Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Differentiering af musen embryonale stamceller i kortikale Interneuron prækursorer

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at generere kortikale interneuron ophav og post mitotiske interneuron prækursorer fra mus embryonale stamceller ved hjælp af en modificeret embryoid krop til éncellelag metode. Disse stamfaderen/prækursorer kan være brugt i vitro fluorescently sorteret og transplanteret ind i neonatal neocortex for at studere skæbne bestemmelse eller anvendes til terapeutiske formål.

Abstract

GABAergic kortikale interneurons er en heterogen population af celler, der spiller en kritisk rolle i regulere produktionen af excitatoriske pyramideformet neuroner samt synkronisering udgange pyramideformet neuron ensembler. Underskud i interneuron funktion har været impliceret i en bred vifte af neuropsykiatriske lidelser, herunder skizofreni, autisme og epilepsi. Afledning af kortikale interneurons fra embryonale stamceller ikke kun giver mulighed for undersøgelse af deres udvikling og funktion, men giver indsigt i de molekylære mekanismer patogenesen af kortikale interneuron-relaterede lidelser. Interneurons har også den bemærkelsesværdige evne til at overleve, overføre og integrere i vært kortikale kredsløb efter transplantation, hvilket gør dem ideelle kandidater til brug i celle-baserede behandlinger. Her præsenterer vi en skalerbar, højeffektive, modificerede embryoid krop til éncellelag metode for fastsættelse af Nkx2.1-udtrykker interneuron ophav og deres afkom fra mus embryonale stamceller (mESCs). Bruger en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbelt reporter mESC linje, kan Nkx2.1 ophav eller deres Lhx6-udtrykker post mitotiske afkom isoleres via fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og efterfølgende brugt i en række downstream applikationer. Vi leverer også metoder til at berige for parvalbumin (PV) og somatostatin (SST) interneuron undergrupper, som kan være nyttige til at studere aspekter af skæbne bestemmelse eller anvendelse i terapeutiske anvendelsesmuligheder, der ville drage fordel af interneuron undergruppe-beriget transplantationscentre.

Introduction

Både mus og mennesker, omtrent halvdelen af alle kortikale hæmmende interneurons (CIns) stammer senest en forbigående subkortikale struktur kendt som den mediale ganglionære eminence (MGE), hvor neuroepithelial stamfaderen til CIns og andre neuronal og glial undergrupper express transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller undertyper er defineret ved krydsende morfologiske, neurokemiske, elektrofysiologiske og connectivity egenskaber3,4. Den MGE-afledte CIns kan inddeles i hovedsageligt ikke-overlappende undergrupper baseret på deres udtryk for enten PV eller SST, udtryk for som korrelerer med særlig elektrofysiologiske og connectivity tendenser5. Dysfunktion af interneurons, navnlig i PV undergruppe, har været involveret i flere neuropsykiatriske lidelser og sygdomme6,7. Det overordnede mål med denne metode er at fremstille stamceller-afledt mitotiske ophav og vandrende prækursorer beriget til enten PV eller SST CIn skæbne for at studere kortikale interneuron biologi og til brug i celle-baserede behandlinger.

Vi har udviklet en skalerbar, yderst effektiv metode til afledning af Nkx2.1-udtrykker interneuron ophav og deres afkom fra mESCs. Ved hjælp af en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbelt reporter mESC linie8, Nkx2.1 ophav eller deres Lhx6-udtrykker post mitotiske afkom kan isoleres via FACS og efterfølgende brugt i en række downstream applikationer. Ved at manipulere en række signaling veje, varighed af kultur og tilstand af neurogenese, kan vi få millioner af fluorescently mærket interneuron prækursorer velegnet til et væld af downstream applikationer.

Selv om flere andre metoder til at generere MGE-lignende ophav fra mESCs9,10,11,12,13,14, vores metode, som bygger på Wnt antagonist XAV-939, er især effektive til at generere Foxg1/Nkx2.1 Co udtrykker telencephalic ophav. Derudover forbedrer mulighed for at vælge til interneuron ophav eller deres post mitotiske Lhx6-udtrykker afkom via vores dual reporter system, høj grad evnen til at generere forskellige ophav og deres afkom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Den dobbelte reporter mESC linje er beskrevet i denne protokol er tilgængelige på anmodning (sande@mail.med.upenn.edu).

1. medier forberedelse

Bemærk: Varm alle medier til 37 ° C før brug i cellekultur.

  1. Musen embryonale Fibroblast (MEF) medier (for at forberede 500 mL)
    1. Der tilsættes 50 mL føtalt bovint serum (FBS) til 449 mL Dulbeccos modificerede Eagle's Medium (DMEM) og filtreres gennem et 500 mL 0,22 µm pore filterenhed.
    2. Tilsæt 1 mL antimikrobiel agent (50 mg/mL) efter filtrering. Gemme medier ved 4 ° C for op til 1 måned eller delprøve og butik på ≤-20 ° C.
  2. N2 medier (for at forberede 500 mL)
    1. Der tilsættes 5 mL L-alanin-L-glutamin (100 x) og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 489.5 mL DMEM: næringsstof blanding F-12 (DMEM/F-12) og filtreres gennem et 500 mL 0,22 µm pore filterenhed.
    2. Tilsæt 1 mL antimikrobiel agent (50 mg/mL) og 5 mL N2 supplement-B efter filtrering. Gemme medier ved 4 ° C i mørke i op til 1 måned.
  3. Serumfrit vækstmedium (KSR) (for at forberede 500 mL)
    1. Tilsættes 75 mL serum-frit medium supplement, 5 mL L-glutamin (100 x), 5 mL MEM ikke-essentielle aminosyrer (MEM-NEAA) (100 x), og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 413.5 mL ikke-glutamin indeholdende DMEM, og filtreres gennem et 500 mL 0,22 µm pore filterenhed.
    2. Tilsæt 1 mL antimikrobiel agent (50 mg/mL) efter filtrering. Gemme medier ved 4 ° C i op til 1 måned.
  4. Musen embryonale stamceller medier (for at forberede 500 mL)
    1. Tilføje 75 mL stamcelle grade FBS, 5 mL MEM-NEAA (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 413.5 mL ikke-glutamin indeholdende DMEM, og filtreres gennem et 500 mL 0,22 µm pore filterenhed.
    2. Tilsæt 1 mL antimikrobiel agent (50 mg/mL) efter filtrering. Gemme medier ved 4 ° C i mørke for op til 1 måned eller delprøve og butik på ≤-20 ° C.

2. dyrkning mESCs

  1. Plade mitotically inaktive MEF feeder celler i MEF medier på vævskultur behandlet plader på 3-4 x 104 celler/cm2. Tillad mindst 12 h for dem at slå sig ned i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed og 5% CO2 før plating mESCs. Hvis ikke anvendes straks, erstatte MEF medierne hver 3 dage. Smid MEFs anvendes ikke inden for 7 dage af plating.
  2. Tilføje mESCs (density spænder fra 1-4 x 104 celler/cm2) til MEF plader i mESC medier indeholdende mus leukæmi hæmmende faktor (mLIF) (1.000 U/mL). Inkuber celler ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed og 5% CO2.
  3. Passage mESCs ved hjælp af trypsin-EDTA (0,05% trypsin) (1:5-1:10) når skålen bliver ~ 70-80% sammenflydende eller hvis kolonierne begynder at røre. Dette typisk sker hver 2 dage, men kan tage til 4 eller 5 dage afhængigt af den oprindelige plating tæthed.
  4. Vedligeholde mESCs på et MEF feeder lag i mESC medium at holde pluripotency.
  5. Før du starter differentiering, passage celler mindst én gang på gelatine overtrukne plader uden MEFs at udvande ud af MEFs.
    1. Forberede gelatine overtrukne plader ved at tilføje 0,1% gelatine i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med Ca2 +/Mg2 + til en vævskultur behandlet parabol og forlader ved 37 ° C i mindst 1 h. plade 1,5-2 x 106 celler/10 cm plade (2,7-3,6 x 104 celler/cm2) og giver mulighed for cellerne til at udvide til 2 dage før du begynder differentiering.

3. differentiere mESCs mod MGE-lignende Telencephalic ophav

  1. Differentiering dag (DD) 0 = "flyde celler"
    1. Efter at mESCs er vokset gelatine belagte plader for 2 dage, Aspirér medierne og vaske cellerne en gang med PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Tilføje nok trypsin-EDTA (0,05% trypsin) at dække overfladen af pladen (typisk 4 mL trypsin-EDTA for en 10 cm vævskultur parabol), og placere cellerne tilbage i varmeskab ved 37 ° C med ≥95% relativ luftfugtighed og 5% CO2 i 4 min.
    2. Efter 4 min, slukke trypsin-EDTA ved hjælp af 2 gange mængden med mESC medier. Overføre cellerne til en passende størrelse centrifugeglas og centrifugeres celler på 200 x g i 5 min. Efter 5 min, fjerne røret og Opsug mediet uden at forstyrre pelleten. Resuspenderes i 1 mL KSR:N2 media (1:1) indeholdende BMP hæmmer LDN-193189 (250 nM) og Wnt hæmmer XAV-939 (10 µM).
    3. Måle celle koncentrationen ved hjælp af en hemocytometer eller automatiseret celle counter. Start voksende celler som embryoid organer (EBs) ved at tilføje 75.000 celler/mL i KSR:N2 medier (1:1) indeholdende LDN-193189 (250 nM) og XAV-939 (10 µM) i ikke-tilhænger vævskultur retter. Inkuber celler ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed og 5% CO2.
  2. På DD1, forberede til celle "landing" af belægning vævskultur behandlet retter med poly-L-lysin (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) natten over (O/N) ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed eller for mindst 1 h.
  3. På DD2, Aspirér poly-L-lysin og pels plader med laminin (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) O/N ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed.
    Bemærk: Mens O/N er optimale, så lidt som 2 h kan være tilstrækkeligt. Hvis pladerne ikke anvendes af den næste dag, Aspirér laminin, erstatte med PBS uden Ca2 +/Mg2 +og opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
  4. DD3 ("jord celler")
    1. Før du begynder EB dissociation, Opsug laminin og tillade plader til helt tørt i en vævskultur hætte. Brug ikke plader, der vises skinnende eller synligt våd. Overføre EBs med medier i en 15 mL rør og centrifugeres i 3-4 min på 15 x g, eller indtil EBs har pelleted.
  5. Opsug mediet og tilsættes 3 mL af celle detachement løsning indeholdende DNase (2 U/mL) og inkuberes ved 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfugtighed og 5% CO2 for 15 min. forsigtigt svirp tube hver 3 min støtte i EB dissociation.
  6. Når EBs er ikke længere synlige eller 15 min har gået, tilføje 6 mL KSR:N2 (1:1) indeholdende DNase (1 U/mL) og centrifugeres i 5 min. ved 200 x g.
  7. Plade celler i KSR:N2 (1:1) indeholdende LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 µM), og ROCK-hæmmer Y-27632 (10 µM) på 4,5-5 x 104 celler/cm2.

4. SST-berigende protokollen: "DD12 normal god landbrugspraksis høj Sonic Hedgehog (SHH)" (fortsættelse fra trin 3,7)

  1. På DD5, ændre medier med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og SSH (50 ng/mL).
  2. Forberede vævskultur plader til re plating på dag 8 (trin 4.4) ved hjælp af instruktionerne i trin 3.2-3.3.
  3. På DD7, ændrer media med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og SHH (50 ng/mL).
  4. På DD8, re plade cellerne.
    Bemærk: Dette trin er ikke afgørende, re plating cellerne kan reducere tidlige-opdelte, uønskede celletyper. Re plating også bryder op bolde af celler, som vanskeliggør downstream immunhistokemiske analyser, og øger effektiviteten af FACS på senere tidspunkter.
    1. Re plade celler, frigør celler fra pladen med trypsin-EDTA (0,05% trypsin) i 5 minutter ved 37 ° C med ≥95% relativ luftfugtighed og 5% CO2. Dæmpning trypsin-EDTA ved hjælp af 2 gange mængden med KSR:N2, og der centrifugeres i 5 min. ved 200 x g filtrere celler gennem en 40 µm filter rør til at fjerne eventuelle klumper. Re plade celler på 250.000 celler/cm2 i N2/KSR (1:1), der indeholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og Y-27632 (10 µM) med SHH (50 ng/mL).
      Bemærk: Hvis i stedet, er det besluttet ikke at re plade celler på DD8, ændre medierne med KSR:N2 indeholdende SHH (50 ng/mL) hver 2 dage fra DD7 til DD12 og fortsætte med at tilføje IGF-1 (20 ng/mL) og FGF-2 (10 ng/mL) indtil DD9.
  5. På DD10, ændre medierne med KSR:N2 indeholdende SHH (50 ng/mL).
  6. På DD12, for at få celler, der er beriget til SST undertyper, bruge FACS for at isolere Lhx6::GFP-kun udtrykke celler.
    1. For at frigøre cellerne, bruge en ikke-trypsin indeholdende celle-dissociation reagens i stedet trypsin-EDTA. Vaske cellerne en gang med PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Tilføje pre varmede ikke-trypsin indeholdende celle-dissociation reagens indeholdende DNase (2 U/mL) til cellerne. Placere dem i varmeskab ved 37 ° C med ≥95% relativ luftfugtighed og 5% CO2 i 10-30 min, eller indtil cellerne har løsrevet. Forsigtigt trykke pladerne hvert 5 min støtte dissociation.
      Bemærk: For DD11-12 kulturer, kan kun 10-15 min være nødvendigt. For DD15-16 kulturer, kan 30 min eller mere være nødvendig for komplet dissociation.
    2. Når cellerne har helt løftes af pladen, Fortsæt til FACS isolation bruger standardprotokoller eller bruge celler i andre downstream analyser.

5. PV-berigende protokollen: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (fortsættelse fra trin 3,7)

  1. På DD5, ændre medier med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Forberede vævskultur plader til re plating på DD8 (trin 4.4) ved hjælp af instruktionerne beskrevet i trin 3.2-3.3.
  3. På DD7, ændrer media med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  4. På DD8, re plade cellerne som beskrevet i trin 4.4 med følgende undtagelser: når re plating cellerne, erstatte SHH med glittesinden agonist (SAG; 30 nM) og tilføje atypiske PKC hæmmer (aPKCi; 2 µM). Taget sammen, de re forkromning medier er nu N2/KSR (1:1), der indeholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SYNKE (30 nM), og aPKCi (2 µM).
  5. På DD10, skal du ændre medierne med KSR:N2 indeholdende aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Bemærk: på dette punkt, Nkx2.1::mCherry+ celler er beriget til at blive PV CIns.
    1. Frigør celler fra pladen til FACS ved hjælp af samme protokollen beskrevet taktfast 4.6. Hvis beslutningen at indsamle Nkx2.1::mCherry+ celler på en senere differentiering dag, se bort fra dette trin.
  7. På DD12, skal du ændre medierne med KSR:N2 indeholdende aPKCi (2 µM). På DD14, skal du ændre medierne med KSR:N2 indeholdende aPKCi (2 µM). På DD16, skal du ændre medierne med KSR:N2 indeholdende aPKCi (2 µM). På DD17, indsamle de Nkx2.1::mCherry+ celler ved hjælp af samme protokollen beskrevet taktfast 4.6.

6. PV-berigende protokollen: "DD17 mCherry lav SHH" (fortsættelse fra trin 3,7)

  1. På DD5, ændre medier med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL). På DD7, ændrer media med KSR:N2 (1:1) indeholdende FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  2. På DD9, ændre media med KSR:N2 (1:1). Fra dette punkt og fremefter er ingen yderligere vækstfaktorer nødvendige.
    1. Fortsætte med at ændre medierne hver 2 dage indtil høst celler på DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet i denne hvidbog er en modificeret udgave af vores publicerede protokoller15,16,17 og er blevet optimeret til brug sammen med vores Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje. Ved at tilføje Wnt hæmmer XAV-939 fra DD0-5, kombineret med re plating på DD8, opnå vi robuste Nkx2.1 induktion, hvori op mod 50% af alle DAPI + kerner i kultur er også Nkx2.1 at udtrykke (figur 1A, B). Immunhistokemi for mCherry og normal god landbrugspraksis journalister viser klart udtryk inden for områder af Nkx2.1-positive immunoreactivity (figur 1A). FACS af levende celler ved hjælp af den indbyggede reporter viser, at fire populationer af celler kan være klart isoleret: (1) normal god landbrugspraksis/mCherry dobbelt negativ celler, (2) mCherry-kun udtrykker celler, (3) NGL-kun udtrykke celler og (4) NGL/mCherry dobbelt-udtrykker celler ( Figur 1 c). Ved hjælp af denne linje, begynder en lille brøkdel af stamfaderen at tænde mCherry reporter omkring DD8-9. MCherry niveauer peak mellem DD12-13, og derefter falde støt da stamfaderen frakørsel cellecyklus og producere post mitotiske Lhx6::GFP + interneuron prækursorer (fig. 1 d). Tilsvarende, Lhx6::GFP reporter vender på mellem DD9-10 og toppe omkring DD13-14 (fig. 1 d). Selv om det samlede antal Lhx6::GFP celler fortsætter med at stige i kultur, gør procentdelen ikke, sandsynligvis på grund af spredningen af andre slægter. Endnu en Lhx6::GFP + reporter udtrykker, det fortsat kan spores på ubestemt tid, da Lhx6 er stabilt udtrykt i modne MGE-afledte kortikale interneurons18,19. Selv om Nkx2.1 og Lhx6 udtryk er stort set ikke-overlappende i de murine forhjernen, er der en forbigående befolkning af Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP Co udtrykker celler i kultur. Dette er i det mindste delvis skyldes perdurance af mCherry reporter ud over den normale tidsramme for Nkx2.1 udtryk, som de fleste af dobbelt-mærket cellerne ikke udtryk påviselige mængder af Nkx2.1 protein (Tyson og Anderson, upubliceret). Celler fortsætter med at udtrykke både Lhx6 reporter og kirsebær/Nkx2.1 protein kan være striatal interneurons20. Men, baseret på vores live imaging studier, der er et vindue på ca 18 h hvori synkron, nyligt post mitotiske prækursorer udtryk for Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP kan være isoleret (Tischfield Anderson, upubliceret og se Tischfield et al. 17). ved at samle Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP dobbelt positive celler på ethvert tidspunkt under protokollen, det er således muligt at opnå en befolkning af celler, der overvejende har forladt cellecyklus inden for ca. 18 h af hinanden. Dette er i modsætning til Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP-udtryk kun for celler, som repræsenterer forskellige typer af stamfaderen og prækursorer, henholdsvis, af varierende fødselsdage.

Linjen Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC kan bruges til at berige for SST-skæbnesvangre interneurons. I almindelighed, tilføje SHH til kulturer og indsamling af normal god landbrugspraksis + celler på tidligere tidspunkter i differentiering (f.eks.DD12) beriger for SST undertyper. Baseret på vores bemærkninger, vi har ikke set en betydelig forskel i SST:PV-forhold afhængig af om SHH er tilføjet på DD5 eller DD8 (data ikke vist). Ved at tilføje SHH (50 ng/mL) fra DD8-12 og derefter omplantning af normal god landbrugspraksis, der kun udtrykker celler, vi får i gennemsnit en 7:1 forholdet mellem SST:PV CIns (figur 2A)15,17. For flere detaljer om virkningerne af SHH og tid i kultur på interneuron skæbne ved hjælp af vores dual-reporter mESC linje, ser Tyson et al. 15

For at berige for PV-skæbnesvangre CIns, skal SHH udelades fra kultur medier. Af note, i overensstemmelse med kravet om SHH signalering til at opretholde Nkx2.1 udtryk i mitotiske stamfaderen21, SHH signalering findes i disse kulturer uden eksogene SHH bliver tilføjet siden SHH signalering antagonist cyclopamine eliminerer Nkx2.1 udtryk15. Men hvis cellerne igen forgyldt på DD8, denne endogene SHH er fjernet, sådan at SYNKE (30 nM) skal tilføjes til medierne fra DD8-10 at opretholde Nkx2.1 udtryk og produktion af CIns. Vores tidligere undersøgelse viste, at ved at tilbageholde SHH fra dyrkningsbetingelserne og sortering for Nkx2.1::mCherry+ celler på DD17, et ~2.6:1 forhold på PV:SST celler kunne være opnået (figur 2B)15. I modsætning til SST undertyper, der er beriget på tidligere stadier og i overværelse af eksogene SHH, øget varighed i kultur og manglende eksogene SHH beriger for PV undertyper15. I en nyere undersøgelse fandt vi, at aPKCi anvendes til vores "MGE" protokol betydeligt øger brøkdel af Nkx2.1::mCherry ophav, der udtrykker cyclin D217, en markør af mellemliggende stamfader celler22. Denne protokol variation blev baseret på vores konstatering af, at PV-udtrykker CIns stammer primært fra mellemliggende progenitorceller, mens SST ophav stammer primært fra radial stamfaderen på den ventrikulære overflade23. Vi har fundet, at når sorteret og transplanteret ind i neonatal mus neocortex, disse ophav er meget forudindtaget til fremstilling af PV-undertyper. Ved at tilføje aPKCi fra DD8-11 og derefter sortere Nkx2.1::mCherry celler, var vi i stand til at opnå et 5.8:1 forhold på PV:SST undertyper (figur 2 c)17. For at berige for PV undertyper, har vi også isoleret Nkx2.1::mCherry celler dyrkes i overværelse af aPCKi fra DD8-17. Vi opnåede dog ikke en stigning i PV:SST forholdet ud over hvad vi har kunnet opnå på DD11, trods en marginal stigning i andelen af PV undertyper genereret (figur 2D). Rutediagrammer for hver af disse protokoller er indeholdt i figur 3. Immunfarvning af musen brains 30 dage efter transplantation med anti-PV, anti-SST og anti-normal god landbrugspraksis (til at forbedre identifikationen af Lhx6::GFP + celler) antistoffer viser at Lhx6::GFP + celler udviser modne morfologiske træk med mønstre af PV og SST udtryk beslægtet med deres i vivo modparter (figur 4 og figur 5).

Hjælp til at bestemme, om en CIn differentiering vises succes, har vi udarbejdet en række billeder på hvert trin i protokollen til at vise normal variabilitet (figur 6, figur 7, figur 8). Vi har desuden en figur viser hvordan en mislykket differentiering vises på DD4 (fig. 9). Generelt er vil mislykket differentieringer give lavt (mindre end 10%) af Nkx2.1 udtryk og procenter af Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP induktion på ca 1% eller derunder.

Figure 1
Figur 1: Generation af Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP interneuron prækursorer. (A) vist her er repræsentative billeder af immunfarvning for Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) og Lhx6::GFP (normal god landbrugspraksis) fra en differentiering dag 12 (DD12) kultur. Bemærk, at disse billeder er overlappende kanaler fra den samme synsfelt. (B) kvantificering af den gennemsnitlige procentdel af DAPI + kerner, der udtrykker Nkx2.1 på DD12 i kultur (n = 3 uafhængige differentieringer). (C) repræsentative FACS plot viser de fire forskellige cellepopulationer, der kan isoleres ved hjælp af vores dual reporter mESC linje. Bemærk at mCherry er på x-aksen og normal god landbrugspraksis på y-aksen. Således, den øverste højre boks repræsenterer celler, der er normal god landbrugspraksis-mCherry-dobbelt positive. (D) gang kursus i Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP induktion fra DD6-16 udtrykt som procentdelen af celler i kultur, er enten mCherry-kun at udtrykke, normal god landbrugspraksis, der kun udtrykker eller mCherry/NGL Co udtrykker. Disse procentsatser blev fremstillet af celler dyrkes i overværelse af SHH under en SST-berigende protokol og repræsenterer gennemsnit fra 3 uafhængige differentieringer. Fejllinjer i (B) og (D) repræsenterer SEM. skala bar = 150 µm (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Manipulation af dyrkningsbetingelser varierende beriger for PV-versus SST-skæbnesvangre mESC afledt kortikale interneurons. (A) procent af PV +, SST + og PV- / SST-interneurons opnået ved DD12, kun for normal god landbrugspraksis udtrykker celler dyrkes i overværelse af SHH (50 ng/mL) fra DD5-12 kan transplanteres ind i neonatal neocortex og analyseret 30 dage efter transplantation. (B) procent af PV +, SST + og PV- / SST-interneurons opnås, når DD17, mCherry alene udtrykker celler dyrkes uden supplerende SHH er transplanteret ind i neonatal neocortex og analyseret 30 dage efter transplantation. (C) procent af PV +, SST + og PV- / SST-interneurons opnået ved DD11, mCherry alene udtrykker celler dyrkes i overværelse af SAG (30 nM; DD8-10) og aPKCi (2 µM; DD8-11) kan transplanteres ind i neonatal neocortex og analyseret 30 dage efter transplantation. (D) procent af PV +, SST + og PV- / SST-interneurons opnået ved DD17, mCherry alene udtrykker celler dyrkes i overværelse af SAG (30 nM) fra DD8-10 og aPKCi (2 µM) fra DD8-17 er transplanteret ind i neonatal neocortex og analyseret 30 dage efter transplantation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: illustrerer de forskellige PV - og SST-berigende protokoller er beskrevet i denne undersøgelse Flowcharts. (A) For alle protokollerne, de trin, der fører op til starten af den differentiering, herunder DD0-5 er identiske. Alle celler dyrkes som embryoid organer fra DD0-3 i N2:KSR (1:1) suppleret med BMP-inhibitor LDN-193189 og Wnt hæmmer XAV-939. DD3, er cellerne "landede" i N2:KSR (1:1) indeholdende LDN-193189, XAV-939 og ROCK-hæmmer Y-27632. For at berige for SST-undertyper, er SHH tilføjet fra DD5-12. Alternativt, SHH er tilføjet fra DD8-12, da vores erfaring, tilsætning af SHH fra DD5 versus DD8 og fremefter ikke væsentligt påvirker forholdet mellem PV:SST undertyper genereret. Tidligere versioner af protokollen (Se Tyson mfl. 15) ikke indarbejde en re forkromning trin på DD8 og i stedet suppleret medier med eksogene SHH på DD5. Denne protokol blev senere ændret til at indarbejde en re forkromning trin på DD8 sammen med indførelsen af SHH, som ikke i væsentlig grad ændre PV:SST forhold. I protokollens "high-SHH" er Lhx6::GFP + celler dyrkes i overværelse af eksogene SHH FACS isoleret på DD12 til brug i downstream applikationer. (B) "lav-SHH" PV-protokollen eksogene SHH samt det re forkromning trin på DD8 er udeladt. Nkx2.1::mCherry+ celler er i stedet FACS isoleret på DD17 til brug i downstream applikationer. (C) For den "+ aPKCi" PV protokol, aPKCi er tilføjet sammen med SAG fra DD8-10 og kun aPKCi er tilføjet fra DD10 videre. På DD11 eller DD17 er Nkx2.1::mCherry celler FACS isoleret til brug i downstream applikationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PV og SST immunfarvning i Lhx6::GFP + celler 30 dage efter transplantation i neonatal neocortex. (A) High power billede af en SST-udtrykker, Lhx6::GFP + celle 30 dage efter transplantation i neonatal neocortex. Er single channel-billeder af Lhx6::GFP, PV og SST udtryk med en 3-kanals flettede billede nederst i hver kolonne af fire billeder. Som vist i det øverste panel, uddyber dette Lhx6::GFP + neuron flere processer tyder på et ældre morfologi. (B) High power billede af to PV-udtrykker, Lhx6::GFP + celler 30 dage, efter transplantationen. (C) High power billede af en SST- / PV-dobbelt negativt, Lhx6::GFP + celle. Selv om denne celle uddyber flere processer i overensstemmelse med komplet differentiering og kortikale integration, udtrykker denne celle klart ikke PV eller SST. Bemærk at der er en PV + kerne støder op til cellen Lhx6::GFP +, men at det ikke overlapper. Skalere barer = 50 µm (A-C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Medium og low power billeder af PV, SST og Lhx6::GFP udtryk, protein 30 dage efter transplantation i neonatal neocortex. (A) Medium styrke billedet af en region af musen neocortex indeholdende 30 Lhx6::GFP + celler 30 dage efter transplantationen. Disse celler blev dyrket ved hjælp af PV protokol (+ aPKCi fra DD8-11; FACS isolere og transplantation Nkx2.1::mCherry+ på DD11). Af de 30 celler ses her, 16 express PV, 4 express SST og 10 express hverken PV eller SST. (B) Low power billede af en region af musen neocortex indeholder talrige, godt differentieret Lhx6::GFP + celler 30 dage efter transplantationen. Bemærk overfloden af Lhx6::GFP + processer løbe hele cortex. Lejlighedsvis celler findes også i hippocampus, hvor de synes at integrere og uddybe processer i overensstemmelse med en ældre fænotype. Skalalinjen = 50 µm (A); 550 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Normal udseende af musen embryonale fibroblast feeder lag og udifferentierede stamceller. (A) vist her er 4 X og 10 X forstørrelse brightfield billeder viser den typiske udseende af vores mus embryonale fibroblast (MEF) feeder lag 24 h efter plating. (B) vist her er den typiske udseende af vores mus embryonale stamceller (mESCs) 2 dage efter plating på MEF foderautomater. Bemærk at kolonierne har en lyse omkreds og er elliptiske eller ovale i udseende. Hvis kolonierne mister denne lyse omkredsen eller begynde at sende udadgående fremspring, er disse tegn på, at cellerne kan differentiere. (C) vises her er mESCs 1 og 2 dage efter re plating på gelatine belagt retter for at fortynde ud MEF foderautomater forud for begyndelsen differentiering. Bemærk at stamcellerne udvide betydeligt efter 48 h på gelatine og begynde at genanskaffe en æggeformet udseende med en lyse omkreds. Skalalinjen = 100 µm i 4 X og 10 X fotos. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: udseendet af musen embryonale stamceller på differentiering dage 1 til 7. (A) en dag efter flydende, stilken celler kan ses danner små embryoid organer (EBs). I dag to af EBs har vokset betydeligt. Bemærk at nogle EBs har holdt sammen og dannet større klynger af celler. Vi synes ikke, at dette negativt påvirker differentiering. Efter 3 dage, EBs er vokset endnu større og nogle ikke længere sender lys gennem dem. Det er normalt at se celle debris i baggrunden. (B) vises her er stamceller 24 timer efter landingen på differentiering dag 4 (DD4). Bemærk tætheden af cellerne. Mange er begyndt at udvide små processer, hvilket vil øge som differentieringen fortsætter. Bemærk her at cellerne selv er farvet med små sorte prikker spredt over hele. Hvis cellerne er skinnende eller homogen optræder, er det et tegn på afvigende differentiering. (C) af DD5, cellerne har fortsat med at formere sig og danne neurale rosetter. Mange celler har udvidet lange, tynde processer. (D) af DD7, cellerne bør sammenflydende. Det er normalt at se en "Schweizerost" mønster, hvori store, flade, multinucleated celler (eventuelt ependymal eller glial celler) skabe cirkulære øer inden for et lag af neurale stamceller. Lejlighedsvis gør når celle tæthed er højere end normalt, denne "Schweizerost" mønster ikke udvikling, som vist i den midterste billede. Afhængigt af differentiering, kan dette påvirke neurale induktion. 4 x og 10 x angiver forstørrelsen. Skalalinjen = 100 µm i 4 X og 10 X fotos. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: udseendet af differentiering på dage 9-14. (A) enkelt celler kan visualiseres dagen efter igen plating. Bemærk deres bipolar udseende, som er typisk for neurale stamceller. Kulturen er homogen med få andre infiltrating celletyper. Tætheden er passende for denne fase. (B) af DD11, cellerne er vokset til en éncellelag. Svarende til tidligere stadier i differentiering, store "æg-lignende" multi nucleated celler kan ses spækket hele. (C) af DD13 celler har fortsat med at formere. De kan nu ses, danner små gravhøje. Mange "æg-lignende" celler er stadig til stede i hele. Fra dette punkt og fremefter, vil kulturen vise kun et par ændringer, med undtagelse af gravhøje vokser større. 4 X, 10Xx, og 20 X angiver forstørrelsen. Skalalinjen = 100 µm i 4 X og 10 X fotos og skalalinjen = 50 µm i 20 X fotos. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: udseendet af en mislykket differentiering på dag 4. DD4 er vigtig for evaluere succesen med en differentiering, fordi det følger en af de sværeste trin i protokollen: landing på DD3. Af DD4, har cellerne havde 24 timer til at gendanne efter at være adskilt fra embryoid organer. Som kan ses her, er de fleste af cellerne skinnende og homogen vises. Spækket hele er lejlighedsvis celler, der vises normalt, at have en mørkere udseende med små sorte prikker spredt over hele. Derudover er store flade celler, (som kan ses i det nederste venstre panel) vejledende for afvigende differentiering. Mindst tre små grupper af celler (gule pile) vises i nederste højre panel, som små embryoid organer, der angiver enten defekt differentiering, ufuldstændige EB dissociation eller dårlig overholdelse af overfladen af celle kultur plade. Disse billeder vises i modsætning til dem, der vises i figur 7B, som skildrer sunde, normale celler i DD4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens denne metode er meget effektiv til mønster J1-afledte mESCs (SCRC-1010), har vi oplevet svingende held med andre mESC linjer og klonede isolater. For eksempel, Foxg1::venus mESCs (EB3-stammer; Danjo et al. 13) reagerer dårligt til denne protokol og Foxg1 induktion af DD12 er typisk om 1-2%. Af årsager, vi ikke helt forstår, producerer en anden Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter klon (såkaldte JQ59), der blev isoleret samtidigt som den linje, der er beskrevet i denne protokol (såkaldte JQ27), mindre end 1% Nkx2.1-udtrykker celler når der dyrkes identiske betingelser. Den overordnede linje (J1; ATCC SCRC-1010), men reagerer godt til denne protokol og producerer procenter af Nkx2.1-udtrykker celler på DD12 svarende til dem, der vises i figur 1B. Hvis det er nødvendigt, kan koncentrationen af XAV-939 og SHH/SAG justeres for at optimere differentiering betingelser på grundlag af linje for linje. Vores erfaring med at bruge denne protokol til at differentiere andre mESC linjer i MGE-lignende stamfaderen er dog begrænset.

Med hensyn til vores Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje express ikke alle Nkx2.1 + celler mCherry. Selv om næsten alle mCherry + celler express Nkx2.1 protein, bagefter reporter udtryk Nkx2.1 protein udtryk, især i tidlige stadier af differentiering (DD7-9). Brøkdel af Nkx2.1 + celler, der udtrykker mCherry støt stiger i løbet af differentiering. På peak niveauer (~ DD12-14) mCherry udtrykkes i omkring 30% af alle Nkx2.1 udtrykker stamfaderen17. Derudover er den samme bakterielle kunstige kromosom bruges til at drive mCherry udtryk blevet brugt til at drive Cre recombinase i Nkx2.1-udtryk domæner af Transgene mus24. I disse mus, Cre-udtryk var svag i Nkx2.1-udtrykker celler i regionen dorsal-mest af MGE og skæbne-kortlægning med denne mus syntes at under etiketten SST-udtrykker CIns, der er kendt for at være stort set genereret fra denne region25, 26,27,28. Men trods disse uoverensstemmelser, millioner af normal god landbrugspraksis eller mCherry-udtrykker celler kan være isoleret med kun et par timer af FACS.

Der er to vigtigste fordele ved denne teknik. Først, når det kombineres med vores Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje, det er muligt at opnå store antal interneuron prækursorer beriget for at blive PV eller SST-skæbnesvangre kortikale interneuron undertyper. Den anden største fordel er den relative lethed med hvilken stort antal interneuron skæbnesvangre celler kan opnås. Selv om flere andre modificerede EB teknikker findes for at differentiere MGE ophav og neuroner, afhængige disse protokoller typisk af brugen af Wnt-hæmmende molekyler såsom Dkk113,14,29. Vi har fundet, at Wnt hæmmer XAV-939 forbedrer i høj grad generation af pallidal telencephalic progenitorceller, som det fremgår af Foxg1 og Nkx2.1 udtryk15.

Som tidligere nævnt, findes flere andre metoder til at generere MGE-lignende ophav fra mESCs. Watanabe et al. 14 pioner inden for telencephalic differentiering fra mESCs ved at være først til at udvikle et serumfrit suspension kultur metode efterfulgt af re plating på en vedhængende overflade. De fandt, at Wnt og Nodal antagonister, Dkk1 og LeftyA, henholdsvis, effektivt kørte mESCs ind i tidlige neuroectodermal lineages13. Ved at anvende SHH til disse kulturer, de bemærkede, at mellem 5-15% af alle celler i kultur Co udtrykt Nkx2.1/Foxg1 og kunne betragtes som MGE-lignende stamfaderen13. Men samtidig lægge grundvolden for mange undersøgelser til at komme, denne undersøgelse ikke havde en måde at isolere MGE ophav eller berige for særlige CIn undertyper.

Flere år senere, Danjo et al. 13 bruges metoden samme serumfrit suspension kultur i kombination med den tidsbestemte administration af forskellige vækstfaktorer i særlige SHH, for at opnå subregionale specifikation af mESC-afledte ventrale telencephalic væv. Bruger en Foxg1::venus reporter linje, fandt de at SHH administration fra DD3-12, efter Dkk1 behandling resulterede i mellem 45-68% af alle celler i kultur at udtrykke Foxg1::venus reporter13. Inden for Foxg1::venus + befolkningen udtrykt ca. 32% af celler Nkx2.113. Ved at erstatte SHH for SAG og tilføje Fgf8, forbedret de yderligere brøkdel af Nkx2.1 progenitorceller inden for befolkningens Foxg1::venus + til ca 41%13. Når analyseres for skæbne, producerede disse celler ca 17% SST, 21% PV, 18% NPY og 8% calretinin undertyper13. Men mens denne undersøgelse beskrives en metode til at angive CGE versus MGE-afledte CIn skæbner, det ikke beskrive en metode til selektivt berige for PV eller SST undertyper.

Det følgende år, Cambray et al. 11 anvendes et serumfrit éncellelag metode med re plating på DD5 for at studere effekten af activin på differentiering og identiteten af telencephalic neurale prækursorer afledt af mus og menneskelige sektorrådene. Selv om denne undersøgelse ikke rapportere procentdelen af Nkx2.1 celler genereret i deres protokol, rapporterer de, at omkring 54% af celler i kultur Co udtrykt Nestin/Foxg1 på DD2 (5 dage af vækst i serum frie medier efterfulgt af en yderligere 2 dage af kultur efter re plating)11. De rapporterede også, at med tilføjelsen af activin, ~ 55% af celler Co udtrykt nestin og CouptfII, der angiver, at disse celler kan repræsentere caudale ganglionære eminence-lignende celler, der producerer størstedelen af calretinin-udtrykker kortikale interneurons 11., af 8 dage i kultur (13 dage samlede) 39% af celler blev fundet til co express calretinin/BIII-tubulin, mens 59% af celler blev fundet Co udtrykke GABA/BIII-tubulin11. Denne undersøgelse undersøgte ikke produktionen af PV eller SST undertyper.

Igen ved hjælp af en modificeret EB metode, Chen et al. 12 demonstreret at MGE-specifikke enhancer elementer kan anvendes til at følge og rense stamceller afledt MGE-lignende celler12. I denne undersøgelse sammenlignede de effekten af forskellige kultur betingelser under styret differentiering af mESCs til MGE-lignende stamfaderen ved hjælp af en Lhx6::GFP reporter linje; den samme linje, der fungerede som den overordnede linje for linjen Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter beskrevet i dette håndskrift. De viste, at ved at tilføje Dkk1 kultur betingelser fra DD0-3, efterfulgt af tilsætning af SAG, upwards af ~ 10% af alle cellerne i kulturen udtrykt Lhx6::GFP12. De også fandt, at den samme protokol, anvendes til linjen Foxg1::venus beskrevet af Danjo et al. 12, resulterede i ca. 37% af alle celler, der udtrykker Foxg1::venus reporter. Når Lhx6::GFP celler blev transplanteret i vivo, følgende gennemsnitlige procenter af CIn subtype markører blev observeret: 22% PV, 58% SST og 16% NPY12.

For nylig, har andre grupper bruges den tvungne udtryk for fastlæggelse af afstamning transkriptionsfaktorer direkte angive CIns. Måske var den første demonstration af dette af Petros m. fl. 10 der bruges en doxycyclin-inducerbar initiativtageren til at drive Nkx2.1 udtryk i Ainv15 mESCs, som blev ændret til at indeholde en Lhx6::GFP bakteriel kunstige kromosom. Denne undersøgelse anvendes kultur betingelser svarende til dem, der beskrives i det aktuelle manuskript, men uden tilsætning af XAV-93910. Men af årsager, der er dårligt forstået, en lavere procentdel af Lhx6::GFP + celler blev observeret på samme betingelser differentiering i forhold til, når du bruger linjen J1 Lhx6::GFP overordnet beskrevet i dette manuskript10. På trods af at opnå lignende niveauer af Foxg1 udtryk (samlede % ukendt), der var en moderat reduktion i antallet af Nkx2.1 celler uden større end 2% af alle celler, der udtrykker Lhx6::GFP reporter10. Denne undersøgelse fremhæver de iboende forskelle, der findes mellem forskellige ESC linjer og udfordringerne at forskere ansigt, når du forsøger at anvende differentiering protokoller til ESC linjerne adskiller sig fra dem, der blev brugt til oprindeligt udvikle protokoller.

Ved hjælp af en elegant tilgang, Au et al. 9 brugt den sekventielle tvungen udtryk af transkriptionsfaktorer til at generere specifikke undertyper af kortikale interneurons ved hjælp af den samme ventrale telencephalic differentiering paradigme udviklet af Watanabe et al. 14 mens de ikke rapporterer om de nøjagtige farveprocenter Foxg1 +, Nkx2.1 + og Olig2 + prækursorer produceret i kultur, de anfører, at ca. 50% af alle celler i kultur opdeles i GABAergic neuroner9. På 11 dage efter differentiering, blev EBs adskilles og transplanteret ind i MGE af E13.5 vært embryoner9. En lille procentdel af disse (mindre end 1%) overført fra MGE i cortex, hvor de blev identificeret ved deres Dlx5/6-eGFP reporter og analyseret for skæbne9. Forfatterne observeret en række forskellige procentdele af PV, SST og CGE-lignende skæbner baseret på deres valgte tvungen induktion strategi9. Interessant, med udtryk for transkriptionsfaktor Lmo3, de har observeret i gennemsnit ca 57% PV, 21% SST og 15% CGE-afledte undertyper (SST- / reelin + eller VIP-kun +)9. Den største procentdel af SST undertyper observeret blev opnået ved hjælp af en Nkx2.1/Dlx2 GOF linje, der produceres cirka 32% SST, 35% PV og 25% CGE-afledte undertyper9.

I 2015, Colasante et al. 30 viste, at tvungen udtryk for fem transkriptionsfaktorer (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 og Lhx6) inden for fibroblaster fra GAD67-normal god landbrugspraksis reporter mus konverteret 15% af alle celler til GABAergic-lignende CIns. Bemærkelsesværdigt, ca 90% af disse celler gik at udtrykke PV, med kun sjælden celler udtrykker SST30. Selvom denne metode ikke blev anvendt til mESCs, blev det brugt med menneskelige iPSCs, hvor det blev anslået, at omkring 30% af alle celler vedtaget en GABAergic identitet30.

Som vist i figur 2, er der flere måder at generere beriget populationer af PV eller SST CIns. De vigtigste fordele ved PV-protokollen udnytter aPKCi over DD17-protokollen er det større antal celler en kan isolere, celle levedygtighed og varighed af kultur. Selvom vi ikke viser data for DD17 induktion niveauer i figur 1, der er cirka dobbelt så mange mCherry + celler hos DD11 som findes på DD17 (data ikke vist). Når du indsamler celler til transplantation, vi finder, at et større antal startende celler (se nedenfor) er fordelagtig, da omkring 30-50% af celler går tabt ved at koncentrere dem til injektion. Desuden kan et større antal celler fås med kortere FACS gange, hvilket begrænser mængden af tid, at cellerne er på isen og sænker de samlede omkostninger. Sandsynligvis fordi en højere procentdel af kirsebær + celler er stamfaderen, udviser celler fra tidligere stadier af kultur (f.eks.DD11) større overlevelse i forhold til DD17 celler efter transplantation til neonatal neocortex. Når store mængder af levedygtige celler er nødvendige, er for eksempel for celle transplantation til behandling af epilepsi, at have både en større begynder befolkningen og større rentabilitet en stor fordel.

Som afbildet i figur 2, afhængigt af protokollen, analyseret ca 25-39% af Lhx6::GFP + celler 30 dage efter transplantation ikke udtryk påviselige mængder af PV eller SST protein med rutinemæssig Immunhistokemi. Generelt, disse PV- / SST-celler udtrykker GABA samt Sox6, en markør af MGE-afledte kortikale interneurons (Se Tyson et al. 15, Tischfield et al. 17). mindre end 1% af PV- / SST - Lhx6::GFP + celler udtrykkelige markører for andre interneuron undergrupper, såsom calretinin, reelin eller neuropeptid Y (data ikke vist). Dette er magen til i vivo skæbne kortlægning undersøgelser der har vist, at mellem ~ 15-25% af MGE-afledte interneurons ikke udtryk PV eller SST23,25,31. Når Nkx2.1::mCherry+ eller Lhx6::GFP + celler er isoleret og belagt på rotte kortikale foderautomater i vitro, vi har konstateret, at ~ 40-70% af Lhx6::GFP + celler analyseret efter 28 dage i kultur er PV-/ SST-, med et flertal af dem, der pletten positive at udtrykke SST. Denne stigning i PV- / SST-celler kan være på grund af fraværet af en ydre maturational signal, der er til stede i vivo, som kan især være tilfældet for modne PV udtryk eller suboptimal elektrofysiologiske input fra feeder celler. Uanset hvad årsagen kan være, foretrækker vi at omplante celler i neonatal neocortex skæbne analyse snarere end in vitro- differentiering.

For de fleste transplantation eksperimenter, anbefaler vi flyder på DD0 et minimum af to 10-cm ikke-tilhænger vævskultur retter hver indeholdende 7,5 x 105 mESCs i 10 mL N2/KSR (7,5 x 104 celler/mL, 20 mL samlede volumen). Sammen, vil begge plader typisk give 8-12 x 106 celler efter EB dissociation på DD3, af hvilke 5,4 x 106 celler kan bruges til at frø to 6-godt vævskultur behandlet plader (50.000 celler/cm2; ca 110 cm2 i alt). Af DD8 giver hver 6-godt plade ca 5-7 x 107 celler, som derefter kan bruges til frø en yderligere tre til fem 6-godt plader med en tæthed på 250.000 celler/cm2 (kræver alt 4.05 x 107 celler for tre 6-godt plader eller 6,75 x 107 celler for fem 6-godt plader). Af DD14, vil hver 6-godt plade typisk give 1-2,5 x 106 mCherry eller udtryk for normal god landbrugspraksis celler. Afhængigt af eksperimentet behov har vi svævede et minimum af 7,5 x 105 mESCs for små Immunhistokemi analyser til op til 6 x 106 mESCs for store transplantation projekter.

De mest kritiske trin i protokollen er at opretholde mESCs i en pluripotente tilstand før begyndelsen differentiering og landing/dissociation skridt på DD3. Hvis cellerne har været vedligeholdes ordentligt og landing/dissociation på DD3 gøres omhyggeligt, differentiering vil normalt være vellykket. Kun stamceller der vises sund og bør bruges til at differentiere. Hvis EBs undlader at danne mellem DD0-3 eller danne flere, små, asymmetrisk organer, differentieringen er tilbøjelige til at mislykkes. Derudover under EB dissociation på DD3, bør EBS overvåges nøje indtil ikke længere synlige med det blotte øje at undgå langvarig udsættelse for ikke-trypsin indeholdende celle-dissociation regent.

Resultaterne præsenteres i dette dokument blev indhentet optimeret betingelser ved hjælp af kvalitetskontrollerede reagenser. Det er vigtigt at Bemærk da vi indimellem har svært ved at opnå robuste Nkx2.1 induktion og ved udvidelse, mCherry og normal god landbrugspraksis reporter udtryk. Baseret på vores erfaringer, mener vi at lot-for-lot variabilitet FBS sandsynligvis regnskaber for disse ændringer. Som sådan, er det klogt at teste forskellige masser af FBS at afgøre, der fungerer bedst for at opretholde mESCs. Selv om vi ikke har brugt ordningen 2i/LIF (serumfrit medium indeholdende MEK hæmmer PD03259010 og GSK-3α/β hæmmer CHIR99021), er det muligt at serumfrit mESC betingelser kan producere mere ensartede resultater. Vi har dog ikke testet denne hypotese og har ingen data om, hvorvidt brugen af serumfrit mESC medier påvirker differentiering af mESCs til MGE-lignende stamfaderen. Derudover skal du bruge friske vækstfaktorer når det er muligt ved aliquoting dem til engangsbrug. Afhængigt af brugeren, kan cellen tætheder skal øges for at opnå tilstrækkelig celle overlevelse, især under trinnet landing på DD3.

Interneurons har den bemærkelsesværdige evne til at overleve, overføre og integrere i host-kredsløb efter transplantation. Som sådan, denne protokol kan bruges til transplantation interneuron prækursorer til epileptiske musemodeller og andre modeller af neurologiske og neuropsykiatriske sygdomme (Se Southwell et al. 32 og Tyson og Anderson33 evalueringer af interneuron celle baseret terapier). For eksempel, i en nylig undersøgelse Donegan et al. 34 beriget populationer af PV og SST CIns til transplantation ind i en musemodel af skizofreni. De fandt, at PV og SST beriget transplantationer produceret forskellige effekter på mus adfærd, med PV beriget populationer normalisere skizofreni endophenotypes, at de studerende.

I de seneste år, er PiggyBac transposon system blevet brugt til at opnå stabile udtryk af transgener i en række systemer. Vi har brugt dette system til hurtigt og nemt for at oprette stabilt udtrykker doxycyclin-inducerbar miRNA konstruktioner for at studere rollen af bestemte gener under interneuron udvikling. Vi er også ved hjælp af denne teknologi til at oprette dual reporter mESC linjer, der udtrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) til optogenetically drev mESC stammer interneurons eller DREADD receptor teknologi til at aktivere eller deaktivere transplanterede celler massevis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Qing Xu for at udvikle Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual reporter mESC linje som Jennifer Tyson, Asif Maroof og Tim Petros for deres tidlige arbejde på at udvikle denne protokol. Vi takker også CHOP flow flowcytometri kerne for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en NIH R01 MH066912 (SA) og F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 130 hjernen mus interneuron differentiering cortex cellekultur stamceller transplantation
Differentiering af musen embryonale stamceller i kortikale Interneuron prækursorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter