ve 16 saat boyunca inkübe edin. 26 saat süreyle inkübe edin.
  7. % 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS içine bir boya fırçası ile plakadan embriyolar toplayın.
  8. Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  9. Porsiyonu çıkartmak için, 3 dakika embriyoya 1.2 mL sodyum hipoklorit çözeltisi (% 2.2 - 3.4 Cl) ekleyin.
  10. Embriyoları,% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile 4 kez yıkayın.
  11. 6 cm çanak agaroz plakaları embriyolar yerleştirin. Evre 16 embriyoları, Roberts 20 tarafından tarif edildiği gibi mikroskop altında alın. Bir mikropipet ile 1.5 mL'lik bir Treff mikro test tüpünde yaklaşık 50 embriyo toplayın.

3. PrepaEmbriyonik Hücrelerin Rasyonları

  1. Embriyoları iki kez 150 μL PBS ile yıkayın.
  2. PBS içinde kollajenaz 200 uL (% 0.25 (w / v)) varlığında embriyoları 1.5 mL mikro test tüpü ve pelet mikserinde 30 kez homojenize edin.
  3. Embriyonik hücreleri 10 kez pipetle dağıtın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mL tüp içine alın. Hücreleri 37 ° C'de 1 dakika su banyosunda inkübe edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
  4. Hücre süspansiyonuna 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C'de 1400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı çıkarın ve hücrelere PBS içinde 200 μL tripsin (% 0.25 (w / v)) ekleyin. Embriyonik hücreleri 50 kez pipetle dağıtın.
  6. Hücre süspansiyonunu 70 um'lik bir Hücre Süzücü ile süzün.
  7. Tripsin aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonuna 40 μL ısı ile inaktive fetal sığır serumu ekleyin. 800 μL PBS ekleyin ve 4 ° C'de 1,400 x g'de 5 dakika süreyle santrifüjleyin.
  8. Supernata'yı kaldırNt, 200 ul PBS içinde çökelen hücreleri askıya alın ve 1400 x g'de 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  9. Süpernatantı çıkarın ve 30 uL PBS içinde çökelen hücreleri bekletin.
  10. Hazırlanan hücre süspansiyonunu aminopropil trietoksisilan kaplı cam slaytlara monte edin ve hücreler cam slaytlara tutturuncaya kadar 10-15 dakika bekleyin.
  11. Cam slaytlardaki kalan çözeltiyi bir pipetle çıkarın. Tespit için 10-15 dakika boyunca hücrelere% 4 (w / v) PFA (paraformaldehid) içeren PBS'nin 60 - 70 μL'sini monte edin.
  12. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1 dakikadan fazla cam kaydırıcıları PBS'ye yerleştirin.

4. Hemocytes Boyama

  1. Bir anti-Croquemort antikoru ile immün boyama
    1. 10 dakika boyunca% 0,2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde ve sonra 10 dakika boyunca PBS'de, 10 dakika boyunca metanol içinde cam kaydırıcıları ıslatınız.
    2. PBS içerisinde 20 μL% 5 (v / v) tam domuz serumuEngelleme hücreleri üzerinde% 0.2 (v / v) Triton X-100. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde 20 μL anti-Croquemort antiserumu 19 , 21 (% 0.1 (v / v)) yerleştirin. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
    5. Cam kaydırakları 10 dakika PBS'de bekletin.
    6. Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) bütün domuz serumunu içeren PBS içinde 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-sıçan IgG'si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat.
    7. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
    8. 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl ihtiva eden tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM MgCl2.
    9. 0.23 mg / mL 5-bromo-4 içeren dağ fosfataz substrat çözeltisi-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP), 0.35 mg / mL nitrotetrazolivm (NBT), 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM MgCl2.
    10. Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Hemocytes granüllerinde güçlü mor sinyalleri göründüğünde, substrat solüsyonu çıkarın ve 10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA içeren tampon cam slaytlar batırın. Yaklaşık 5 - 10 dakika boyanması önerilir.
  2. Bir anti-GFP antikoru ile immün boyama (hemositlerin boyanması için başka bir seçenek)
    1. Cam kaydırakları 10 dakika süreyle metanol içinde, 10 dakika için% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve 10 dakika PBS içeren PBS'yi ıslatınız.
    2. Blokaj için hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde% 5 (v / v) tam domuz serumu 20 uL'lik bir miktarı monte edin. Slaytları 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Cam slaytlardaki çözeltiyi çıkarın ve 20 μL fare anti-GFP antikoru (% 1 (v / v)) / PBS cHücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ile ulaşılmaktadır. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
    5. Cam kaydırakları 10 dakika PBS'de bekletin.
    6. Odalarda hücrelere% 0.2 (v / v) Triton X-100 ve% 5 (v / v) tüm domuz serumu içeren PBS'de 20 uL alkalin fosfataz etiketli anti-fare IgG'si (% 0.5 v / v) Sıcaklık 1 saat.
    7. 10 dakika boyunca 5 kez% 0.2 (v / v) Triton X-100 içeren PBS içinde cam sürgüleri bekletin.
    8. 100 mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCl'den oluşan tampon içinde cam slaytlar ıslatın ve 10 dakika için 50 mM MgCl2.
    9. 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCI, ve hücreler 50 mM MgCl2 ihtiva eden fosfataz alt-tabaka çözeltisi monte edin.
    10. Düzgün boyanması için hücreleri mikroskop altında izleyin. Tam hemositlerde mor sinyaller göründüğünde, substrat solüsyonunu çıkarın ve içindeki slaytları,10 mM Tris-HC1, pH 8.5 ve 1 mM EDTA. Yaklaşık 10-15 dakika boyanması önerilir.

5. TUNEL tarafından Apoptotik Hücrelerin Boyanması

  1. Cam kaydırakları 5 dakika PBS'de bekletin.
  2. Yeni PBS ile tekrarlayın.
  3. Dengeleyici dengeleyici tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca hücrelerde.
  4. Cam slaytlar solüsyonu kaldırın ve 1 saat 37 ° C'de hücrelere 15 uL Reaksiyon Tamponu ve terminal deoksinükleotidil transferaz 5 mcL içeren TdT çözeltisi 20 mcL monte edin.
  5. Çözeltiyi cam kaydıraklardan çıkarın ve slaytları 0.5 mL STOP / Yıkama tamponu ve 17 mL sudan oluşan tampona batırın.
  6. Slaytları PBS içinde 5 dakika 3 kez bekletin.
  7. 30 dk boyunca oda sıcaklığında hücrelere 20 μL Anti-Digoxigenin-Peroksidaz ekleyin.
  8. Cam kaydırakları 5 dakika 4 kez PBS'de bekletin.
  9. Cam slaytları 30 mL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 suşu içeren peroksidaz substrat çözeltisine batırın30 sn için 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrichloride (DAB) ve% 0.002 (h / h) H2 O 2 ga tam mikro spatula.
  10. Apoptotik hücreler kahverengi oluncaya dek adım 5.9'u tekrarlayın. Peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için cam kaydırıcıları suya batırın.
  11. Gözlem için hücreleri su ile kapatın.

6. Apoptotik Hücrelerin Fagositoz Düzeyini ölçün

  1. Fagositoz düzeyini değerlendirmek için örnekleri hafif bir mikroskopta izleyin. Hemocytes olarak Croquemort pozitif hücreleri veya GFP pozitif hücreleri, Apoptotik hücreler olarak TUNEL pozitif hücreleri ve hemositleri fagositize eden çift pozitif hücreleri sayın.
  2. Fagositik indeks, Croquemort pozitif hücrelerin veya GFP pozitif hücrelerin toplam sayısına karşı çift pozitif hücre sayısı olarak tanımlanır. 300'den fazla hemosit izlenmesi önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptotik hücrelerin fagositozunu incelemek amacıyla gelişim aşaması 16'nın Drosophila embriyoları toplandı ve dağılmış hücreler olarak hazırlandı. Hemocytes, Drosophila makrofajları, hemocyte marker "Croquemort" 17 , 22 için immünositokimya ile spesifik bir antikor 19 , 21 kullanarak lekelenmiş ve apoptotik hücreler dağınık embriyonik hücrelerde TUNEL ile boyanmıştır ( Şekil 1A ). Drosophila CD36 ile ilgili reseptör olan Croquemort, tüm embriyonik hemocytes 22'de spesifik olarak eksprese edilir ve genetik olarak Drosophila embriyolarında apoptotik hücrelerin temizlenmesinde yer aldığı gösterilmiştir 17 . Croquemort pozitif hücreler, hücrelerinin küçük granüllerinde mor sinyalleri var. TUNEL pozitif hücreler ab gösterirTüm korpuslarda çimen sinyali. TUNEL pozitif hücreler diğer hücrelere göre daha küçüktür ve bazıları fagositize edilmiş ölü hücreler olarak düşünülen Croquemort pozitif hücrelerdedir. Croquemort pozitif hücreler ve% 1 - 5 TUNEL pozitif hücreler arasında% 2 ile 10 arasında normal olarak tüm embriyonik hücrelerde görülürler.

Drosophila'da , apoptotik hücrelerin yutulması için iki sinyal yolağı vardır. Karşılık gelen yolların için iki fagositoz reseptörleri, Draper ve α PS3 β v'yi integrin, bağımsız bir şekilde, ölü hücreleri 19, 21, 23, 24, 25 tanır. Draper, hücre dışı bölgede atipik epidermal büyüme faktörü (EGF) benzeri sekanslara sahip transmembran bir proteindir ve i'deki iki fosforile edilebilir motif NPxY ve YxxL'dir.Ntracellular kısım 26 . Integrin α PS3 β v aynı zamanda α ve β alt birimlerinin heterodimeri olan bir transmembran reseptördür 25 . Şekil 1B , vahşi tip veya drpr veya Itgbn tek mutant embriyolarda toplam hemositlere fagosit oksitlenme oranı göstermektedir. Croquemort pozitif tüm hücrelerini (toplam hemosit) ve Croquemort ve TUNEL çift pozitif hücrelerini (hemositleri fagositize eden) sayarak, fagositik indeksi toplam hemosit sayısına göre fagositlendirme hemocytes sayısı olarak hesapladık. Hemositlerin ve apoptotik hücrelerin sayıları benzer iken ( Şekil 1C- D ) fagositik indeks drpr veya Itgbn mutantında vahşi türe göre daha düşüktü , bu iki genin apoptotik hücre yutulması için gerekli olduğunu, daha önce rEPO kaynaklı.

Croquemort karşıtı bir antikor yoksa veya değiştirilmiş Croquemort ifadesi ile mutant hatları incelendiğinde, hemocytes tespit etmek için başka bir seçenek seçmek gerekir. Bir hemocyte-spesifik promotör ( srpHemo-GAL4 ) tarafından kontrol edilen bir GAL4 sürücüsü ve GAL4 bağlanma bölgesi ( UAS-EGFP ) de dahil olmak üzere bir upstream aktivasyon dizisi (UAS) tarafından kontrol edilen GFP geni bulunan embriyoların GFP etiketli hemositleri 27 , Bu da anti-GFP kullanarak hemocytes tespit etmemizi sağlar. Şekil 2A , bir anti-GFP antikoru kullanılarak immüno -lekeleme ile hemositleri ve apoptotik hücreleri saptadıktan sonra elde edilen bir görüntüyü ve srpHemo-GAL4UAS-EGFP'ye sahip embriyonik hücrelerde TUNEL'i görüntüler . Bir anti-Croquemort antikoru hücrelerde küçük granüller lekelemekle birlikte, bir anti-GFP antikoru tüm hemositleri lekeler. Şekil 1A'ya benzer şekilde,% 2-6 oranında GFP-pozitif hücreler ve% 1-% 5 TUNEL-pozitif hücreler Tüm embriyonik hücrelerde hücreler gözlenir. Bazı TUNEL pozitif hücreler, fagositize edilmiş ölü hücreler olarak düşünülen GFP pozitif hücrelerde tespit edilir. RNAi aracılı knockdown, srpHemo-GAL4UAS-EGFP'ye sahip aday genlerin UAS- dsRNA'sı ile sinekleri geçerek fagositozda yer aldıkları için herhangi bir geni değerlendirmek için kolayca uygulanır. RNAy aracılı drpr veya Itgbn kapakçılığı , fagositik indeksi düşürürken ( Şekil 2B ), embriyonik hücrelerdeki hemocytes ve apoptotik hücrelerin sayısı da karşılaştırılabilir ( Şekil 2C -2D ), bu fagositoz reseptörlerinin, fagositoz Apoptotik hücreler. Benzer fagositik indeksler her iki hemosit saptama yönteminden elde edilir, bu da her ikisinin de uyumlu olduğunu düşündürür.

G "/>
Şekil 1 : Anti-Croquemort Antikoru ve TUNEL ile Embriyonik Hücrelerin Boyanması. ( A ) bir anti-Croquemort antikoru ve TUNEL ile immün boyama yapılarak w 1118 suşundan dağıtılan embriyonik hücrelerin parlak alan görüntüleri. Temsili pozitif veya negatif boyalı hücrelerin (üstteki 4 panel) ve düşük güç alanının (alttaki panel) büyütülmüş görüntüleri gösterilmektedir. Ölçek çubukları, 5 μm (üstte); 50 μm (altta). ( B ) Croquemort pozitif hemositlerin TUNEL sinyali ile drpr veya Itgbn mutantındaki tüm Croquemort pozitif hemositlere olan oranı dağınık embriyonik hücreler ile analiz edildi. ( C ) Croquemort pozitif hemositlerin, drpr veya Itgbn mutantındaki tüm hücrelere oranı dağınık embriyonik hücreler ile analiz edildi. ( D ) TUNEL-pozitif apoptotik hücrelerin drpr'deki tüm hücrelere oranıItgbn mutantı, dağılmış embriyonik hücreler ile analiz edildi. genotipler; W 1118 (vahşi tipli kontrol), drpr Δ5 ( drpr mutant) ve Itgbn 2 (integrin β v mutant). Veriler üç bağımsız deneyin temsilcisidir ve Öğrencinin t- testi ile analiz edilmiştir. Her deneyde yaklaşık 300 Croquemort pozitif hemosit gözlendi ve değerler üç mikroskopik alanın ortalama ± SD'sini temsil ediyor. *; p <0.05, ns; Fark önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Embriyonik Hücrelerin Ant tarafından boyanmasıI-GFP ve TUNEL. ( A ) Anti-GFP antikoru ve TUNEL ile bağışıklık kazandırarak srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + suşundan dağılan embriyonik hücrelerin parlak alan görüntüleri. Temsili pozitif veya negatif boyalı hücrelerin (üstteki 4 panel) ve düşük güç alanının (alttaki panel) büyütülmüş görüntüleri gösterilmektedir. Ölçek çubukları = 5 μm (üstte); 50 μm (altta). ( B ) drpr veya Itgbn'nin RNAi aracılı knockdown sineklerinde GFP pozitif hemositlerin TUNEL sinyali ile tüm GFP pozitif hemositlerine olan oranı dağınık embriyonik hücreler ile analiz edildi. ( C ) Drpr veya Itgbn'nin RNAi aracılı knockdown sineklerinde GFP pozitif hemositlerin tüm hücrelere oranı dağınık embriyonik hücreler ile analiz edildi. ( D ) Drpr veya Itgbn'nin RNAi aracılı knockdown sineklerinde TUNEL pozitif apoptotik hücrelerin tüm hücrelere oranı dağınık embriyonik hücreler ile analiz edildi. genotipler; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itbbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Veriler üç bağımsız deneyin temsilcisidir ve Öğrencinin t- testi ile analiz edilmiştir. Her deneyde yaklaşık 300 GFP pozitif hemosit gözlemlendi ve değerler üç mikroskobik alanın ortalama ± SD'sini temsil etmektedir. *; P <0.05, ns; Fark önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada, Drosophila embriyolarını kullanan bir fagositoz tahlili tarif ettik. Fagositozu niceliksel olarak ölçmek için dağınık embriyonik hücreler kullanarak Hemocytes, Drosophila professional phagocytes, Hemocyte marker Croquemort veya srpHemo- kaynaklı GFP için immünostained ve apoptotik hücreler bu protokolde TUNEL tarafından tespit edilir. Fagositoz seviyesi, hemositlerin ve fagosit oksitleyici hemositlerin toplam sayısını sayarak bir fagositik indeks olarak ifade edilir. Dağıtılan embriyonik hücrelerin kullanımı, bütün embriyoların tüm fagositlerini ve apoptotik hücrelerini gözlemlememizi ve fagositoz düzeyini tam olarak ölçmemizi sağlar. Buna ek olarak, yöntemimiz hemositler ve apoptotik hücreleri, floresans mikroskopu değil ışık mikroskopu altında gözlemlenebilen boyalarla tespit eder. Bu, herhangi bir filtre değiştirmeden hemositleri ve apoptotik hücreleri aynı anda gözlemlemek için mümkün olduğu için fagositoz düzeylerini değerlendirmeyi kolaylaştırır.

Ve_content "> Embriyonik hücrelerin lekelenmesi için aşağıdaki noktalar önemlidir: Embriyonik hücrelerin tespit aşamasında iki hafta içinde hazırlanan taze PFA'nın kullanılması gerekir Croquemort'un immünolojik olarak boyanmasında hücrelerin anti-Croquemort ile inkübasyonunun yapılması gerekir 4 ° C'de TUNEL boyama, DAB ile hücrelerin inkübasyon aşırı bir leke önlemek için dikkatli bir mikroskop altında kontrol ederek gerçekleştirilmesi gerekiyor.TUNEL apoptotik hücreler bol olan 3'-OH tespit ederek parçalanmış DNA görselleştirmek Ancak, Normal hücrelerin DNA'nın 3'-terminalinde 3'-OH'ye sahip olmalarına karşın, apoptotik hücrelerdekinden daha düşük bir seviyede oldukları için, DAB hücrelerinin çok uzun süre kuluçkaya yatması sadece apoptotik hücreleri değil aynı zamanda normal hücreleri .Bunu önlemek için DAB boyama sırasında her 15 veya 30 saniyede hücrelerin gözlenmesi önerilir.

Bu protokolde, fagositoz seviyesinin nicelleştirilmesi hızlı ve hassas olmasına rağmen, bazı bilgilerCh hemocytes yutulması veya dağılımı olarak kaybolur. Daha önce, bu tahlilin ve tüm embriyoların kullanıldığı bir in situ fagositoz analizinin, fagositik indeks 21 açısından benzer sonuçlar verdiğini gösterdik. Bu nedenle, bazı vakalarda elde edilen sonuçların doğru şekilde yorumlanabilmesi için in situ fagositoz tahlilini paralel yapmanızı öneririz.

Drosophila'nın merkezi sinir sisteminde bir başka profesyonel fagosit, glial hücresi var. Bu protokoldeki embriyolarda, glial hücreler tarafından apoptotik nöronların fagositozunun nasıl değerlendirileceğini tarif etmemize rağmen, aynı protokol, Kuraishi ve diğerleri tarafından bildirilen sönümlenme düzeyini ölçmek için uygulanır . , EMBO.J 21 . Aynı şekilde, bu tahlil, Drosophila embriyolarındaki TUNEL pozitif hücrelerin, profesyonel olmayan fagositler tarafından fagositize edildiğini önermektedir. Tanımlanamayan ph tarafından fagositozYutma engelleri reseptörü bilinmeyen agositler, bir fagositoz gen mutantında embriyonik hücrelerdeki toplam apoptotik hücre sayısının artmadığını gösteren sonucu açıklayabilir ( Şekil 1D ).

Sonuç olarak, bu protokol başarılı bir şekilde profesyonel fagositler tarafından apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli genlerin keşfedilmesine yol açmıştır. 24 , 25 , 28 . Fagositoz 7'nin altında yatan moleküler mekanizmaların evrimsel korunumuna dayanarak, kompleks fagositoz reaksiyonlarını içeren Drosophila embriyolarındaki gen fonksiyonlarını açığa vurmak, memelilerde inflamatuvar hastalıklar ve otoimmün hastalıklarla ilgili ölü hücrelerin fagositik temizlenmesine ilişkin anlamlı bilgiler sağlayabilir 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Acknowledgments

Onların tavsiyeleri için Kaz Nagaosa ve Akiko Shiratsuchi'ye minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em&gt; Drosophila</emEmbriyolar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter