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Immunology and Infection

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56352
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

Summary

En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas.

Abstract

Los mecanismos moleculares subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas necesitan ser aclarados con más detalle debido a su papel en las enfermedades inmunes e inflamables intratables. En este documento se desarrolló un método experimental para investigar la fagocitosis cuantitativamente utilizando la mosca de la fruta Drosophila , en el que la red de genes que controla las reacciones de engulfment se conserva evolutivamente de los mamíferos. Con el fin de detectar con precisión y contando engullir y no engolfar los fagocitos con animales enteros, embriones de Drosophila se homogeneizaron para obtener células dispersadas incluyendo fagocitos y células apoptóticas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro en el que es posible observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros y cuantificar con precisión el nivel de fagocitosis. Se confirmó que este método reproduce los de estudios previosQue identificó los genes necesarios para la fagocitosis de las células apoptóticas. Este método permite analizar la absorción de células muertas y, cuando se combina con la poderosa genética de Drosophila , revelará las complejas reacciones fagocíticas que comprenden la migración, el reconocimiento, el engolfamiento y la degradación de las células apoptóticas por los fagocitos.

Introduction

En animales metazoarios, por ejemplo el nematodo Caenorhabditis elegans , la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , y ratones y humanos, un gran número de células sufren apoptosis durante el desarrollo para modelar sus cuerpos y en la edad adulta para mantener la homeostasis 1 , 2 . Las células apoptóticas necesitan ser eliminadas rápidamente porque inducen inflamación en los tejidos circundantes liberando materiales intracelulares inmunogénicos si no se eliminan por completo 3 . Para facilitar la remoción rápida, las células apoptóticas presentan las denominadas señales de comer-me que son reconocidas por los receptores de engulfment de los fagocitos, y son eliminadas por fagocitosis 3 , 4 , 5 , 6 . Así, la fagocitosis desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del huésped, y por lo tanto, elucidar la molécula Los mecanismos subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas son importantes.

Los mecanismos responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas parecen ser evolutivamente conservadas entre las especies en los nematodos, moscas y ratones [ 7] . Actualmente se dispone de varios ensayos de fagocitosis para evaluar la absorción de células apoptóticas en estos animales modelo. En C. elegans , 131 células somáticas sufren muerte celular programada durante el desarrollo, y los cadáveres de células son phagocytosed por las células vecinas, que son no fagocitos profesionales [ 8] . Por lo tanto, contar el número de cadáveres de células restantes en C. elegans indica el nivel de fagocitosis in vivo . En la búsqueda de mutantes de nematodos que muestran un mayor número de células muertas, varios genes necesarios para la fagocitosis han sido identificados y caracterizados genéticamente 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Los ensayos de fagocitosis ex vivo con fagocitos de cultivo primario, generalmente macrófagos, se usan a menudo en ratones. Las células apoptóticas se preparan usando líneas celulares tales como células Jurkat, y se mezclan con fagocitos primarios. Después de una incubación durante varias horas, se cuenta el número total de fagocitos y de fagocitos engullantes para evaluar el nivel de fagocitosis. Como una modificación sofisticada de este método, el grupo de Nagata desarrolló un ensayo de fagocitosis ex vivo con células que expresan un ICAD resistente a caspasa (inhibidor de la DNasa activada por caspasa), en el que las células apoptóticas no sufren fragmentación apoptótica del ADN, Las células son fagocitadas. Cuando estas células se usan como dianas apoptóticas en un ensayo de fagocitosis, sólo el ADN de las células apoptóticas engullidas está fragmentado y teñido por marcado de extremos dUTP mediados por TdT (TUNEL). Por lo tanto, el leveL de la absorción de células apoptóticas se mide por el recuento de señales TUNEL en una mezcla de fagocitos y células apoptóticas [ 13] .

En D. melanogaster , los fagocitos profesionales denominados hemocitos, los macrófagos de Drosophila , son responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas 14 , 15 . Además de los ensayos de fagocitosis in vitro con líneas celulares de cultivo, se dispone de ensayos de fagocitosis in vivo con embriones enteros de Drosophila . Los embriones de Drosophila son una poderosa herramienta para examinar el nivel de engrosamiento de células apoptóticas debido a que muchas células sufren apoptosis y son fagocitadas por hemocitos durante el desarrollo embrionario 14 , 15 , 16 . Un ejemplo de un ensayo de fagocitosis in vivo es el método desarrollado por el grupo de Franc. En su método, los hemocitos sonProtegido por la inmunotinción de peroxidasina, un marcador de hemocito, las células apoptóticas se tiñen utilizando el tinte nuclear, 7-amino actinomicina D en embriones enteros de Drosophila , y el número de células positivas dobles se cuenta como una señal de fagocitosis 17 . Otro ejemplo de un ensayo de fagocitosis en embriones se basa en el concepto de método de Nagata descrito anteriormente; Sin embargo, la fagocitosis in vivo se evalúa utilizando los embriones de dCAD ( Drosophila caspasa-DNasa activada) moscas mutantes [ 18 , 19] . Estos ensayos de fagocitosis in vivo son útiles para observar directamente la fagocitosis in situ . Sin embargo, las dificultades están asociadas con la exclusión de cualquier sesgo posible en el paso de contar células fagocitosas porque es difícil observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros debido a su grosor.

Para superar esta limitación, desarrollamosUn nuevo ensayo de fagocitosis en embriones de Drosophila . En nuestro método, para poder contar fácilmente los hemocitos fagocitados, se homogeneizan embriones enteros para preparar células embrionarias dispersas. Los fagocitos son detectados por la inmunotinción de un marcador de fagocitos, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL con estas células embrionarias dispersas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro que cuantificara con precisión el nivel de fagocitosis. Todos los genotipos de moscas pueden emplearse en este ensayo si se desarrollan hasta la etapa 16 de los embriones 20 , la etapa de desarrollo en la que la depuración de las células apoptóticas por fagocitosis es la más abundante. Este método tiene la ventaja de evaluar cuantitativamente el nivel de fagocitosis y, por tanto, puede contribuir a la identificación de nuevas moléculas implicadas en la fagocitosis de células apoptóticas in vivo .

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Protocol

1. Preparación

  1. Preparación de placas de agar de jugo de uva fresca
    1. Añadir 100 ml de agua a 4,4 g de agar y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver el agar.
    2. Añadir 80 ml de jugo de uva fresca, 5 ml de ácido acético y 5 ml de etanol en solución de agar.
    3. Verter aproximadamente 1,5 ml de la solución con una pipeta en cada portaobjetos de vidrio y dejar que se solidifique.
  2. Preparación de placas de 6 cm de placa de agarosa
    1. Añadir 50 ml de agua a 0,5 g de agarosa y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver la agarosa.
    2. Verter aproximadamente 2,5 ml de solución de agarosa en un plato de 6 cm con una pipeta.

2. Etapa 16 Colección de embriones

  1. Recoger las moscas adultas, y agregar 200 hembras y 200 machos en un tubo cónico de 50 ml.
  2. Ponga un plato de agar de jugo de uva fresco en la levadura en el tubo de 50 ml y cierre con una esponja capag.
  3. Incubar las moscas a 16 ° C en la luz durante 2 - 3 días. Cambiar la placa una vez al día.
  4. Mover las moscas a la oscuridad a 25 ° C durante 1 h.
  5. Cambiar el plato viejo a uno nuevo sin levadura. Permitir que las moscas pongan huevos durante 2 h.
  6. Recoger la placa e incubar a 16 ° C durante 26 h.
  7. Recoger los embriones de la placa con un pincel en 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  8. Lavar los embriones dos veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  9. Con el fin de eliminar el corion, agregar 1,2 ml de solución de hipoclorito de sodio (2,2 - 3,4% Cl) a los embriones durante 3 min.
  10. Lavar los embriones 4 veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  11. Colocar los embriones en placas de 6 cm de placa de agarosa. Recoge los embriones de la etapa 16 bajo un microscopio como describe Roberts 20 . Recoja aproximadamente 50 embriones en un tubo de prueba micro de Treff de 1,5 ml con una micropipeta.

3. PrepaRación de células embrionarias

  1. Lavar los embriones dos veces con 150 μL de PBS.
  2. Homogeneizar los embriones 30 veces en un tubo de micro test de 1,5 ml y mezclador de pellets en presencia de 200 μl de colagenasa (0,25% (p / v)) en PBS.
  3. Disperse las células embrionarias pipeteando 10 veces, y mover la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Incubar las células a 37 ° C durante 1 min en un baño de agua. Repita este paso dos veces.
  4. Añadir 800 μl de PBS a la suspensión celular y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  5. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 μ l de tripsina (0,25% (p / v)) en PBS a las células. Disperse las células embrionarias pipeteando 50 veces.
  6. Filtrar la suspensión celular con un filtro de células de 70 μm.
  7. Con el fin de detener la actividad tripsina, añadir 40 μ l de suero fetal bovino inactivado por calor a la suspensión de células filtradas. Añadir 800 μl de PBS y centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  8. Eliminar los supernatosNt, suspender las células precipitadas en 200 μl de PBS y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  9. Se retira el sobrenadante y se suspenden las células precipitadas en 30 μl de PBS.
  10. Montar la suspensión de células preparada en diapositivas de cristal revestidas con aminopropil trietoxisilano, y esperar 10-15 minutos hasta que las células se adhieran a las diapositivas de vidrio.
  11. Retire la solución restante en los portaobjetos de vidrio con una pipeta. Montar 60 - 70 μL de PBS que contenga PFA al 4% (p / v) (paraformaldehído) sobre las células durante 10 - 15 min para la fijación.
  12. Retire la solución de fijación y coloque los portaobjetos de vidrio en PBS durante más de 1 min.

4. Tinción de los hemocitos

  1. La inmunotinción con un anticuerpo anti-Croquemort
    1. Se empapan en serie los portaobjetos de vidrio en metanol durante 10 min, en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y luego en PBS durante 10 min.
    2. Montar 20 μl de suero de cerdo entero al 5% (v / v) en PBSNg 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células para el bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Eliminar la solución de las diapositivas de vidrio y montar 20 μl de antisuero anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche.
    4. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    5. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min.
    6. Colocar 20 μl de IgG anti-rata marcada con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h.
    7. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    8. Remojar portaobjetos de vidrio en tampón que contenía 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min.
    9. La solución de sustrato de fosfatasa de montaje que contiene 0,23 mg / ml de 5-bromo-4cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml nitro azul tetrazolio (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células.
    10. Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando aparecen fuertes señales púrpuras en los gránulos de los hemocitos, se retira la solución del sustrato y se empapa las diapositivas de vidrio en un tampón que consiste en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 5 a 10 minutos.
  2. La inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP (otra opción para la tinción de hemocitos)
    1. Se empapan en serie las láminas de vidrio en metanol durante 10 min, PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y PBS durante 10 min.
    2. Monte 20 μl de suero entero de cerdo al 5% (v / v) en PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% (v / v) en las células para bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Eliminar la solución en portaobjetos de vidrio y montar 20 μl del anticuerpo anti-GFP de ratón (1% (v / v)) / PBS cObteniendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche.
    4. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    5. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min.
    6. Colocar 20 μl de IgG anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero de Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h.
    7. Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces.
    8. Remojar portaobjetos de vidrio en tampón constituido por 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min.
    9. Montar la solución de sustrato de fosfatasa que contiene 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células.
    10. Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando las señales de color púrpura aparecen en hemocitos enteros, retire la solución de sustrato y pase las diapositivas en un tampón que consiste enDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 10 - 15 min.

5. Stain Apoptotic Cells de TUNEL

  1. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 5 min.
  2. Repita con el nuevo PBS.
  3. Monte el tampón de equilibrio (véase la Tabla de Materiales) sobre las células durante 10 min.
  4. Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y monte 20 μL de solución de TdT que contenga 5 μL de desoxinucleotidil transferasa terminal y 15 μL de tampón de reacción en las células a 37 ° C durante 1 h.
  5. Retirar la solución de los portaobjetos de vidrio y empapar las diapositivas en un tampón que consiste en 0,5 mL de STOP / tampón de lavado y 17 mL de agua.
  6. Remoje las diapositivas en PBS durante 5 min 3 veces.
  7. Montar 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidasa en las células a temperatura ambiente durante 30 min.
  8. Remoje las diapositivas de vidrio en PBS durante 5 min 4 veces.
  9. Sumerja los portaobjetos de vidrio en solución de sustrato de peroxidasa que consta de 30 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 conteniendoga completo espátula micro de 3,3'-diaminobencidina tetrahydrichloride (DAB), y 0,002% (v / v) H 2 O 2 durante 30 s.
  10. Repita el paso 5.9 hasta que las células apoptóticas estén manchadas de color marrón. Sumerja los portaobjetos de vidrio en agua para detener la reacción de la peroxidasa.
  11. Encierre las células con agua para la observación.

6. Medir el nivel de fagocitosis de las células apoptóticas

  1. Observe las muestras bajo un microscopio óptico para evaluar el nivel de fagocitosis. Contar células positivas a Croquemort o células GFP positivas como hemocitos, células positivas a TUNEL como células apoptóticas y células positivas dobles como hemocitos fagocitantes.
  2. El índice fagocítico se define como el número de células dobles positivas al número total de células positivas a Croquemort o células positivas para GFP. Se recomienda observar más de 300 hemocitos.

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Representative Results

Con el fin de examinar la fagocitosis de las células apoptóticas, Drosophila embriones de desarrollo etapa 16 fueron recogidos y preparados como células dispersas. Los hemocitos, macrófagos de Drosophila , se tiñeron por inmunocitoquímica para el marcador de hemocito "Croquemort" 17 , 22 usando un anticuerpo específico 19 , 21 , y las células apoptóticas se tiñeron con TUNEL en células embrionarias dispersadas ( Figura 1A ). Croquemort, un Drosophila CD36 relacionados con el receptor, se expresa específicamente en todos los embriones hemocitos [ 22] , y se ha demostrado genéticamente a participar en el aclaramiento de las células apoptóticas en Drosophila embriones [ 17] . Las células positivas a Croquemort tienen señales moradas en los pequeños gránulos de sus células. Las células TUNEL-positivas muestran abRown en los corpus enteros. Las células positivas a TUNEL son más pequeñas que otras células, y algunas están dentro de células positivas a Croquemort, que se consideran células muertas fagocitadas. Entre 2 y 10% de células positivas a Croquemort y 1 a 5% de células TUNEL positivas se observan normalmente en todas las células embrionarias.

En Drosophila , hay dos vías de señalización para el engolfamiento de las células apoptóticas. Dos receptores de fagocitosis para las vías correspondientes, Draper y la integrina α PS3 β ν, reconocen independientemente las células muertas 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper es una proteína transmembrana que posee secuencias atípicas del tipo del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la región extracelular y los dos motivos fosforilables NPxY y YxxL en el iPorción ntracelular 26 . Integrina α PS3 β ν es también un receptor transmembrana que consiste en un heterodímero de α y β subunidades [ 25] . La Figura 1B muestra la proporción de hemocitos fagocitados a hemocitos totales en embriones mutantes sencillos de tipo salvaje o drpr o Itgbn . Mediante el recuento de todas las células positivas a Croquemort (hemocitos totales) y Croquemort - y TUNEL - células doblemente positivas (fagocitosis de hemocitos), se calculó el índice fagocítico como el número de hemocitos fagocitantes al número total de hemocitos. El índice fagocítico fue menor en el mutante drpr o Itgbn que en el tipo salvaje, mientras que el número de hemocitos y células apoptóticas fueron similares ( Figura 1C- D ), lo que indica que estos dos genes son necesarios para el engorgamiento de células apoptóticas, como anteriormente rEported.

Cuando no se dispone de un anticuerpo anti-Croquemort o se examinan líneas mutantes con expresión alterada de Croquemort, necesitamos seleccionar otra opción para detectar hemocitos. Los embriones con un controlador GAL4 controlado por un promotor específico de hemocitos ( srpHemo-GAL4 ) y el gen GFP controlado por una secuencia de activación ascendente (UAS) incluyendo el sitio de unión a GAL4 ( UAS-EGFP ), tienen hemocitos marcados con GFP 27 , Que nos permite detectar hemocitos usando anti-GFP. La Figura 2A muestra una imagen obtenida después de detectar hemocitos y células apoptóticas con inmunotinción usando un anticuerpo anti-GFP, y TUNEL en células embrionarias con srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Mientras que un anticuerpo anti-Croquemort mancha pequeños gránulos en las células, un anticuerpo anti-GFP mancha hemocitos enteros. Similar a la Figura 1A , 2 - 6% de células positivas para GFP y 1 - 5% de TUNEL positivo Las células se observan en todas las células embrionarias. Algunas células positivas a TUNEL se detectan dentro de células GFP positivas, que se consideran células muertas fagocitadas. RNAi mediada knockdown se aplica fácilmente para evaluar cualquier genes por su participación en la fagocitosis cruzando las moscas con la UAS-dsRNA de los genes candidatos con srpHemo-GAL4UAS-EGFP . El desprendimiento mediado por RNAi de drpr o Itgbn redujo el índice fagocítico ( Figura 2B ), mientras que el número de hemocitos y células apoptóticas en células embrionarias fue comparable ( Figura 2C -2D ), lo que indica nuevamente que estos receptores de fagocitosis están implicados en la fagocitosis de Apoptóticas. Índices fagocíticos similares se obtienen de ambos métodos de detección de hemocitos, lo que sugiere que ambos son compatibles.

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Figura 1 : Tinción de células embrionarias por un anticuerpo anti-croquemort y TUNEL. ( A ) Imágenes de campo brillante de células embrionarias dispersas de la cepa w 1118 mediante inmunoticción con un anticuerpo anti-Croquemort y TUNEL. Se muestran vistas ampliadas de células representativas positivamente o negativamente teñidas (4 paneles superiores) y un campo de baja potencia (panel inferior). Barras graduadas, 5 μm (arriba); 50 μm (abajo). ( B ) Se analizó la proporción de hemocitos Croquemort-positivos con la señal TUNEL a todos los hemocitos Croquemort-positivos en el mutante drpr o Itgbn con células embrionarias dispersas. ( C ) La proporción de hemocitos Croquemort-positivos a todas las células en el mutante drpr o Itgbn se analizó con células embrionarias dispersas. (D) La relación de células apoptóticas TUNEL-positivas a todas las células en el drpr oSe analizó el mutante Itgbn con células embrionarias dispersas. Genotipos; W 1118 (control de tipo salvaje), drpr Δ5 (mutante drpr ) e Itgbn 2 (mutante de la integrina β ν). Los datos fueron representativos de tres experimentos independientes y analizados por el Student t- test. Aproximadamente 300 hemocitos Croquemort positivos se observaron en cada experimento, y los valores representan la media ± DE de tres campos microscópicos. *; pag & Lt; 0,05, ns; Diferencia no significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Tinción de células embrionarias por hormigaI-GFP y TUNEL. ( A ) Imágenes de campo brillante de células embrionarias dispersas de la cepa srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + mediante inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP y TUNEL. Se muestran vistas ampliadas de células representativas positivamente o negativamente teñidas (4 paneles superiores) y un campo de baja potencia (panel inferior). Barras de escala = 5 μm (arriba); 50 μm (abajo). ( B ) Se analizó la proporción de hemocitos GFP-positivos con la señal TUNEL a todos los hemocitos positivos para GFP en moscas de knockdown mediadas por RNAi de drpr o Itgbn con células embrionarias dispersas. ( C ) Se analizó la proporción de hemocitos GFP-positivos a todas las células en moscas de knockdown mediadas por RNAi de drpr o Itgbn con células embrionarias dispersas. ( D ) Se analizó la proporción de células apoptóticas positivas a TUNEL a todas las células en moscas de knockdown mediadas por RNAi de drpr o Itgbn con células embrionarias dispersas. Genotipos; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Los datos fueron representativos de tres experimentos independientes y analizados por el Student t- test. En cada experimento se observaron aproximadamente 300 hemocitos positivos para GFP y los valores representan la media ± DE de tres campos microscópicos. *; P <0,05, ns; Diferencia no significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este documento se describió un ensayo de fagocitosis utilizando embriones de Drosophila . Mediante el uso de células embrionarias dispersas para medir la fagocitosis cuantitativamente, los hemocitos, los fagocitos profesionales de Drosophila , son inmunocorados para el marcador de hemocitos Croquemort o srpHemo- dirigido GFP, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL en este protocolo. El nivel de fagocitosis se expresa como un índice fagocítico contando el número total de hemocitos y hemocitos fagocitados. El uso de células embrionarias dispersas nos permite observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros y cuantificar con precisión el nivel de fagocitosis. Además, nuestro método detecta hemocitos y células apoptóticas con tintes que son observables bajo un microscopio de luz, no un microscopio de fluorescencia. Esto facilita la evaluación de los niveles de fagocitosis porque es posible observar hemocitos y células apoptóticas simultáneamente sin cambiar ningún filtro.

En la inmunotinción de Croquemort, la incubación de células con anticuerpos anti-Croquemort debe realizarse en la etapa de fijación de las células embrionarias, A 4 ° C. En la tinción TUNEL, la incubación de células con DAB debe realizarse mediante un control minucioso bajo un microscopio para evitar la tinción excesiva.TUNEL visualiza el ADN fragmentado mediante la detección de 3'-OH, que es abundante en las células apoptóticas.Sin embargo, Las células normales también tienen 3'-OH en el extremo 3'-del ADN, pero a un nivel inferior que en las células apoptóticas.Por lo tanto, una incubación de células con DAB durante demasiado tiempo manchará no sólo las células apoptóticas, sino también las células normales La observación de las células cada 15 o 30 s durante la tinción DAB se recomienda para evitar esto.

En este protocolo, aunque la cuantificación del nivel de fagocitosis es rápida y precisa,Ch como el sitio de engolfamiento o distribución de hemocitos se pierde. Anteriormente se mostró que este ensayo y un ensayo de fagocitosis in situ utilizando embriones enteros produjo resultados similares en términos del índice fagocítico [ 21] . Por lo tanto, se recomienda realizar un ensayo de fagocitosis in situ en paralelo con el fin de interpretar con precisión los resultados obtenidos en algunos casos.

Drosophila tiene otro fagocito profesional, las células gliales, en el sistema nervioso central. Aunque no se describe cómo evaluar la fagocitosis de las neuronas apoptóticas por las células gliales en los embriones en este protocolo, el mismo protocolo se aplica para cuantificar el nivel de engolfamiento como el informado por Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . Asimismo, este ensayo sugiere que las células TUNEL positivas en los embriones de Drosophila es probable que sean fagocitados por fagocitos no profesionales. Fagocitosis por aquellos ph no identificadosLos agocitos con receptores de absorción desconocidos podrían explicar el resultado ( Figura 1D ) de que el número total de células apoptóticas en células embrionarias no parece estar aumentado en un mutante de gen de fagocitosis.

En conclusión, este protocolo ha conducido con éxito al descubrimiento de genes necesarios para la fagocitosis de las células apoptóticas por fagocitos profesionales. 24 , 25 , 28 . Basado en la conservación evolutiva de los mecanismos moleculares subyacentes a la fagocitosis [ 7] , revelar las funciones de genes en Drosophila embriones que implican complejo fagocitosis reacciones pueden proporcionar una visión significativa de la depuración fagocítica de células muertas, que está relacionado con los trastornos inflamatorios y autoinmunes en mamíferos 29 .

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Estamos agradecidos a Kaz Nagaosa y Akiko Shiratsuchi por su consejo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		 Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		 Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		 nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

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Inmunología Número 126 fagocitosis células apoptóticas, Embrión hemocito,
Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., … More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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