Summary
نقدم بروتوكولا لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.
Abstract
الغدة النخامية أو النخامية جهاز الغدد الصماء هام إفراز الهرمونات الضرورية للتوازن. يتكون من الغدد اثنين مع أصول الجنينية منفصلة والوظائف – في نيوروهيبوفيسيس وفي أدينوهيبوفيسيس. الغدة النخامية الماوس نامية صغيرة وحساسة بشكل بيضاوي ممدود. مقطع الاكليلية هو المفضل لعرض كل من أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية الماوس.
والهدف من هذا البروتوكول تحقيق الأقسام الاكليلية الغدة النخامية سليمة مع أبنية الأنسجة المحفوظة جيدا من البلدان النامية الفئران. ونحن في هذا البروتوكول، تصف بالتفصيل كيفية تشريح ومعالجة الغدد النخامية بشكل صحيح من البلدان النامية الفئران. أولاً، يحدد نضح ترانسكارديال الفورمالدهايد قبل تشريح الفئران. ثم يتم تطبيق ثلاث تقنيات تشريح مختلفة للحصول على الغدد النخامية سليمة تبعاً لعمر الفئران. للفئران الجنينية سن 17.5 يوما الجنينية (ه)-18.5 وحديثي الولادة تصل إلى 4 أيام، هي تشريح لمنطقتي سيلا كامل بما في ذلك عظم وتدي والغدة تريجيمينال الأعصاب. الجراء هي تشريح عمره يوما بعد الولادة (ع) 5-14، الغدد النخامية متصلة مع الأعصاب تريجيمينال ككل. للفئران القديمة أكثر من 3 أسابيع، يتم تشريح الغدد النخامية بعناية مجانية من الأنسجة المحيطة بها. ونحن أيضا عرض كيفية تضمين الغدد النخامية في اتجاه سليم باستخدام الأنسجة المحيطة بها كمعالم للحصول على إشباع المقاطع الاكليلية. هذه الأساليب مفيدة في تحليل الملامح النسيجي واﻹنمائية الغدد النخامية في وضع الفئران.
Introduction
الغدة النخامية أو النخامية جهاز الغدد الصماء هام إفراز الهرمونات الضرورية للتوازن1،2. تشريحيا، الغدة النخامية بنية '' اثنين في واحد '' تتكون من نيوروهيبوفيسيس وأدينوهيبوفيسيس. هذه الأجزاء لها أصول جنينية مختلفة والدالة بطريقة مختلفة جداً. مشتق من الأديم الظاهر العصبي neurohypophysis وتفرز الاكسيتوسين والهرمون المضاد. Adenohypophysis تنبع من الحقيبة راثكي وهي المسؤولة عن الإفراج عن الهرمونات بما فيها هرمون النمو، البرولاكتين، – الغدة الدرقية الهرمون، جريب – الهرمون، والهرمون، وهرمون ﻫﺭﻣﻭﻧ، و الصباغية – الهرمون3،،من45.
الغدة النخامية تقع على سطح عظم وتدي (السرج) الجمجمة الماوس الظهرية وإرفاق الكلمة الدماغ بساق هشة. ويحاط جانبياً بالاعصاب تريجيمينال والأسفل6،chiasm البصرية7. الغدة بشكل بيضاوي ممدود مع محورها طويل عمودي إلى رئيس. على سطحه الظهرية، في نيوروهيبوفيسيس وفي أدينوهيبوفيسيس يمكن بسهولة أن ترسيمها، مع السابقة تحتل منطقة وسطى الظهرية وتوسيع هذه الأخيرة أفقياً وبطنيا. خلال التنمية اللاحقة للولادة، وزيادة حجم الغدة النخامية سريعاً في الشهر الأول بعد الولادة8،9. ومع ذلك، لا تزال الغدة النخامية الماوس صغيرة جداً في الحجم مع متوسط وزن 1.9 ملغ وقطر منذ فترة طويلة-محور ~ 3 مم في البالغين10، قطر منذ فترة طويلة-المحور 2-2.5 ملم في يوم الولادة 21 (P21)، و 1-1، 5 ملم فقط في P0.
مقطع الاكليلية هو المفضل لعرض كل من أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية الماوس. بيد بعض المهارات التقنية المطلوبة للحصول على إرضاء المقاطع الاكليلية الغدد النخامية من الفئران نظراً للحجم الصغير استثنائية والتشريح متميزة البلدان النامية. في هذه المقالة الفيديو، نظهر كيفية تشريح الغدد النخامية الماوس وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية في مراحل مختلفة من التنمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هي ولدت الفئران C57BL/6 في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. جميع الأساليب التجريبية الحيوانية امتثالا للمبادئ التوجيهية التي أقرتها لجنة الأخلاقيات في الجامعة الطبية العسكرية الثانية ورعاية الحيوان.
1-"تسلخ من بعد الولادة تطوير الغدة النخامية"
- إجراء التخدير: مكان الفئران حديثي الولادة (P0-P5) على الثلج المجروش للحث على انخفاض درجة حرارة الجسم. للفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام عمر، حقن يوريتان 5% (30 ميليلتر/غرام من وزن الجسم) إينترابيريتونيلي للحث على التخدير. تقييم الاستجابات للذيل/تو يقرصه. المضي قدما إلا بعد أن يكون الماوس لا يستجيب للمنبهات الضارة.
- تأمين الماوس في موقف ضعيف (ملقى على ظهره والوجه إلى الأعلى) بتسجيل بلطف فوريباوس وهيندباوس إلى سطح عمل يمكن أن تكون مثبتة (أي، الستايروفوم) داخل غطاء الأبخرة كيميائية.
- إجراء نضح ترانسكارديال.
- قص القفص الصدري الماوس مع المقص الجراحي لفضح القلب (والأجهزة الأخرى والصدر)-
- تأمين قلب ينبض بالملقط حادة وأدخل إبرة ز 26 (0.45 ملم) في البطين الأيسر. يتم إرفاقه الإبرة حقنه 10 مل مليئة بالفوسفات هيبارينيزيد مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ تستكمل مع نتريت الصوديوم 5 ملغ/مل و 10 يو/مليلتر الهيبارين، درجة الحموضة 7.4، الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام). قطع الاذين الأيمن مع مقص غرامة فورا والبدء في نتخلل الجسم مع برنامج تلفزيوني الحارة حتى السوائل تخرج اتريوم الصحيح الواضح.
ملاحظة: التقريبية 5-10 مل برنامج تلفزيوني المسبق للفئران حديثي الولادة و 10-20 مل برنامج تلفزيوني للفئران الكبار- - تبقى الإبرة في المكان وتغيير آخر حقنه مليئة بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين؛ ودرجة الحموضة 7.4). نتخلل 10 مل و 20 مل من مثبت للأطفال حديثي الولادة والماوس P21، على التوالي.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة. قد يسبب التهابات الجهاز التنفسي، الجلد وتلف العين. ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء كيميائية.
- قطع رأس الماوس ثابتة في منهاج عمل بيجين وقطع عظم الجمجمة مفتوحة مع المقص.
- مع الملقط الصغيرة بلطف رفع هيندبرين من قاعدة الجمجمة. في أول بادرة من السرج، قص رفع الإيقاف ولكن عقد هيندبرين، ساق الغدة النخامية والألياف العصبية الاتصال بقاعدة الدماغ مع مقص غرامة. تعد هذه الخطوة الحاسمة لضمان أن الغدة النخامية لا يرفع بعيداً مع الدماغ.
- ثم الحفاظ على رفع الدماغ وإزالة الدماغ كله لفضح الغدة النخامية تماما. قص سيلا كامل المنطقة بما في ذلك الغدة النخامية، الأفقي تريجيمينال الأعصاب، وتحت عظم وتدي مع المقص (حوالي 3 × 5 مم 2)-
- موضع تشريح الأنسجة طبق 35 ملم أو بئر واحدة للوحة 6-البئر الذي يحتوي على 2 مل الباردة 4% منهاج العمل (درجة الحموضة 7.4). إصلاح الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ل P0-بيتويتاريس P7، ح 1 عن بيتويتاريس P14، ح 1.5 ل P21-بيتويتاريس P28، و 3 ح للكبار بيتويتاريس.
- تفارق مزيد من الغدة النخامية
- غسل الأنسجة الثابتة مع 10 مل برنامج تلفزيوني، 5 التغييرات، كل 15 دقيقة. الغدة النخامية الولدان جنبا إلى جنب مع الأنسجة المحيطة به، وتحت عظم وتدي يمكن معالجتها بصورة مباشرة للجفاف. ومع ذلك، ينبغي أن تنفصل الغدد النخامية من الفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام أخرى تحت مجهر ستيريو.
- وضع الأنسجة الثابتة في طبق 35 ملم يحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني. P5-بيتويتاريس P14، إزالة الأغشية الضام بين الأعصاب والعظام مع غرامة ملقط ومقص، وعزل الغدة النخامية جنبا إلى جنب مع الأفقي trigeminal الأعصاب بعناية ككل ولكن ترك في السرج. غدة معزولة والأعصاب متصلة بواسطة الأغشية الضام مع " ح "-مثل مظهر ( الشكل 1B). بيتويتاريس
- ل P21، والكبار، إزالة الأعصاب وأغشية الضام حول الغدة النخامية والغدة من الأنسجة المحيطة بها. التفاف أنسجة الغدة النخامية مع عدسة تنظيف المناديل الورقية ووضعه في كاسيت تضمين.
ملاحظة: التفاف الغدة النخامية صغيرة مع عدسة تنظيف المناديل الورقية يساعد على منع أي خسارة محتملة للعينات، والمحافظة على سلامة الأنسجة في الإجراء التالي تضمين البارافين. فإنه قد لا يكون ضروريا التفاف الغدة النخامية إذا تتم معالجتها في زجاجة صغيرة في الإجراء تضمين cryo.
2. البارافين تضمينها وسيكتيونينج
- يذوي العينات في تضمين أشرطة الكاسيت مع حلول الإيثانول 50%، 65%، 75%، و 95% لمدة 15 دقيقة. في وقت لاحق يذوي مع التغييرات 3 من الإيثانول النقي، 3 دقيقة ل P0-P4 الغدد، 4 دقيقة ل P5-P14 الغدد، وكل 5 دقائق P21 والغدد كبار السن. واضحة مع زيلين نفط، 3 التغييرات، 3 دقيقة ل P0-P4 الغدد، 4 دقيقة ل P5-P14 الغدد، وكل 5 دقائق ل P21 والغدد كبار السن. التسلل مع شمع البارافين المنصهر، التغييرات 3، 7 دقيقة ل P0-الغدد P4، ودقيقة 8 مرتين تليها 6 دقيقة مرة P5 والغدد كبار السن-
ملاحظة: معلمات الأمثل لمعالجة الأنسجة يمكن تجريبيا تعديلها. للحصول على المقاطع ذات جودة عالية، وينبغي تجنب الجفاف غير كافية أو أكثر. نفس الشيء صحيح بالنسبة لإزالة الأنسجة استخدام زيلين نفط.
إزالة العينة من الكاسيت - التوجه عند تضمين
- في أنسجة تضمين وحدة تحكم النظام، ووضعها في قالب قاعدة نصف مليئة شمع البارافين المنصهر. التوجه السليم للغدة النخامية التضمين أمر ضروري لتلبية أقسام الاكليلية. الغدد النخامية
- ل P21، والكبار، ضع الغدة النخامية مع محورها قصيرة عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن (الطائرة القسم). استخدام وتدي العظام والأعصاب trigeminal كالمعالم التشريحية ل P0-P4 و P5-P14 بيتويتاريس، على التوالي. توجيه العينات بالاعصاب تريجيمينال أو الصفيحة مستعرضة من العظام الاسفينية عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن.
- برفق عقد الأنسجة في الموضع المطلوب مع الملقط غرامة المعالجون حتى يصبح الشمع شبه صلبة على لوحة تبريد. أعلى القالب مع شمع البارافين المنصهر. تسمح الكتلة البارافين لتبرد حتى تماما هو توطد الشمع.
ملاحظة: يمكن علاج الغدة النخامية في يوم الجنينية 18.5 (E18.5) بنفس الطريقة كالغدة النخامية الولدان. لكن بيتويتاريس (راثكي ' s الحقائب) أصغر من E16.5 ينبغي أن تكون جزءا لا يتجزأ مع الرأس كله والمنحى مع المحور السهمي (من الفم إلى قفا) عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن.
- البرد في كتلة البارافين في-20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة وبعد ذلك قطع رقيقة إلى شرائح (4 ميكرون سمك المفضل) مع مبضع. للحصول على المقاطع الاكليلية مرضية، تهذيب موقف كتل البارافين خلال تمزيقها. جبل شرائح الأنسجة على الشرائح الزجاجية المغلفة بوليليسيني لمنع انفصال شرائح في الإجراءات التالية.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، العينات يمكن أن تكون مجففة بنسبة 15%، 30% (W/V) حلول السكروز (في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية حتى أنها تنزل إلى القاع، جزءا لا يتجزأ من مجمع cryo التضمين باستخدام نفس أسلوب التوجيه، وتجمد بسرعة على الجليد الجاف. ثم قص كتل الأنسجة المجمدة إلى شرائح من 8-10 ميكرون استخدام كريوستات. مورفولوجية cryo-الفروع، ومع ذلك، في كثير من الأحيان أقل شأنا من البارافين المقاطع.
3. ح & ه تلطيخ ووسم الفلورة
- الحارة الشرائح على حرارة كتلة في 55 درجة مئوية ودو مع زيلين نفط، التغييرات 2، 4 دقيقة. يذوي العينات مع الإيثانول 95% مرتين و 75% إيثانول مرتين، 3 دقيقة. يغسل الشرائح مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق على شاكر.
- "على ح" & ه تلطيخ، وصمة عار المقاطع في الشب توضع حل لمدة 6 دقائق، وشطف في runnماء الصنبور جي ل 2 دقيقة، تفرق مع المياه الأمونيا 0.2% s 45، وإعادة شطف في الماء لمدة 2 دقيقة. ثم يذوي المقاطع مع الإيثانول 95% 1 دقيقة ووصمة عار مع ويوزين للحد الأدنى 2 من التتابع يذوي، واضحة، وجبل- علاج
- وسم الفلورة
- الأقسام مع الميثانول التي تحتوي على 3 ٪ ح 2 س 2 و 0.01 ٪ نان 3 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإلغاء تنشيط بيروكسيداسيس الذاتية. استرداد المستضدات من الغليان المقاطع في استرجاع المخزن المؤقت (يدتا 1 مم و 1 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4) في طنجرة الضغط للحد الأدنى 2 إينكوباتي المقاطع مع حظر المخزن المؤقت (5% الماعز المصل في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- احتضان الأقسام مع جسم هرمون النمو المضادة (غ) الأرانب (1:2، 000) أو جسم مكافحة الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني) أرنب (1:2، 000) المخفف في المخزن المؤقت لحظر بين عشية وضحاها في 4 ° C.
- احتضان الأقسام مع جسم الثانوي (الماعز الأرنب المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية، رافعة في المخزن المؤقت لحظر) لمدة 35 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- تضخيم الإشارات باستخدام بيوتينيل تيراميدي (01:50 في تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على نسبة 0.3% ح 2 س 2) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتصور مع 488 (رافعة في حجب المخزن المؤقت, 30 دقيقة, 37 درجة مئوية) أو ستريبتافيدين-Alexa594-
- كونتيرستين الأنوية مع DAPI (50 مغ/لتر في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: أنه لا يلزم لتضخيم الإشارات استخدام نظام التضخيم إشارة تيراميدي (TSA). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام جسم ثانوي مترافق الأسفار تصور الإشارة-
- الحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار مجهزة × DAPI وتكساس الأحمر ومجموعات التصفية فيتك، 4/0.13 إلى × 40/0.75 الأهداف وكاميرا 5.0 ميجا بكسل. استخدام في 360 و 488 594 موجات الليزر في شمال البحر الأبيض المتوسط للتصوير DAPI، أليكسا 488-ومقاطع 594 أليكسا الملون، على التوالي. تحسين طاقة الليزر (0.8 استخدمت عموما) ووقت التعرض إلى المستويات المنشودة لكل قناة. التقاط الصورة تحت سيطرة صورة اقتناء البرمجيات وتراكب الصور الأسفار فيما بعد باستخدام برنامج معالجة الصور-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويقدم هذا البروتوكول وسيلة تشريح الغدد النخامية من الفئران البلدان النامية. للماوس الولدان، ومنطقتي سيلا كاملة تحتوي على الغدة النخامية والأعصاب تريجيمينال، وتحت تم تشريح عظم وتدي خارجاً من قاعدة الجمجمة. الغدة النخامية صغيرة وحساسة لا تزال سليمة أثناء العملية (الشكل 1A). للفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام، كانت الغدد النخامية يعلق على الأعصاب trigeminal الأفقي ثم عزلة. الهيكل الإجمالي للغدة النخامية معزولة عن P7 كذلك المحافظة على الماوس (الشكل 1B). للماوس P21، تمت زيادة حجم الغدة النخامية ملحوظ مقارنة بالماوس الأطفال حديثي الولادة. وكان الغدة النخامية معزولة بنجاح مع الضرر غير مرئية أثناء إزالة الأنسجة المحيطة به (الشكل 1).
لعرض منطقة الحد الأقصى أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية، مقطع الاكليلية المفضل. تشريح الغدد النخامية كانت موجهة بشكل صحيح لتحقيق إرضاء المقاطع الاكليلية. ح & ه تلطيخ أظهرت أيضا الحفاظ على مورفولوجيا adenohypophysis ونيوروهيبوفيسيس في الغدد النخامية P0 و P7 P21 (الشكل 2).
كما كانت الشرائح المجهزة متوافقة مع وسم الفلورة. على سبيل مثال، أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس أظهرت إيمونولابيلينج محددة من هرمون النمو وتوصيني، على التوالي (الشكل 3).
رقم 1: تشريح الغدد النخامية النامي بعد الولادة- آراء الظهرية تشريح الغدد النخامية والأنسجة المحيطة بها من الفئران P0 و P7 P21. A، والأمامية؛ ف، اللاحق؛ L، اليسار؛ R، الحق؛ SB، عظم وتدي؛ تينيسي، العصب تريجيمينال؛ آه، أدينوهيبوفيسيس؛ NH، نيوروهيبوفيسيس. تغيير حجم أشرطة، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: علم الأنسجة الغدد النخامية الماوس. ح ممثل & ه تلطيخ على أبواب الاكليلية الغدة النخامية من الفئران P0 و P7 P21. (أ وب وج) آراء بيتويتاريس الاكليلية تضخم منخفض. (د، ه، وو) يتم توسيع مجالات مؤطرة في (أ وب وج) على التوالي. تغيير حجم أشرطة = 1 ملم في (أ وب وج)؛ و 20 ميكرومتر (دال وهاء وواو). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تلطيخ إيمونوفلوريسسينت الممثل في الغدد النخامية. (أ) هرمون النمو (أحمر) وأعرب على وجه التحديد في adenohypophysis من الفئران P7. (ب) صورة ماجنيفيد من منطقة مؤطرة في ألف (ج) توصيني (الأخضر) وأعرب على وجه التحديد في نيوروهيبوفيسيس من الفئران P21. (د) صورة ماجنيفيد من منطقة مؤطرة في "نويات جيم" كانت ملطخة DAPI (أزرق). شريط المقياس = 300 ميكرون (ألف وجيم)؛ و 30 ميكرومتر (ب ود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لوضع بيتويتاريس مورين، كان من الصعب من الناحية الفنية للحصول على أقسام الاكليلية السليمة نظراً لخصائصها صغيرة وهشة والخصائص التشريحية الفريدة6،8. ومن ثم اختيار بعض المجموعات البحثية أبواب منتصف السهمي لتحليل مورفولوجية الجنينية والوليدية الغدة النخامية11،12. على الرغم من أن القسم منتصف السهمي للغدة النخامية أيضا قادرة على عرض أمامي، والمتوسطة، والخلفي الفصوص في شريحة واحدة، قسم الاكليلية المفضل عالية كما يمكن أن تظهر طريقة عرض الحد أقصى لهذه الفصوص الثلاثة. على وجه الخصوص، لدراسات القياس الكمي، مثل تحديد حجم ومجال الغدة النخامية وإحصاء عدد أبوبتوتيك وتكاثر الخلايا، وأقسام الاكليلية متفوقة على أبواب منتصف السهمي فيما يتعلق الممثل. نقدم هنا، وسيلة مفيدة لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.
لتجنب إتلاف الغدد النخامية خلال العملية، وقد استخدمت العديد من التقنيات في هذا البروتوكول. أولاً، يحدد نضح ترانسكارديال الفورمالدهايد قبل تشريح الفئران. ويساعد هذا مثبت ليس فقط الحفاظ على بنية الجهاز ولكن أيضا لإزالة خلايا الدم الحمراء التي كثيرا ما تسفر عن السيارات fluorescence13. ثانيا، هو تشريح منطقة سيلا كامل لتجنب لمس الغدة النخامية مع أي أدوات الصلبة الجراحية. الأنسجة المحيطة تساعد على إبقاء الغدة النخامية في موضعه الأصلي وأيضا بمثابة معالم لتضمين التوجه. مع هذه الأساليب المستخدمة، يمكن تشريح أصغر بعد الولادة بيتويتاريس من الحيوانات الشابة في حين التقليل من احتمالات الضرر غير مرغوب فيها.
إجراء التشريح في هذا البروتوكول ينطبق أيضا على عزل النخامية مورين التي لم يحدد مسبقاً قبل التروية. وفي هذه الحالة، ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيها، وينبغي أيضا أن يكون تشريح الغدة بأقصى سرعة ممكنة.
منذ بيتويتاريس مورين النامية صغيرة جداً في الحجم، كان من الصعوبة بمكان توجيه لهم بشكل صحيح عند تضمين. هذا البروتوكول يستخدم trigeminal الأعصاب أو العظام الاسفينية كالمعالم، مما يجعل الخطوات التوجه أسهل بكثير. بيتويتاريس موجها بشكل صحيح أمران أساسيان لتحقيق إرضاء المقاطع الاكليلية.
وباختصار، نحن نقدم تشريح الغدة النخامية محسنة وتضمين البروتوكول، ومناسبة للفئران في مراحل مختلفة من التنمية. يمكن تطبيق هذه الإجراءات للحصول على إرضاء المقاطع الاكليلية مورين الغدد النخامية لاستخدامها لتحليل الأنسجة الروتينية، إيمونوهيستوتشيميستري، والتهجين في الموقع ، والبحوث الإنمائية14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنح "الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية" (31201086 و 31470759 و 31671219) و "شنغهاي مؤسسة العلوم الطبيعية" (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
