Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagocytosanalys för apoptotiska celler i doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Här beskrivs en fagocytosanalys med användning av de dispergerade embryonala cellerna i Drosophila . Det gör att vi enkelt och exakt kan kvantifiera fagocytosnivåer in vivo och att identifiera nya molekyler som krävs för fagocytos av apoptotiska celler.

Abstract

De molekylära mekanismerna som ligger bakom fagocytos av apoptotiska celler behöver belysas mer i detalj på grund av dess roll i immun- och inflammatoriska ojämna sjukdomar. Här har vi utvecklat en experimentell metod för att undersöka fagocytos kvantitativt med hjälp av fruktflugan Drosophila , där genenätverket som styr engulferingsreaktioner är evolutionellt konserverade från däggdjur. För att noggrant detektera och räkna engulfing och un-engulfing fagocyter med hela djur homogeniserades Drosophila embryon för att erhålla dispergerade celler innefattande fagocyter och apoptotiska celler. Användningen av dispergerade embryonala celler gör det möjligt för oss att mäta in vivo fagocytosnivåer som om vi utförde en in vitro fagocytosanalys där det är möjligt att observera alla fagocyter och apoptotiska celler i hela embryon och exakt kvantifiera nivån av fagocytos. Vi bekräftade att den här metoden återger de tidigare studiernaSom identifierade de gener som erfordras för fagocytos av apoptotiska celler. Denna metod medger att engulfering av döda celler kan analyseras och när de kombineras med den kraftfulla genetiken hos Drosophila kommer att avslöja de komplexa fagocytiska reaktionerna som innefattas av migrering, igenkänning, engulfering och nedbrytning av apoptotiska celler av fagocyter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I metazoiska djur, t.ex. nematoden Caenorhabditis elegans , fruktflugan Drosophila melanogaster och möss och människor, genomgår ett stort antal celler apoptos under utveckling för att forma sina kroppar och i vuxenlivet för att upprätthålla homeostas 1 , 2 . Apoptotiska celler måste avlägsnas snabbt eftersom de inducerar inflammation i de omgivande vävnaderna genom att frigöra immunogena intracellulära material om de inte helt avlägsnas 3 . För att underlätta snabbt avlägsnande presenterar apoptotiska celler så kallade ägg-mig-signaler som kännetecknas av engulferingsreceptorerna av fagocyter och elimineras av fagocytos 3 , 4 , 5 , 6 . Fagocytos spelar således en avgörande roll för upprätthållandet av värdhomeostas och därmed belyser molekylen Lar mekanismer som ligger bakom fagocytos av apoptotiska celler är av betydelse.

Mekanismerna som är ansvariga för fagocytos av apoptotiska celler verkar vara bevarade evolutionärt bland arter i nematoderna, flugorna och mössen 7 . Flera fagocytosanalyser är för närvarande tillgängliga för att bedöma engulferingen av apoptotiska celler i dessa modelldjur. I C. elegans genomgår 131 somatiska celler programmerad celldöd under utveckling, och cellkroppar fagocyteras av närliggande celler, vilka är icke-professionella fagocyter 8 . Således räknar antalet återstående cellkroppar i C. elegans nivån av fagocytos in vivo . Genom att leta efter nematodmutanter som visar ett ökat antal döda celler har flera gener som krävs för fagocytos identifierats och genetiskt karakteriseras 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Ex vivo fagocytosanalyser med primära kultur fagocyter, vanligtvis makrofager, används ofta i möss. Apoptotiska celler framställs med användning av cellinjer, såsom Jurkat-celler, och blandas med primära fagocyter. Efter inkubation i flera timmar räknas det totala antalet fagocyter och engulfing fagocyter för att bedöma nivån av fagocytos. Som en sofistikerad modifiering av denna metod utvecklade Nagatas grupp en ex vivo fagocytosanalys med celler som uttrycker en caspasresistent ICAD (inhibitor av kaspasaktiverad DNas), i vilken apoptotiska celler inte genomgår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA klyvs fortfarande när Cellerna är fagocytoserade. När dessa celler används som apoptotiska mål i en fagocytosanalys, fragmenteras endast DNA från engulferade apoptotiska celler och färgas av TdT-medierad DUTP nickändmärkning (TUNEL). Därför lever de1 av apoptotisk cellupplösning mäts genom att räkna TUNEL-signaler i en blandning av fagocyter och apoptotiska celler 13 .

I D. melanogaster är professionella fagocyter benämnda hemocyter, Drosophila- makrofager, ansvariga för fagocytos av apoptotiska celler 14 , 15 . Förutom in vitro fagocytosanalyser med odlingscellinjer är in vivo fagocytosanalyser med hela Drosophila- embryon tillgängliga. Drosophila- embryon är ett kraftfullt verktyg för att undersöka nivån av apoptotisk cellintolerans eftersom många celler genomgår apoptos och fagocytoseras av hemocyter under embryonal utveckling 14 , 15 , 16 . Ett exempel på en in vivo fagocytosanalys är den metod som utvecklats av Francs grupp. I deras metod är hemocyter deTagen av immunostaining av peroxidasin, en hemocytmarkör, färgas apoptotiska celler med användning av kärnfärgämnet, 7-aminoaktinomycin D i hela Drosophila- embryon, och antalet dubbla positiva celler räknas som en signal av fagocytos 17 . Ett annat exempel på en fagocytosanalys på embryon baseras på begreppet Nagatas metod som beskrivits ovan; Emellertid utvärderas fagocytos in vivo med användning av embryonema av dCAD ( Drosophila caspase-aktiverad DNase) mutantflyger 18 , 19 . Dessa in vivo fagocytosanalyser är användbara för att direkt observera fagocytos in situ . Dock är svårigheter förenade med att utesluta eventuell förspänning i steget att räkna fagocytoseceller eftersom det är svårt att observera alla fagocyter och apoptotiska celler i hela embryon på grund av dess tjocklek.

För att övervinna denna begränsning utvecklar viUtarbetade en ny fagocytosanalys i Drosophila- embryon. I vår metod, för att enkelt räkna fagocytoserade hemocyter, homogeniseras hela embryon för att framställa dispergerade embryonala celler. Fagocyter detekteras genom immunfargning av en fagocytmarkör, och apoptotiska celler detekteras av TUNEL med dessa dispergerade embryonala celler. Användningen av dispergerade embryonala celler gör det möjligt för oss att mäta in vivo fagocytosnivåer som om vi utförde en in vitro fagocytosanalys som exakt kvantifierar nivån av fagocytos. Alla genotyper av flugor kan användas i denna analys om de utvecklas till stadium 16 av embryon 20 , utvecklingsstadiet vid vilket apoptotiskt cellutrymme genom fagocytos är den mest omfattande. Denna metod har fördelen att man bedömer nivået av fagocytos kvantitativt och kan således bidra till identifieringen av nya molekyler som är involverade i fagocytos av apoptotiska celler in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Framställning

  1. Framställning av färska druvsaftagarplattor
    1. Tillsätt 100 ml vatten till 4,4 g agar och värm blandningen i en mikrovågsugn för att lösa agar.
    2. Tillsätt 80 ml färsk druvsaft, 5 ml ättiksyra och 5 ml etanol till agarlösning.
    3. Häll ungefär 1,5 ml av lösningen med en pipett på varje glasskiva och låt den stelna.
  2. Framställning av 6 cm dish agarosplattor
    1. Tillsätt 50 ml vatten till 0,5 g agaros och värm blandningen i en mikrovågsugn för att lösa agaros.
    2. Häll ungefär 2,5 ml agaroslösning på en 6 cm skål med pipett.

2. Steg 16 embryo-samling

  1. Samla vuxna flugor, och lägg till 200 honor och 200 män i ett 50 ml koniskt rör.
  2. Sätt en tallrik med färsk druvsaftagar på jäst i 50 ml röret och stäng med en svamp cas.
  3. Inkubera flugorna vid 16 ° C i ljuset i 2 - 3 dagar. Byt plattan en gång om dagen.
  4. Flytta flugorna till mörkret vid 25 ° C i 1 h.
  5. Byt den gamla plattan till en ny utan jäst. Tillåt flugor att lägga ägg i 2 timmar.
  6. Samla plattan och inkubera vid 16 ° C i 26 timmar.
  7. Samla embryon från plattan med en pensel i 1 ml PBS innehållande 0,2% (v / v) Triton X-100.
  8. Tvätta embryon två gånger med 1 ml PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100.
  9. För att avlägsna korionen tillsätt 1,2 ml natriumhypokloritlösning (2,2 - 3,4% Cl) till embryon under 3 minuter.
  10. Tvätta embryon 4 gånger med 1 ml PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100.
  11. Placera embryon på 6-cm fat agaros plattor. Plocka upp 16 embryon under ett mikroskop som beskrivs av Roberts 20 . Samla ungefär 50 embryon i ett 1,5 ml Treff-mikro-provrör med en mikropipett.

3. PrepaRation av embryonala celler

  1. Tvätta embryon två gånger med 150 μl PBS.
  2. Homogenisera embryon 30 gånger i ett 1,5 ml mikro-provrör och pelletsblandare i närvaro av 200 pl kollagenas (0,25% (vikt / volym)) i PBS.
  3. Disperse embryonala celler genom pipettering 10 gånger, och flytta cell suspensionen till ett 1,5 ml rör. Inkubera celler vid 37 ° C i 1 min i ett vattenbad. Upprepa detta steg två gånger.
  4. Tillsätt 800 μL PBS till cellsuspensionen och centrifugera vid 1400 x g vid 4 ° C i 5 min.
  5. Ta bort supernatanten och sätt 200 μL trypsin (0,25% (vikt / volym)) i PBS till cellerna. Disperse embryonala celler genom pipettering 50 gånger.
  6. Filtrera cellsuspensionen med en 70 μm cellsträng.
  7. För att stoppa trypsinaktiviteten tillsättes 40 μl värmeinaktiverat fetalt bovint serum till den filtrerade cellsuspensionen. Tillsätt 800 μL PBS och centrifugera vid 1 400 x g vid 4 ° C i 5 min.
  8. Ta bort supernatenNt, suspendera utfällda celler i 200 | il PBS och centrifugera vid 1400 x g vid 4 ° C i 5 min.
  9. Ta bort supernatanten och suspendera utfällda celler i 30 | il PBS.
  10. Montera den beredda cellsuspensionen på aminopropyltrietoxisilanbelagda glasskivor och vänta i 10-15 min tills cellerna fäster på glasskivorna.
  11. Ta bort den återstående lösningen på glasskivorna med en pipett. Montera 60 - 70 μl PBS innehållande 4% (vikt / volym) PFA (paraformaldehyd) på celler i 10-15 min för fixering.
  12. Ta bort fixeringslösningen och placera glasskivorna i PBS i mer än 1 min.

4. Färgning av hemocyter

  1. Immunostaining med en anti-Croquemort-antikropp
    1. Seriellt suga glasskivor i metanol under 10 minuter, i PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100 i 10 min och sedan i PBS under 10 min.
    2. Montera 20 | il av 5% (vol / vol) helt svinserum i PBS-innehållNg 0,2% (v / v) Triton X-100 på celler för blockering. Inkubera diabilder vid rumstemperatur i 20 minuter.
    3. Ta bort lösningen från glasskivor och montera 20 μl anti-Croquemort antiserum 19 , 21 (0,1% (volym / volym)) i PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100 på celler. Inkubera diabilder vid 4 ° C över natten.
    4. Blötlägg glasglas i PBS innehållande 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minuter 5 gånger.
    5. Blöt glasskivor i PBS under 10 minuter.
    6. Montera 20 μl alkaliskt fosfatasmärkt anti-rått-IgG (0,5% (volym / volym)) i PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100 och 5% (vol / vol) Temperatur i 1 h.
    7. Blötlägg glasglas i PBS innehållande 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minuter 5 gånger.
    8. Blötglas i buffert innehållande 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl och 50 mM MgCl 2 för 10 min.
    9. Monofosfatasubstratlösning innehållande 0,23 mg / ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP), 0,35 mg / ml nitroblått tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl och 50 mM MgCb 2 på celler.
    10. Observera celler under ett mikroskop för korrekt färgning. När starka lila signaler uppträder i hemocyterna av granulat, ta bort substratlösningen och suga glasskivor i buffert som består av 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 och 1 mM EDTA. Färgning i ca 5 - 10 min rekommenderas.
  2. Immunostaining med en anti-GFP-antikropp (ett annat alternativ för färgning av hemocyter)
    1. Seriellt suga glasskivor i metanol i 10 minuter, PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100 i 10 min och PBS i 10 min.
    2. Montera 20 μl 5% (vol / vol) helt svinserum i PBS innehållande 0,2% (vol / vol) Triton X-100 på celler för blockering. Inkubera diabilder vid rumstemperatur i 20 minuter.
    3. Ta bort lösningen på glasskivor och montera 20 μL av mus anti-GFP antikroppen (1% (volym / volym)) / PBS cUppnå 0,2% (volym / volym) Triton X-100 på celler. Inkubera diabilder vid rumstemperatur över natten.
    4. Blötlägg glasglas i PBS innehållande 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minuter 5 gånger.
    5. Blöt glasskivor i PBS under 10 minuter.
    6. Montera 20 μl alkaliskt fosfatasmärkt anti-mus-IgG (0,5% (volym / volym)) i PBS innehållande 0,2% (volym / volym) Triton X-100 och 5% (vol / vol) Temperatur i 1 h.
    7. Blötlägg glasglas i PBS innehållande 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minuter 5 gånger.
    8. Blötglas i buffert bestående av 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl och 50 mM MgCl 2 för 10 min.
    9. Montera fosfatas substratlösning innehållande 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl och 50 mM MgCb 2 på celler.
    10. Observera celler under ett mikroskop för korrekt färgning. När lila signaler förekommer i hela hemocyter, ta bort substratlösningen och suga glider i buffert som bestårAv 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 och 1 mM EDTA. Färgning i ca 10-15 min rekommenderas.

5. Blåsa apoptotiska celler av TUNEL

  1. Blöt glasskivor i PBS i 5 min.
  2. Upprepa med nya PBS.
  3. Montera jämviktsbuffert (se materialtabell) på celler i 10 minuter.
  4. Ta bort lösningen från glasskivor och montera 20 μl TdT-lösning innehållande 5 | il av deoxynukleotidyltransferas i terminalen och 15 | il Reaktionsbuffert på celler vid 37 ° C i 1 timme.
  5. Ta bort lösningen från glasskivor och dra i skivor i buffert som består av 0,5 ml STOP / Wash-buffert och 17 ml vatten.
  6. Suga glider i PBS i 5 min 3 gånger.
  7. Montera 20 μl anti-digoxigenin-peroxidas på celler vid rumstemperatur i 30 minuter.
  8. Blöt glasskivor i PBS i 5 minuter 4 gånger.
  9. Blötlägg glasskivor i peroxidas-substratlösning bestående av 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH7,5 innehållandega fullständiga mikro spatel av 3,3'-diaminobensidin tetrahydrichloride (DAB), och 0,002% (volym / volym) H 2 O 2 i 30 sek.
  10. Upprepa steg 5.9 tills apoptotiska celler är färgade bruna. Blöt glasskivor i vatten för att stoppa peroxidasreaktionen.
  11. Lossa celler med vatten för observation.

6. Mät nivån av fagocytos av apoptotiska celler

  1. Observera prov under ett ljusmikroskop för att bedöma nivån av fagocytos. Räkna Croquemort-positiva celler eller GFP-positiva celler som hemocyter, TUNEL-positiva celler som apoptotiska celler och dubbla positiva celler som fagocytoserade hemocyter.
  2. Det fagocytiska indexet definieras som antalet dubbla positiva celler till det totala antalet Croquemort-positiva celler eller GFP-positiva celler. Det rekommenderas att mer än 300 hemocyter observeras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att undersöka fagocytos av apoptotiska celler uppsamlades Drosophila- embryon från utvecklingsstadiet 16 och framställdes som dispergerade celler. Hemocyter, Drosophila makrofager, färgades genom immuncytokemi för hemocyte markör "Croquemort" 17, 22 med användning av en specifik antikropp 19, 21, och apoptotiska celler färgades genom TUNEL i dispergerade embryonala celler (Figur 1A). Croquemort, en Drosophila CD36-relaterad receptor, uttrycks specifikt på alla embryonala hemocyter 22 och har visats genetiskt för att vara involverad i clearance av apoptotiska celler i Drosophila- embryon 17 . Croquemort-positiva celler har lila signaler i sina små granuler. TUNEL-positiva celler visar abRown signal i hela corpuses. TUNEL-positiva celler är mindre än andra celler, och några är inuti Croquemort-positiva celler, vilka anses vara fagocytoserade döda celler. Mellan 2 och 10% observeras Croquemort-positiva celler och 1 - 5% TUNEL-positiva celler normalt i alla embryonala celler.

I Drosophila finns det två signalvägar för engulfering av apoptotiska celler. Två fagocytos receptorer för de motsvarande banorna, Dräper och grin a PS3 p ν, oberoende känna igen döda celler 19, 21, 23, 24, 25. Draper är ett transmembranprotein som besitter atypiska epidermala tillväxtfaktor (EGF) -liknande sekvenser i den extracellulära regionen och de två fosforylerbara motiven NPxY och YxxL i INtracellulär del 26 . Grin α PS3 β ν är också en transmembranreceptor bestående av en heterodimer av a- och P-subenheter 25. Figur IB visar förhållandet mellan fagocytoserade hemocyter och totala hemocyter i vildtyps- eller drpr- eller Itgbn- enkla mutanta embryon. Genom att räkna alla Croquemort-positiva celler (totala hemocyter) och Croquemort- och TUNEL-dubbla positiva celler (fagocytoserade hemocyter) beräknade vi det fagocytiska indexet som antalet fagocytoserade hemocyter till det totala antalet hemocyter. Det fagocytiska indexet var lägre i drpr- eller Itgbn- mutanten än i vildtypen, medan antalet hemocyter och apoptotiska celler var likartade ( Figur 1C- D ), vilket indikerar att dessa två gener är nödvändiga för apoptotisk celluttagning, som tidigare reported.

När en anti-Croquemort-antikropp inte är tillgänglig eller mutanta linjer med förändrat Croquemort-uttryck undersöks, måste vi välja ett annat alternativ för att detektera hemocyter. Embryon med en GAL4-förare kontrollerad av en hemocytspecifikt promotor ( srpHemo-GAL4 ) och GFP-genen som styrs av en uppströms aktiveringssekvens (UAS) innefattande GAL4-bindningsstället ( UAS-EGFP ) har GFP-märkta hemocyter 27 , Vilket gör det möjligt för oss att upptäcka hemocyter med anti-GFP. Figur 2A visar en bild erhållen efter detektering av hemocyter och apoptotiska celler med immunfärgning med användning av en anti-GFP-antikropp och TUNEL i embryonala celler med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Medan en anti-Croquemort-antikropp fläckar små granuler i celler, fläckar en anti-GFP-antikropp hela hemocyter. På liknande sätt som i figur 1A , 2 - 6% GFP-positiva celler och 1 - 5% TUNEL-positiva Celler observeras i alla embryonala celler. Vissa TUNEL-positiva celler detekteras inuti GFP-positiva celler, vilka anses vara fagocytoserade döda celler. RNAi-medierad knockdown appliceras enkelt för att bedöma vilka gener som helst för deras involvering i fagocytos genom att korsa flugor med UAS-dsRNA hos kandidatgenerna med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Den RNAi-medierade knockdownen av drpr eller Itgbn reducerade fagocytiskt index ( Figur 2B ), medan antalet hemocyter och apoptotiska celler i embryonala celler var jämförbara ( Figur 2C -2D ), vilket indikerar igen att dessa fagocytosreceptorer är involverade i fagocytos av Apoptotiska celler. Liknande fagocytiska index erhålls från båda hemocytdetekteringsmetoderna, vilket tyder på att båda är kompatibla.

G "/>
Figur 1 : Färgning av embryonala celler med en anti-Croquemort-antikropp och TUNEL. ( A ) Ljusfältbilder av dispergerade embryonala celler från w 1118- stammen genom immunfärgning med en anti-Croquemort-antikropp och TUNEL. Förstoringar av representativa positiva eller negativt färgade celler (topp 4 paneler) och ett lågfrekvensfält (bottenpanel) visas. Skalstänger, 5 μm (topp); 50 μm (botten). ( B ) Förhållandet mellan Croquemort-positiva hemocyter och TUNEL-signalen till alla Croquemort-positiva hemocyter i drpr- eller Itgbn- mutanten analyserades med dispergerade embryonala celler. ( C ) Förhållandet mellan Croquemort-positiva hemocyter och alla celler i drpr- eller Itgbn- mutanten analyserades med dispergerade embryonala celler. ( D ) Förhållandet mellan TUNEL-positiva apoptotiska celler till alla celler i drpr ellerItgbn- mutant analyserades med dispergerade embryonala celler. genotyper; W 1118 (vildtypskontroll), drpr A5 ( drpr- mutant) och Itgbn 2 (integrin P- mutant). Data var representativa för tre oberoende experiment och analyseras av studentens t- test. Cirka 300 Croquemort-positiva hemocyter observerades i varje experiment och värden representerar medelvärdet ± SD av tre mikroskopiska fält. *; p <0,05, ns; Skillnad inte signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Färgning av embryonala celler av AntI-GFP och TUNEL. ( A ) Ljusfältbilder av dispergerade embryonala celler från srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + -stammen genom immunfärgning med en anti-GFP-antikropp och TUNEL. Förstoringar av representativa positiva eller negativt färgade celler (topp 4 paneler) och ett lågfrekvensfält (bottenpanel) visas. Skalstänger = 5 μm (övre); 50 μm (botten). ( B ) Förhållandet mellan GFP-positiva hemocyter och TUNEL-signalen till alla GFP-positiva hemocyter i RNAi-medierade knockdownflyger av drpr eller Itgbn analyserades med dispergerade embryonala celler. ( C ) Förhållandet mellan GFP-positiva hemocyter och alla celler i RNAi-medierade knockdown-flugor av drpr eller Itgbn analyserades med dispergerade embryonala celler. ( D ) Förhållandet mellan TUNEL-positiva apoptotiska celler och alla celler i RNAi-medierade knockdown-flugor av drpr eller Itgbn analyserades med dispergerade embryonala celler. genotyper; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Data var representativa för tre oberoende experiment och analyseras av studentens t- test. Cirka 300 GFP-positiva hemocyter observerades i varje experiment och värden representerar medelvärdet ± SD av tre mikroskopiska fält. *; P <0,05, ns; Skillnad inte signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här beskrivs en fagocytosanalys med användning av Drosophila- embryon. Genom att använda dispergerade embryonala celler för att mäta fagocytos kvantitativt immuniseras hemocyter, professionella fagocyter Drosophila , för hemocytmarkören Croquemort eller srpHemo- driven GFP, och apoptotiska celler detekteras av TUNEL i detta protokoll. Nivået av fagocytos uttrycks som ett fagocytiskt index genom att räkna det totala antalet hemocyter och fagocytoserade hemocyter. Användningen av dispergerade embryonala celler gör det möjligt för oss att observera alla fagocyter och apoptotiska celler i hela embryon och att exakt kvantifiera nivån av fagocytos. Dessutom upptäcker vår metod hemocyter och apoptotiska celler med färgämnen som observeras under ett ljusmikroskop, inte ett fluorescensmikroskop. Detta underlättar bedömningen av fagocytosnivåer eftersom det är möjligt att observera hemocyter och apoptotiska celler samtidigt utan att ändra något filter.

Ve_content "> Följande punkter är avgörande för färgning av embryonala celler. I fixeringssteget av embryonala celler måste färsk PFA beredd inom två veckor användas. Vid immunförtjockning av Croquemort måste inkubationen av celler med anti-Croquemort utföras Vid 4 ° C. Vid TUNEL-färgning måste inkubationen av celler med DAB utföras genom noggrann kontroll under ett mikroskop för att undvika överdriven färgning. TUNEL visualiserar fragmenterat DNA genom detektering av 3'-OH, vilket är rikligt i apoptotiska celler. Normala celler har också 3'-OH i DNA-3'-terminalen, men på en lägre nivå än i apoptotiska celler. Därför fläckar en inkubation av celler med DAB för länge inte bara apoptotiska celler utan även normala celler . Observation av celler var 15: e eller 30 s under DAB-färgning rekommenderas för att förhindra detta.

I detta protokoll, även om kvantifiering av nivån av fagocytos är snabb och exakt,Ch eftersom platsen för engulfering eller distribution av hemocyter förloras. Vi visade tidigare att denna analys och en in situ fagocytosanalys med användning av hela embryon gav liknande resultat i termer av fagocytiskt index 21 . Därför rekommenderar vi att man utför en in situ fagocytosanalys parallellt för att noggrant tolka de resultat som erhållits i vissa fall.

Drosophila har en annan professionell fagocyt, glialceller, i centrala nervsystemet. Fastän vi inte beskriver hur man bedömer fagocytos av apoptotiska neuroner med glialceller i embryon i detta protokoll, tillämpas samma protokoll för att kvantifiera nivån av engulfment som den som rapporterats av Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . På samma sätt föreslår denna analys att TUNEL-positiva celler i Drosophila- embryon sannolikt är fagocytoserade av icke-professionella fagocyter. Fagocytos av de oidentifierade phAgocyter med okända engulferingsreceptorer kan förklara resultatet ( Figur 1D ) att det totala antalet apoptotiska celler i embryonala celler verkar inte öka i en fagocytosgenmutant.

Sammanfattningsvis har detta protokoll framgångsrikt lett till upptäckten av gener som erfordras för fagocytos av apoptotiska celler av professionella fagocyter. 24 , 25 , 28 . Baserat på den evolutionära bevarande av molekylära mekanismer som ligger bakom fagocytos 7 kan avslöjande genfunktioner i Drosophila- embryon som involverar komplexa fagocytosreaktioner ge meningsfull insikt i fagocytisk clearance av döda celler, vilket är relaterat till inflammatoriska störningar och autoimmuna sjukdomar hos däggdjur 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi är tacksamma Kaz Nagaosa och Akiko Shiratsuchi för deras råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Fagocytosanalys för apoptotiska celler i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter