Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56352
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

Summary

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Abstract

De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fagocytose van apoptotische cellen moeten meer gedetailleerd worden toegelicht wegens de rol ervan in immuun- en ontstekingsrechterlijke ziektes. We hebben hierin een experimentele methode ontwikkeld om kwagocytose kwantitatief te onderzoeken met behulp van de vruchtvlieg Drosophila , waarbij het genenetwerk dat de ontvulingsreacties beheert evolutionair wordt bewaard van zoogdieren. Om nauwkeurig op te sporen en te counteren van phagocyten met behulp van hele dieren, werden Drosophila embryo's gehomogeniseerd om gedispergeerde cellen te verkrijgen, waaronder fagocyten en apoptotische cellen. Het gebruik van gedispergeerde embryonale cellen stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus te meten alsof we een in vitro fagocytose-analyse uitvoerden waarin alle fagocyten en apoptotische cellen in hele embryo's kunnen worden waargenomen en het niveau van fagocytose nauwkeurig kwantificeren. We hebben bevestigd dat deze methode die van vorige studies weergeeftDie de genen die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen geïdentificeerd. Deze methode maakt het mogelijk om de ontploffing van dode cellen te analyseren en zal, in combinatie met de krachtige genetica van Drosophila , de complexe fagocytische reacties onthullen die bestaan ​​uit de migratie, herkenning, verzwelling en afbraak van apoptotische cellen door fagocyten.

Introduction

Bij metazoandieren, bijvoorbeeld de nematode Caenorhabditis elegans , de vruchtvlieg Drosophila melanogaster en muizen en mensen, ondergaan een groot aantal cellen apoptose tijdens de ontwikkeling om hun lichaam en volwassenheid te vormen om homeostase 1 , 2 te behouden . Apoptotische cellen moeten snel verwijderd worden omdat ze ontsteking in de omringende weefsels veroorzaken door immunogene intracellulaire materialen vrij te laten indien niet volledig verwijderd 3 . Om de snelle verwijdering te vergemakkelijken, presenteren apoptotische cellen zogenaamde Eat-Me signalen die door de ontvulingsreceptoren van fagocyten worden herkend en worden geëlimineerd door fagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Derhalve speelt fagocytose een cruciale rol in het behoud van gastheerhomeostase, en dus de molecuul verhelderen Mechanismen die onderliggende zijn aan de fagocytose van apoptotische cellen is van belang.

De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen lijken evolutionair te behouden onder species in de nematoden, vliegen en muizen 7 . Verschillende fagocytose assays zijn momenteel beschikbaar om de opvulling van apoptotische cellen in deze modeldieren te beoordelen. In C. elegans ondergaan 131 somatische cellen geprogrammeerde celsterfte tijdens de ontwikkeling, en cellichamen worden gefagocytoseerd door naburige cellen, die niet-professionele fagocyten zijn 8 . Dus, het aantal resterende cellichamen in C. elegans telt het niveau van fagocytose in vivo . Door te zoeken naar nematode mutanten die een verhoogd aantal dode cellen aantonen, zijn verschillende genen die nodig zijn voor fagocytose geïdentificeerd en genetisch gekenmerkt 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Ex vivo fagocytose assays met primaire cultuur fagocyten, in het algemeen macrofagen, worden vaak in muizen gebruikt. Apoptotische cellen worden bereid met behulp van cellijnen zoals Jurkat-cellen, en worden gemengd met primaire fagocyten. Na een incubatie gedurende enkele uren worden de totale aantallen fagocyten en ontvlamende fagocyten geteld om het niveau van fagocytose te beoordelen. Als een verfijnde wijziging van deze methode ontwikkelde Nagata's groep een ex vivo fagocytose-analyse met cellen die een caspase-resistente ICAD (inhibitor van caspase-geactiveerde DNase) uitdrukken, waarbij apoptotische cellen geen apoptotische DNA-fragmentatie ondergaan, maar DNA wordt nog steeds gesplitst wanneer Cellen zijn gefagocytoseerd. Wanneer deze cellen worden gebruikt als apoptotische doelen in een fagocytose-analyse, is alleen het DNA van opgezwakte apoptotische cellen gefragmenteerd en gekleurd door TdT-gemedieerde DUTP nick end labeling (TUNEL). Daarom leve1 van apoptotische celvergisting wordt gemeten door TUNEL signalen in een mengsel van fagocyten en apoptotische cellen 13 te tellen.

In D. melanogaster zijn professionele fagocyten genaamd hemocyten, Drosophila macrofagen, verantwoordelijk voor de fagocytose van apoptotische cellen 14 , 15 . Naast in vitro phagocytose assays met cultuurcellijnen, zijn in vivo phagocytose assays met hele Drosophila embryo's beschikbaar. Drosophila embryo's zijn een krachtig hulpmiddel om het niveau van apoptotische celvervulling te onderzoeken omdat veel cellen apoptose ondergaan en gefagocytoseerd worden door hemocyten tijdens embryonale ontwikkeling 14 , 15 , 16 . Een voorbeeld van een in vivo fagocytose assay is de methode ontwikkeld door Franc's groep. In hun werkwijze zijn hemocyten deGetekend door het immunostaining van peroxidasine, een hemocytmarkering, worden apoptotische cellen gekleurd met behulp van de nucleaire kleurstof, 7-aminoactinomycine D in hele Drosophila embryo's en het aantal dubbele positieve cellen wordt geteld als een signaal van fagocytose 17 . Een ander voorbeeld van een fagocytose-bepaling op embryo's is gebaseerd op het concept van Nagata's methode die hierboven is beschreven; In vivo wordt fagocytose echter geëvalueerd met behulp van de embryo's van dCAD ( Drosophila caspase-geactiveerde DNase) mutante vliegen 18 , 19 . Deze in vivo fagocytose assays zijn bruikbaar voor het direct observeren van fagocytose in situ . Echter, problemen zijn geassocieerd met het uitsluiten van eventuele vooroordeel in de stap van het telgen van fagocytosecellen omdat het moeilijk is om alle fagocyten en apoptotische cellen in volledige embryo's te observeren vanwege de dikte ervan.

Om deze beperking te overwinnen ontwikkelen wijEen nieuwe fagocytose-analyse in Drosophila embryo's uitgegeven. In onze werkwijze, om gemakkelijk fagocytoserende hemocyten te tellen, worden gehele embryo's gehomogeniseerd om verspreide embryonale cellen te bereiden. Fagocyten worden gedetecteerd door het immunostaining van een fagocyt markering, en apoptotische cellen worden gedetecteerd door TUNEL met deze gedispergeerde embryonale cellen. Het gebruik van gedispergeerde embryonale cellen stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus te meten alsof we een in vitro fagocytose-analyse uitvoeren die precies het niveau van fagocytose kwantificeert. Alle genotypes van vliegen kunnen in deze test worden gebruikt als ze zich ontwikkelen tot stadium 16 van embryo's 20 , de ontwikkelingsfase waarbij apoptotische celklaring door fagocytose het meest voorkomend is. Deze werkwijze heeft het voordeel om het niveau van fagocytose kwantitatief te beoordelen en kan derhalve bijdragen aan de identificatie van nieuwe moleculen die betrokken zijn bij de fagocytose van apoptotische cellen in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding

  1. Bereiding van verse agarplaten van druivensap
    1. Voeg 100 ml water toe aan 4,4 g agar en verhit het mengsel in een magnetron om agar op te lossen.
    2. Voeg 80 ml vers druivensap, 5 ml azijnzuur en 5 ml ethanol toe aan agaroplossing.
    3. Giet ongeveer 1,5 ml van de oplossing met een pipet op elke glazen glijbaan en laat het stollen.
  2. Bereiding van 6 cm schaal agarose platen
    1. Voeg 50 ml water toe aan 0,5 g agarose en verhit het mengsel in een magnetron om agarose op te lossen.
    2. Giet ongeveer 2,5 ml agarose oplossing op een 6 cm schaal met een pipet.

2. Fase 16 Embryo Collectie

  1. Verzamel volwassen vliegen, en voeg 200 vrouwtjes en 200 mannetjes toe in een 50 ml conische buis.
  2. Leg een bord verse druivensapagar op gist in de 50 ml buis en sluit met een sponsje ca.p.
  3. Incubeer de vliegen bij 16 ° C in het licht gedurende 2 - 3 dagen. Verander de plaat een keer per dag.
  4. Verplaats de vliegen naar het donker bij 25 ° C gedurende 1 uur.
  5. Vervang de oude bord naar een nieuwe zonder gist. Laat vliegen toe om eieren gedurende 2 uur te leggen.
  6. Verzamel de plaat en incubeer bij 16 ° C gedurende 26 uur.
  7. Verzamel embryo's uit de plaat met een verfborstel in 1 ml PBS die 0,2% (v / v) Triton X-100 bevat.
  8. Was embryo's tweemaal met 1 ml PBS die 0,2% (v / v) Triton X-100 bevat.
  9. Om de chorion te verwijderen voegt u 1,2 ml natriumhypochlorietoplossing (2,2 - 3,4% Cl) toe aan embryo's gedurende 3 minuten.
  10. Was embryo's 4 keer met 1 ml PBS die 0,2% (v / v) Triton X-100 bevat.
  11. Plaats embryo's op 6 cm schaal agarose platen. Pak stadium 16 embryo's onder een microscoop zoals beschreven door Roberts 20 . Verzamel ongeveer 50 embryo's in een 1,5 ml Treff micro-testbuis met een micropipette.

3. PrepaRantsoen van embryonale cellen

  1. Was embryo's tweemaal met 150 μL PBS.
  2. Homogeen embryo's 30 keer in een 1,5 ml micro-testbuis en pelletmenger in de aanwezigheid van 200 μl collagenase (0,25% (w / v)) in PBS.
  3. Disperse embryonale cellen door 10 keer te pipetteren en verplaats de cel suspensie naar een 1,5 ml buis. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 1 minuut in een waterbad. Herhaal deze stap twee keer.
  4. Voeg 800 μL PBS aan de celsuspensie toe en centrifugeer bij 1400 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  5. Verwijder de supernatant en voeg 200 μL trypsine (0,25% (w / v)) in PBS toe aan de cellen. Disperse embryonale cellen door 50 keer te pipetteren.
  6. Filtreer de cel suspensie met een 70 μm Cell Strainer.
  7. Om de trypsineactiviteit te stoppen, voeg 40 μL warmte-geïnactiveerde foetale runder serum toe aan de gefiltreerde cel suspensie. Voeg 800 μL PBS toe en centrifugeer bij 1400 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder de supernataNt, geprecipiteerde cellen opschorten in 200 μl PBS en centrifugeer bij 1400 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  9. Verwijder het supernatant, en laat geprecipiteerde cellen op in 30 μl PBS.
  10. Monteer de bereide celsuspensie op aminopropyltriethoxysilaan beklede glazen glijbanen en wacht 10 tot 15 minuten tot cellen aan de glazen glijbanen bevestigen.
  11. Verwijder de resterende oplossing op de glazen glijbanen met een pipet. Monteer 60 - 70 μl PBS die 4% (w / v) PFA (paraformaldehyde) op 10 tot 15 minuten op cellen bevat voor fixatie.
  12. Verwijder de fixatieoplossing en plaats de glazen glijbanen in PBS gedurende meer dan 1 minuut.

4. Verven van hemocyten

  1. Immunostaining met een anti-Croquemort antilichaam
    1. Serieel glasglijbanen in methanol gedurende 10 min in methanol laten vallen, in PBS bevattende 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten en vervolgens gedurende 10 minuten in PBS.
    2. Zet 20 μl 5% (v / v) gehele varkensserum in PBS bevattenNg 0,2% (v / v) Triton X-100 op cellen voor blokkeren. Incubeer glijbanen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    3. Verwijder de oplossing uit glazen glijbanen en plaats 20 μL anti-Croquemort antiserum 19 , 21 (0,1% (v / v)) in PBS die 0,2% (v / v) Triton X-100 op cellen bevat. Incubeer glijbanen bij 4 ° C overnacht.
    4. Zweef de glijbanen in PBS met 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten 5 keer.
    5. Slijp de glazen glijbanen in PBS gedurende 10 minuten.
    6. Zet 20 μl alkalisch fosfatase-gemerkt anti-rat IgG (0,5% (v / v)) in PBS bevattende 0,2% (v / v) Triton X-100 en 5% (v / v) Temperatuur gedurende 1 uur.
    7. Zweef de glijbanen in PBS met 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten 5 keer.
    8. Genieten glasplaatjes in buffer die 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2 gedurende 10 minuten.
    9. Monteer fosfatase substraat oplossing die 0,23 mg / ml 5-broom-4 bevatchloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP), 0,35 mg / ml nitro blue tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2 aan de cellen.
    10. Let op de cellen onder een microscoop voor een goede kleuring. Wanneer sterke paarse signalen verschijnen in de hemocytenkorrels, verwijder u de substraatoplossing en blik de glazen glijbanen in buffer bestaande uit 10 mM Tris-HCI, pH 8,5 en 1 mM EDTA. Staining voor ongeveer 5 - 10 minuten wordt aanbevolen.
  2. Immunostaining met een anti-GFP antilichaam (een andere mogelijkheid voor het vlekken van hemocyten)
    1. Serieel glijglas glijdt in methanol gedurende 10 minuten, PBS bevattende 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten en PBS gedurende 10 minuten.
    2. Zet 20 μl 5% (v / v) gehele varkensserum in PBS die 0,2% (v / v) Triton X-100 op cellen bevat om te blokkeren. Incubeer glijbanen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    3. Verwijder de oplossing op glazen glijbanen en monteer 20 μL anti-GFP antistof van de muis (1% (v / v)) / PBS c0,2% (v / v) Triton X-100 op cellen verkregen. Incubeer glijbanen bij kamertemperatuur 's nachts.
    4. Zweef de glijbanen in PBS met 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten 5 keer.
    5. Slijp de glazen glijbanen in PBS gedurende 10 minuten.
    6. Zet 20 μl alkalisch fosfatase-gemerkt anti-muis IgG (0,5% (v / v)) in PBS bevattende 0,2% (v / v) Triton X-100 en 5% (v / v) Temperatuur gedurende 1 uur.
    7. Zweef de glijbanen in PBS met 0,2% (v / v) Triton X-100 gedurende 10 minuten 5 keer.
    8. Genieten glasplaatjes in buffer bestaande uit 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2 gedurende 10 minuten.
    9. Monteren fosfatase substraatoplossing die 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2 aan de cellen.
    10. Let op de cellen onder een microscoop voor een goede kleuring. Wanneer paarse signalen verschijnen in gehele hemocyten, verwijder u de substraatoplossing en week de glijbanen in de bestaande bufferVan 10 mM Tris-HCl, pH8,5 en 1 mM EDTA. Staining voor ongeveer 10 - 15 minuten wordt aanbevolen.

5. Vlek Apoptotische cellen door TUNEL

  1. Week de glijbanen in PBS gedurende 5 minuten.
  2. Herhaal met nieuwe PBS.
  3. Monteer Equilibratiebuffer (zie Materialetabel) op cellen gedurende 10 minuten.
  4. Verwijder de oplossing uit glazen glijbanen en plaats 20 μL TdT-oplossing die 5 μl terminale deoxynucleotidyltransferase en 15 μl Reactiebuffer op cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur bevat.
  5. Verwijder de oplossing uit glazen glijbanen en week de glijbanen in buffer bestaande uit 0,5 ml STOP / Wash buffer en 17 ml water.
  6. Week de slides in PBS gedurende 5 minuten 3 keer.
  7. Zet 20 μl anti-digoxigenine-peroxidase op cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  8. Zet glas glijbanen in PBS gedurende 5 minuten 4 keer.
  9. Zweef de glazen glijbanen in peroxidase substraatoplossing bestaande uit 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH7,5 containinga volledige micro spatel 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB) en 0,002% (v / v) H 2 O 2 gedurende 30 s.
  10. Herhaal stap 5.9 totdat apoptotische cellen bruin zijn gekleurd. Zweef de glazen glijbanen in water om de peroxidase-reactie te stoppen.
  11. Omcellen cellen met water voor observatie.

6. Meet het niveau van phagocytose van apoptotische cellen

  1. Let op de monsters onder een lichtmicroscoop om het niveau van fagocytose te beoordelen. Tel Croquemort-positieve cellen of GFP-positieve cellen als hemocyten, TUNEL-positieve cellen als apoptotische cellen en dubbele positieve cellen als fagocytoserende hemocyten.
  2. De fagocytische index wordt gedefinieerd als het aantal dubbele positieve cellen tot het totale aantal Croquemort-positieve cellen of GFP-positieve cellen. Het wordt aanbevolen dat meer dan 300 hemocyten worden waargenomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de fagocytose van apoptotische cellen te onderzoeken werden Drosophila embryo's van ontwikkelingsstadium 16 verzameld en bereid als gedispergeerde cellen. Hemocytes, Drosophila macrofagen, werden gekleurd door immunocytochemie voor hemocyte marker "Croquemort" 17, 22 met behulp van een specifiek antilichaam 19, 21 en apoptotische cellen werden gekleurd door TUNEL in gedispergeerde embryonale cellen (Figuur 1A). Croquemort, een Drosophila CD36-gerelateerde receptor, wordt specifiek uitgedrukt op alle embryonale hemocyten 22 , en is genetisch gezien betrokken bij de opruiming van apoptotische cellen in Drosophila embryo's 17 . Croquemort-positieve cellen hebben paarse signalen in de kleine korrels van hun cellen. TUNEL-positieve cellen tonen abGebroken signaal in hele corpussen. TUNEL-positieve cellen zijn kleiner dan andere cellen, en sommige zijn binnen Croquemort-positieve cellen, die worden beschouwd als fagocyteerde dode cellen. Tussen 2 en 10% worden Croquemort-positieve cellen en 1 - 5% TUNEL-positieve cellen waargenomen in alle embryonale cellen.

In Drosophila zijn er twee signaalbanen voor het opvallen van apoptotische cellen. Twee fagocytose receptoren voor de overeenkomstige pathways, Draper en integrin α PS3 β v, herkennen zelfstandig dode cellen 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper is een transmembrane eiwit dat atypische epidermale groeifactor (EGF) -gelijke sequenties bezit in het extracellulaire gebied en de twee fosforylatabele motieven NPxY en YxxL in het iNtracellulaire deel 26 . Integrin α PS3 β v is ook een transmembrane receptor die bestaat uit een heterodimeer van a en β subeenheden 25 . Figuur 1B toont de verhouding van fagocytoserende hemocyten tot totale hemocyten in wild-type of drpr- of Itgbn- enkele mutante embryo's. Door alle Croquemort-positieve cellen (totale hemocyten) en Croquemort- en TUNEL-dubbele positieve cellen (phagocytoserende hemocyten) te berekenen, berekenen we de fagocytische index als het aantal fagocytoserende hemocyten tot het totale aantal hemocyten. De fagocytische index was lager in de drpr- of Itgbn- mutant dan in het wildtype, terwijl de aantallen hemocyten en apoptotische cellen vergelijkbaar waren ( Figuur 1C- D ), wat aangeeft dat deze twee genen nodig zijn voor apoptotische celvergisting zoals eerdereported.

Wanneer een anti-Croquemort antilichaam niet beschikbaar is of mutante lijnen met gewijzigde Croquemort-expressie worden onderzocht, moeten we een andere optie selecteren om hemocyten te detecteren. Embryo's met een GAL4-stuurprogramma gecontroleerd door een hemocytspecifieke promotor ( srpHemo-GAL4 ) en het GFP-gen dat wordt gecontroleerd door een stroomopwaartse activeringssequentie (UAS) die de GAL4-bindingsplaats ( UAS-EGFP ) omvat, hebben GFP-gelabelde hemocyten 27 , Waarmee we hemocyten kunnen detecteren met behulp van anti-GFP. Figuur 2A toont een beeld verkregen na het detecteren van hemocyten en apoptotische cellen met immunostaining onder toepassing van een anti-GFP antilichaam en TUNEL in embryonale cellen met srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Terwijl een anti-Croquemort antilichaam kleine granules in cellen vlekt, vlekt een anti-GFP antilichaam hele hemocyten. Vergelijkbaar met Figuur 1A , 2 - 6% GFP-positieve cellen en 1 - 5% TUNEL-positief Cellen worden waargenomen in alle embryonale cellen. Sommige TUNEL-positieve cellen worden gedetecteerd binnen GFP-positieve cellen, die worden beschouwd als fagocyteerde dode cellen. RNAi-gemedieerde knockdown wordt gemakkelijk toegepast om eventuele genen te beoordelen voor hun betrokkenheid bij fagocytose door vliegen te crossen met het UAS-dsRNA van de kandidaatgenen met srpHemo-GAL4UAS-EGFP . De RNAi-gemedieerde knockdown van drpr of Itgbn verminderde de fagocytische index ( Figuur 2B ), terwijl de aantallen hemocyten en apoptotische cellen in embryonale cellen vergelijkbaar waren ( Figuur 2C -2D ), wat opnieuw aangeeft dat deze fagocytose receptoren betrokken zijn bij de fagocytose van Apoptotische cellen. Soortgelijke fagocytische indexen worden verkregen uit beide hemocytdetectiemethoden, wat suggereert dat beide compatibel zijn.

G "/>
Figuur 1 : Vlek van embryonale cellen door een anti-Croquemort-antilichaam en TUNEL. ( A ) Heldere veldbeelden van gedispergeerde embryonale cellen uit de w 1118 stam door immunostaining met een anti-Croquemort antilichaam en TUNEL. Vergrote weergaven van representatieve positieve of negatief gekleurde cellen (top 4 panelen) en een laag vermogen veld (onderpaneel) worden getoond. Schaalstaven, 5 μm (bovenkant); 50 μm (bodem). ( B ) De verhouding van Croquemort-positieve hemocyten met het TUNEL-signaal naar alle Croquemort-positieve hemocyten in de drpr- of Itgbn- mutant werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. ( C ) De verhouding van Croquemort-positieve hemocyten aan alle cellen in de drpr- of Itgbn- mutant werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. ( D ) De verhouding TUNEL-positieve apoptotische cellen aan alle cellen in de drpr ofItgbn mutant werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. genotypen; w 1118 (wild type controle), drpr Δ5 (drpr mutant) en Itgbn 2 (integrine β ν mutant). Gegevens waren representatief voor drie onafhankelijke experimenten en geanalyseerd door de student's t- test. Ongeveer 300 Croquemort-positieve hemocyten werden waargenomen in elk experiment, en de waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van drie microscopische velden. *; p <0,05, ns; Verschil niet significant Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Vlek van embryonale cellen door AntI-GFP en TUNEL. ( A ) Heldere veldafbeeldingen van gedispergeerde embryonale cellen uit de srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + stam door immunostaining met een anti-GFP antilichaam en TUNEL. Vergrote weergaven van representatieve positieve of negatief gekleurde cellen (top 4 panelen) en een laag vermogen veld (onderpaneel) worden getoond. Schaalstaven = 5 μm (bovenste); 50 μm (bodem). ( B ) De verhouding van GFP-positieve hemocyten met het TUNEL-signaal naar alle GFP-positieve hemocyten in RNAi-gemedieerde knockdown vliegen van drpr of Itgbn werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. ( C ) De verhouding van GFP-positieve hemocyten aan alle cellen in RNAi-gemedieerde knockdown vliegen van drpr of Itgbn werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. ( D ) De verhouding TUNEL-positieve apoptotische cellen aan alle cellen in RNAi-gemedieerde knockdown vliegen van drpr of Itgbn werd geanalyseerd met gedispergeerde embryonale cellen. genotypen; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Gegevens waren representatief voor drie onafhankelijke experimenten en geanalyseerd door de student's t- test. In elk experiment werden ongeveer 300 GFP-positieve hemocyten waargenomen, en de waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van drie microscopische velden. *; P <0,05, ns; Verschil niet significant Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij hebben hierin een fagocytose-bepaling beschreven met behulp van Drosophila embryo's. Door gebruik te maken van gedispergeerde embryonale cellen om kwagocytose te kwantitatief te meten, zijn hemocyten, professionele profiocyten van Drosophila immunostained voor de hemocytmarker Croquemort of srpHemo- gedreven GFP, en in dit protocol worden apoptotische cellen gedetecteerd door TUNEL. Het niveau van fagocytose wordt uitgedrukt als een fagocytische index door het totale aantal hemocyten en fagocytoserende hemocyten te tellen. Het gebruik van gedispergeerde embryonale cellen stelt ons in staat alle phagocyten en apoptotische cellen in volledige embryo's te observeren en het niveau van fagocytose nauwkeurig te kwantificeren. Bovendien detecteert onze methode hemocyten en apoptotische cellen met kleurstoffen die onder een lichtmicroscoop waarneembaar zijn, niet een fluorescentiemicroscoop. Dit vergemakkelijkt de beoordeling van fagocytose niveaus omdat het mogelijk is om hemocyten en apoptotische cellen gelijktijdig te waarnemen zonder om het even welke filter te veranderen.

Ve_content "> De volgende punten zijn van cruciaal belang voor het vinken van embryonale cellen. In de fixatie stap van embryonale cellen moet een nieuwe PFA bereid binnen twee weken worden gebruikt. Bij de immunostaining van Croquemort moet de incubatie van cellen met anti-Croquemort worden uitgevoerd Bij 4 ° C. Bij TUNEL-kleuring moet de incubatie van cellen met DAB worden uitgevoerd door zorgvuldig te controleren onder een microscoop om overmatig kleuring te voorkomen. TUNEL visualiseert gefragmenteerd DNA door het detecteren van 3'-OH, dat veel voorkomt bij apoptotische cellen. Normale cellen hebben ook 3'-OH in de 3'-terminale van DNA, maar op een lager niveau dan in apoptotische cellen. Daarom zal een incubatie van cellen met DAB te lang niet alleen apoptotische cellen vlek, maar ook normale cellen De waarneming van cellen om de 15 of 30 s tijdens de DAB-kleuring wordt aanbevolen om dit te voorkomen.

In dit protocol, hoewel kwantificering van het niveau van fagocytose snel en nauwkeurig is, bevat sommige informatie suCh als de plaats van ontvulling of distributie van hemocyten verloren gaat. We hebben eerder aangetoond dat deze analyse en een in situ phagocytose assay met behulp van hele embryo's soortgelijke resultaten opleveren in termen van de fagocytische index 21 . Daarom raden we aan een in situ phagocytose-analyse parallel uit te voeren om de resultaten die in sommige gevallen zijn verkregen nauwkeurig te interpreteren.

Drosophila heeft een andere professionele fagocyt, glialcellen, in het centrale zenuwstelsel. Hoewel we niet beschrijven hoe u de fagocytose van apoptotische neuronen door gliale cellen in embryo's in dit protocol beoordeelt, wordt hetzelfde protocol toegepast om het niveau van ontvulling te kwantificeren zoals die gerapporteerd door Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . Evenzo suggereert deze analyse dat TUNEL-positieve cellen in Drosophila embryo's waarschijnlijk gefagocytoseerd worden door niet-professionele fagocyten. Fagocytose door die onbekende phAgocyten met onbekende ontvulingsreceptoren kunnen het resultaat verklaren ( Figuur 1D ) dat het totale aantal apoptotische cellen in embryonale cellen niet lijkt te worden verhoogd in een fagocytose-genmutant.

Ten slotte heeft dit protocol succesvol geleid tot de ontdekking van genen die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen door professionele fagocyten. 24 , 25 , 28 . Gebaseerd op het evolutionaire behoud van de moleculaire mechanismen die onderliggende fagocytose 7 liggen , kunnen onthullende genfuncties in Drosophila embryo's die complexe fagocytose reacties betreffen, significante inzichten verschaffen in de fagocytische klaring van dode cellen, die verband houdt met ontstekingsstoornissen en auto-immuunziekten bij zoogdieren 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor Kaz Nagaosa en Akiko Shiratsuchi voor hun advies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		 Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		 Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		 nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116 (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96 (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107 (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117 (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).

Tags

Immunologie Uitgave 126 fagocytose apoptotische cellen, Embryo hemocyt,
Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., … More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter