Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Abstract

GABAergic corticale interneuronen zijn een heterogene populatie van cellen die spelen een kritieke rol in de uitvoer van excitatory piramidale neuronen reguleren, alsmede het synchroniseren van de uitgangen van de piramidale neuron ensembles. Tekorten in interneuron functie zijn betrokken bij allerlei neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder schizofrenie, autisme en epilepsie. De afleiding van corticale interneuronen vanaf embryonale stamcellen niet alleen voorziet in de studie van hun ontwikkeling en functie, maar verschaft inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van corticale interneuron-gerelateerde aandoeningen. Interneuronen ook de opmerkelijke capaciteit hebben om te overleven, migreren en integreren van host corticale circuits na transplantatie, waardoor ze ideale kandidaten voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën. Hier presenteren we een schaalbare, uiterst efficiënte, bewerkt, embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde-methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van muis embryonale stamcellen (mESCs). De opdrachtregel Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC, kunnen Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen worden geïsoleerd via fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. We bieden ook methoden om te verrijken voor parvalbumin (PV) of Somatostatine (SST) interneuron subgroepen, die nuttig kan zijn voor het bestuderen van aspecten van lot bepaling of voor gebruik in therapeutische toepassingen die van interneuron deelgroep profiteren zouden-verrijkt transplantatiecentra.

Introduction

In zowel mens als muizen, ongeveer de helft van alle corticale remmende interneuronen (CIns) hun oorsprong vinden binnen een voorbijgaande subcorticale structuur die bekend staat als de mediale ganglionaire eminentie (MGE), waar de neuroepithelial progenitorcellen van CIns en andere neuronale en gliale subgroepen express de transcriptiefactor Nkx2.11,2. CIn subgroepen of subtypen worden gedefinieerd door de doorsnede van de morfologische, neurochemical, elektrofysiologische en connectiviteit kenmerken3,4. De CIns MGE-afgeleid kunnen worden gegroepeerd in meestal niet-overlappende subgroepen op basis van hun uitdrukking van PV of SST, de uitdrukking van welke correlaten met name elektrofysiologische en connectiviteit tendensen5. Dysfunctie van interneuronen, vooral die in de PV deelgroep, heeft betrokken bij meerdere neuropsychiatrische stoornissen en ziekten6,7. Het algemene doel van deze methode is mitotische progenitoren stamcel-afgeleide en trekkende precursoren verrijkt voor PV of SST CIn lot voor de studie van biologie van de corticale interneuron en voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën te produceren.

We hebben een schaalbare, uiterst efficiënte methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van mESCs ontwikkeld. Met behulp van een Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC lijn8, Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen kunnen worden geïsoleerd via FACS en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. Door het manipuleren van een aantal signaalroutes, duur van de cultuur, en de wijze van neurogenese, kunnen we miljoenen fluorescently geëtiketteerde interneuron precursoren geschikt voor tal van downstream toepassingen.

Hoewel er verschillende andere methoden bestaan voor het genereren van MGE-achtige voorlopercellen van mESCs9,10,11,12,13,14, onze werkwijze, die gebaseerd op de Wnt is antagonist XAV-939, is bijzonder efficiënt op het genereren van Foxg1/Nkx2.1 mede uiting van telencephalic voorlopercellen. Daarnaast verbetert de mogelijkheid om te kiezen voor interneuron progenitoren of hun post mitotische Lhx6-uiten nageslacht via ons systeem van de dubbele verslaggever, sterk het vermogen om verschillende progenitoren en hun nakomelingen te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: De dubbele verslaggever mESC regel beschreven in dit protocol is beschikbaar op verzoek (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media voorbereiding

Opmerking: Warm alle media tot 37 ° C vóór gebruik in celkweek.

  1. Muis embryonale Fibroblast (MEF) media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Meng 50 mL foetale runderserum (FBS) 449 mL Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM), en filter via een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Opslaan van de media bij 4 ° C voor maximaal 1 maand of aliquot en opslag bij ≤-20 ° C.
  2. N2 media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Voeg 5 mL L-alanine-L-glutamine (100 x) en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) tot 489.5 mL DMEM: nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12), en filter via een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) en 5 mL N2 supplement-B na filtratie. Bewaar de media bij 4 ° C in het donker voor maximaal 1 maand.
  3. Serumvrij groeimedium (KSR) (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Voeg 75 mL serumvrij middellange supplement, 5 mL L-glutamine (100 x), 5 mL MEM niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA) (100 x), en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) aan 413.5 mL niet-glutamine met DMEM en filtreer door een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Bewaar de media bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  4. Muis embryonale stamcellen media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Toevoegen van 75 mL stamcel rang FBS, 5 mL MEM-NEAA (100 x), 5 mL L-glutamine (100 x), en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) aan 413.5 mL niet-glutamine met DMEM en filtreer door een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Opslaan van de media bij 4 ° C in het donker voor maximaal 1 maand of aliquot en opslag bij ≤-20 ° C.

2. het kweken van mESCs

  1. Plaat mitotically inactieve MEF feeder cellen in MEF media op Weefselkweek behandeld platen op 3-4 x 104 cellen/cm2. Ten minste 12 uur voor hen te vestigen in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voordat plating de mESCs toestaan. Als niet onmiddellijk wordt gebruikt, vervangt u de MEF media om de 3 dagen. Beschikken over MEFs als niet binnen 7 dagen van plating gebruikt.
  2. MESCs (dichtheid variëren van 1-4 x 104 cellen/cm2) toevoegen aan MEF platen in mESC media met muis leukemie remmende Factor (mLIF) (1000 U/mL). Incubeer de cellen bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
  3. Passage van mESCs met behulp van trypsine-EDTA (0.05% trypsine) (1:5-1:10) zodra de schotel wordt ~ 70-80% heuvels of als de kolonies beginnen te raken. Dit meestal optreedt om de 2 dagen, maar kan duren tot 4 of 5 dagen afhankelijk van de dichtheid van de initiële beplating.
  4. Het handhaven van de mESCs op een MEF feeder laag in mESC medium te houden pluripotent.
  5. Voordat u begint differentiatie, passage de cellen ten minste eenmaal op gelatine gecoate platen zonder MEFs om te verdunnen uit de MEFs.
    1. Bereid gelatine gecoate platen door toevoeging van 0,1% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2 +/Mg2 + aan een schotel Weefselkweek behandeld en verlaten bij 37 ° C gedurende ten minste 1 h. plaat 1.5-2 x 106 cellen/10 cm plaat (2.7-3.6 x 104 cellen/cm2) en de cellen uit te breiden voor 2 dagen voor het begin van differentiatie toestaan.

3. differentiëren mESCs richting MGE-achtige van Telencephalic voorlopercellen

  1. Differentiatie dag (DD) 0 = "float cellen"
    1. Nadat de mESCs zijn gegroeid op gelatine gecoate platen voor 2 dagen, de media gecombineerd en wassen van de cellen een keer met PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Voeg genoeg trypsine-EDTA (0.05% trypsine) om de dekking van het oppervlak van de plaat (meestal 4 mL trypsine-EDTA voor een 10 cm weefselkweek schotel) en plaats de cellen terug in de incubator bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voor 4 min.
    2. Na 4 min., doven de trypsine-EDTA 2 maal het volume met mESC media. De cellen overbrengen in een gepaste afmetingen centrifugebuis samen en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Na 5 min, verwijdert u de buis en gecombineerd de media zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 1 mL KSR:N2 media (1:1) met de BMP-remmer LDN-193189 (250 nM) en de Wnt remmer XAV-939 (10 µM).
    3. Het meten van de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Start cellen groeien als embryoid organen (EBs) door toevoeging van 75.000 cellen/mL in KSR:N2 media (1:1) met LDN-193189 (250 nM) en XAV-939 (10 µM) in niet-aanhanger weefselkweek gerechten. Incubeer de cellen bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
  2. Bereiden op DD1, voor "landing" door coating Weefselkweek behandeld gerechten met poly-L-lysine (10 µg/mL in PBS met Ca2 +/Mg2 +) 's nachts cel (O/N) bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid of voor ten minste 1 uur.
  3. Op DD2, gecombineerd de poly-L-lysine en jas de platen met laminin (10 µg Fe/mL in PBS met Ca2 +/Mg2 +) O/N bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid.
    Opmerking: Terwijl O/N optimaal, zo weinig is 2 h kan volstaan. Als de platen worden niet gebruikt door de volgende dag, gecombineerd laminin vervangen door PBS zonder Ca2 +/Mg2 +en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
  4. DD3 ("het land van cellen")
    1. Voordat u begint EB dissociatie, gecombineerd de laminin en laat de platen helemaal droog in de kap van een weefselkweek. Gebruik geen platen die glanzende of zichtbaar natte verschijnen. Breng de EBs met media in een tube van 15 mL en centrifuge voor 3-4 min op 15 x g of totdat de EBs hebben Ingehuld.
  5. De media gecombineerd en voeg 3 mL cell detachement oplossing met DNase (2 U/mL) en Incubeer bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en de buis elke 3 min 5% CO2 voor 15 min. zachtjes flick om te helpen bij EB dissociatie.
  6. Zodra de EBs zijn niet meer zichtbaar of 15 minuten zijn verstreken, toevoegen 6 mL KSR:N2 (1:1) met DNase (1 U/mL) en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
  7. Plaat van de cellen in de KSR:N2 (1:1) met LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 µM), en de Y-27632 van de ROCK-remmer (10 µM) op 4.5-5 x 104 cellen/cm2.

4. SST-verrijken Protocol: "DD12 GFP hoge Sonic Hedgehog (SHH)" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en SSH (50 ng/mL).
  2. Weefselkweek platen voorbereiden opnieuw plating op dag 8 (stap 4.4) met behulp van de aanwijzingen in stap 3.2-3.3.
  3. Wijzig op DD7, media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en SHH (50 ng/mL).
  4. Op DD8, plaat opnieuw de cellen.
    Opmerking: Terwijl deze stap niet noodzakelijk is, opnieuw plating de cellen kan verminderen vroeg-gesplitste, ongewenste celtypes. Opnieuw plating ook breekt ballen van cellen die stroomafwaarts immunohistochemische analyses te bemoeilijken, en verhoogt de efficiency van FACS op latere tijdstippen.
    1. Opnieuw plaat cellen, loskoppelen van de cellen van de plaat met trypsine-EDTA (0.05% trypsine) gedurende 5 minuten bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2. Doven van de trypsine-EDTA 2 maal het volume met KSR:N2 en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. filtert de cellen door een buis 40 µm filter om eventuele klontjes. Opnieuw plaat de cellen op 250.000 cellen/cm2 in N2/KSR (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en Y-27632 (10 µM) met SHH (50 ng/mL).
      Opmerking: Als in plaats daarvan, de beslissing wordt genomen niet om opnieuw de cellen in de DD8 plaat, wijzigt u de media met KSR:N2 met SHH (50 ng/mL) elke 2 dagen vanaf DD7 tot DD12 en blijven toevoegen van IGF-1 (20 ng/mL) en FGF-2 (10 ng/mL) tot DD9.
  5. Op DD10, veranderen de media met KSR:N2 met SHH (50 ng/mL).
  6. Op DD12, voor het verkrijgen van cellen die zijn verrijkt voor SST subtypen, gebruiken FACS te isoleren van de Lhx6::GFP-slechts uiting geven aan de cellen.
    1. Als u wilt loskoppelen van de cellen, gebruiken in een niet-trypsine bevat cel-dissociatie reagens in plaats van trypsine-EDTA. Wassen cellen een keer met PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Toevoegen van voorverwarmde niet-trypsine bevat cel-dissociatie reagens met DNase (2 U/mL) aan de cellen. Plaats ze in de incubator bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voor 10-30 min of totdat de cellen hebben losgemaakt. Tik zachtjes op de platen elke 5 min om te helpen de dissociatie.
      Opmerking: Voor DD11-12 culturen, slechts 10-15 min kan noodzakelijk zijn. Voor DD15-16 culturen, kan 30 min of meer worden verlangd voor volledige dissociatie.
    2. Zodra de cellen hebben volledig aan de plaat getild, gaan met FACS isolatie gebruikt standaard protocollen of gebruiken van de cellen in andere stroomafwaartse analyses.

5. PV-verrijken Protocol: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Weefselkweek platen voorbereiden opnieuw plating op DD8 3.2-3.3 (stap 4.4) met behulp van de instructies beschreven in stappen.
  3. Wijzig op DD7, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Op DD8, plaat opnieuw de cellen zoals beschreven in stap 4.4 met de volgende uitzonderingen: wanneer opnieuw plating de cellen, vervangen SHH egaliseren agonist (SAG; 30 nM) en atypische PKC-remmer (aPKCi; 2 µM) toe te voegen. Samen genomen, de opnieuw identificatietekens media is nu N2/KSR (1:1) bevattende FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), en aPKCi (2 µM).
  5. Op DD10, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen.
  6. DD11
    Opmerking: op dit punt, Nkx2.1::mCherry+ cellen zijn verrijkt om PV CIns.
    1. Loskoppelen van de cellen van de plaat voor FACS met behulp van hetzelfde protocol beschreven in stap 4.6. Als de beslissing wordt genomen om te verzamelen van Nkx2.1::mCherry+ cellen op een latere dag van differentiatie, negeren deze stap.
  7. Op DD12, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD14, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD16, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD17, verzamelen de cellen van de Nkx2.1::mCherry+ met behulp van hetzelfde protocol beschreven in stap 4.6.

6. PV-verrijken Protocol: "DD17 mCherry laag SHH" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL). Wijzig op DD7, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Wijzig op DD9, de media met KSR:N2 (1:1). Vanaf dit punt verder zijn geen extra groeifactoren nodig.
    1. Blijven veranderen de media om de 2 dagen tot het oogsten van de cellen op DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol beschreven in dit document is een gewijzigde versie van onze gepubliceerde protocollen15,16,17 en is geoptimaliseerd voor gebruik met onze Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC lijn. Door het toevoegen van de Wnt-remmer XAV-939 van DD0-5, gecombineerd met het opnieuw plating op DD8, bereiken wij robuuste Nkx2.1 inductie, waarin meer dan 50% van alle DAPI + kernen in cultuur ook Nkx2.1 (figuur 1A, B uitdrukken zijn). Immunohistochemistry voor de mCherry en GFP verslaggevers toont duidelijke uitdrukking binnen regio's van de Nkx2.1-positieve immunoreactivity (figuur 1A). FACS van levende cellen met behulp van de inheemse verslaggever blijkt dat vier populaties van cellen duidelijk geïsoleerd worden kunnen: (1) GFP/mCherry dubbel negatief cellen, (2) mCherry-alleen uiting van cellen, (3) GFP-alleen waarin cellen en (4) GFP/mCherry dubbel-uiten cellen ( Figuur 1 c). Met behulp van deze regel, begint een klein deel van de progenitoren de verslaggever van de mCherry rond DD8-9 inschakelen. De niveaus van de mCherry piek tussen DD12-13 en vervolgens gestaag dalen zoals progenitoren afsluiten van de celcyclus en na mitotische Lhx6::GFP + interneuron precursoren (Figuur 1 d produceren). Dienovereenkomstig, de verslaggever van de Lhx6::GFP Hiermee schakelt u tussen de DD9-10 en pieken rond DD13-14 (Figuur 1 d). Hoewel het totale aantal Lhx6::GFP cellen toenemen in de cultuur blijft, het percentage niet, waarschijnlijk als gevolg van de verspreiding van andere geslachten. Eenmaal de Lhx6::GFP + verslaggever spreekt, het nog waarneembaar voor onbepaalde tijd aangezien Lhx6 stabiel wordt uitgedrukt in volwassen MGE afkomstige corticale interneuronen18,19. Hoewel Nkx2.1 en Lhx6 expressie zijn grotendeels niet-overlappende binnen de lymfkliertest reukkolf, is er een voorbijgaande bevolking van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP samen het uitdrukken van cellen in cultuur. Dit is op zijn minst deels te wijten aan perdurance van de verslaggever van de mCherry buiten de normale termijn van Nkx2.1 expressie, zoals de meeste van de double-gelabeld cellen doen niet express detecteerbare niveaus van Nkx2.1 eiwit (Tyson en Anderson, onuitgegeven). Cellen blijven express zowel de verslaggever van de Lhx6 en Cherry/Nkx2.1 eiwit mogelijk striatale interneuronen20. Op basis van onze levende imaging studies, er is echter een venster van ongeveer 18 h waarin synchrone, pas na mitotische precursoren uiting van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP geïsoleerd worden kunnen (Tischfield Anderson, ongepubliceerde en zie Tischfield et al. 17). door het verzamelen van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP dubbele positieve cellen op elk gewenst moment tijdens het protocol, het is dus mogelijk om een bevolking van cellen die overwegend de celcyclus binnen ongeveer 18 h van elkaar hebben verlaten. Dit is in tegenstelling tot Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP-slechts uiting geven aan de cellen, die staan voor verschillende typen van voorlopercellen en precursoren, respectievelijk, van verschillende geboortedata.

De Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC lijn kan worden gebruikt om te verrijken voor SST-gedoemd interneuronen. In het algemeen, SHH toe te voegen aan de culturen en het verzamelen van GFP + cellen op vroegere tijdstippen in de differentiatie (bijvoorbeeldDD12) verrijkt voor SST subtypen. Gebaseerd op onze observaties, we hebben niet gezien een significant verschil in de verhouding van de SST:PV afhankelijk van of SHH wordt toegevoegd aan DD5 of DD8 (gegevens niet worden weergegeven). Door SHH toe te voegen (50 ng/mL) op DD8-12 en daarna transplanteren het GFP-alleen waarin cellen, krijgen wij gemiddeld een 7:1-verhouding van SST:PV CIns (figuur 2A)15,17. Zie voor meer informatie over de effecten van SHH en tijd in cultuur op interneuron lot met behulp van onze dual-reporter mESC lijn, Tyson et al. 15

Om te verrijken voor PV-gedoemd CIns, moet SHH worden weggelaten uit de cultuur-media. Van de nota, conform de eis van SHH signalering te handhaven Nkx2.1 expressie in mitotische progenitoren21, SHH signalering bestaat in deze culturen zonder exogene SHH wordt toegevoegd sinds de signalering antagonist cyclopamine elimineert SHH Nkx2.1 expressie15. Echter, als de cellen opnieuw vergulde op DD8 worden, deze endogene SHH is verwijderd, bijvoorbeeld dat SAG (30 nM) moet worden toegevoegd aan de media DD8-10 Nkx2.1 expressie en de productie van CIns te handhaven. Onze vorige studie bleek dat door inhouding van SHH uit de kweekomstandigheden en sorteren voor Nkx2.1::mCherry+ cellen op DD17, een ~2.6:1 ratio van PV:SST cellen kan worden verkregen (figuur 2B),15. In tegenstelling tot SST subtypes, die zijn verrijkt in eerdere stadia en in aanwezigheid van exogene SHH, verhoogd duur in cultuur en gebrek aan exogene SHH verrijkt voor PV subtypen15. In een meer recente studie vonden we dat aPKCi toegepast op onze "MGE" protocol aanzienlijk verhoogt de breuk van Nkx2.1::mCherry voorlopercellen dat cycline D217, een marker van tussenliggende voorlopercellen cellen22express. Dit protocol variatie was gebaseerd op onze bevinding die PV-uiten CIns afkomstig voornamelijk van tussenliggende progenitorcellen zijn, terwijl SST progenitoren vandaan voornamelijk radiale progenitorcellen bij de ventriculaire oppervlak23. We hebben vastgesteld dat wanneer gesorteerd en in neonatale muis neocortex getransplanteerd, deze progenitoren sterk zijn bevooroordeeld voor de productie van PV-subtypen. Door toevoeging van aPKCi van DD8-11 en vervolgens sorteren Nkx2.1::mCherry cellen, konden we krijgen een 5.8:1 ratio van PV:SST subtypen (figuur 2C)17. Als u wilt verder verrijken voor PV subtypen, hebben we ook Nkx2.1::mCherry cellen gekweekt in aanwezigheid van aPCKi van DD8-17 geïsoleerd. Echter deden we een toename van de PV:SST verhouding dan wat we konden krijgen op DD11, ondanks een marginale verhoging van het percentage van PV subtypen gegenereerd (figuur 2D) niet bereiken. Stroomdiagrammen voor elk van deze protocollen zijn opgenomen in Figuur 3. Immunokleuring van muis hersenen 30 dagen na transplantatie met anti-PV, anti-SST en anti-GFP (om de identificatie van Lhx6::GFP + cellen) antistoffen toont aan dat Lhx6::GFP + cellen vertonen volwassen morfologische kenmerken met patronen van PV and SST-expressie verwant aan hun in vivo tegenhangers (Figuur 4 en Figuur 5).

Om te helpen bij het bepalen of een CIn differentiatie wordt succesvol weergegeven, hebben wij een reeks beelden in elk stadium van het protocol bij het tonen van normale variabiliteit (Figuur 6, Figuur 7, , Figuur 8). Wij omvatten ook een figuur aan te tonen hoe een mislukte differentiatie op DD4 verschijnt (Figuur 9). Mislukte differentiaties levert in het algemeen lage niveaus (minder dan 10%) van Nkx2.1 expressie en percentages van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP inductie van ongeveer 1% of minder.

Figure 1
Figuur 1: generatie van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP interneuron precursoren. (A) getoond hier zijn beelden van de vertegenwoordiger van immunokleuring voor Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) en Lhx6::GFP (GFP) uit een differentiatie dag 12 (DD12) cultuur. Merk op dat deze beelden zijn overlappende kanalen van het hetzelfde gezichtsveld. (B) kwantificering van het gemiddelde percentage van de DAPI + kernen die uitdrukking geven aan Nkx2.1 op DD12 in cultuur (n = 3 onafhankelijke differentiaties). (C) vertegenwoordiger FACS plot demonstreren de vier andere cel populaties die kunnen worden afgezonderd met behulp van onze dubbele verslaggever mESC lijn. Merk op dat mCherry op de x-as en GFP op de y-as is. Dus, het bovenste vak rechts cellen voorstelt die mCherry/GFP-double positief zijn. (D) tijdsverloop van Nkx2.1::mCherry en Lhx6::GFP inductie van DD6-16, uitgedrukt als het percentage van cellen in een cultuur die zijn alleen-mCherry uiten, GFP-alleen uitdrukken, of mCherry/GFP mede uitdrukken. Deze percentages zijn verkregen uit cellen gekweekt in aanwezigheid van SHH tijdens een protocol SST-verrijken en vertegenwoordigen gemiddelden van 3 onafhankelijke differentiaties. Foutbalken in (B) en (D) vertegenwoordigen SEM. schaal bar = 150 µm (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: manipulatie van kweekomstandigheden differentieel verrijkt voor PV-versus SST-gedoemd mESC afgeleid corticale interneuronen. (A) Percentage van PV +, SST + en PV- / SST-interneuronen verkregen wanneer DD12, dit is een alleen-GFP waarin cellen gekweekt in het bijzijn van SHH (50 ng/mL) van DD5-12 in neonatale neocortex worden getransplanteerd en geanalyseerd van 30 dagen na transplantatie. (B) Percentage van PV +, SST + en PV- / SST-interneuronen verkregen bij DD17, dit is een alleen-mCherry uiten geteeld cellen zonder aanvullende SHH worden getransplanteerd in neonatale neocortex en geanalyseerd van 30 dagen na transplantatie. (C) Percentage van PV +, SST + en PV- / SST-interneuronen verkregen wanneer DD11, dit is een alleen-mCherry waarin cellen gekweekt in het bijzijn van SAG (30 nM; DD8-10) en aPKCi (2 µM; DD8-11) in neonatale neocortex worden getransplanteerd en geanalyseerd van 30 dagen na transplantatie. (D) Percentage van PV +, SST + en PV- / SST-interneuronen verkregen wanneer DD17, dit is een alleen-mCherry waarin cellen gekweekt in het bijzijn van SAG (30 nM) van de DD8-10 en aPKCi (2 µM) van DD8-17 in neonatale neocortex worden getransplanteerd en geanalyseerd van 30 dagen na transplantatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: ter illustratie van de verschillende PV - en SST-verrijken protocollen beschreven in deze studie stroomdiagrammen. (A) voor alle protocollen, de stappen die leiden tot het begin van de differentiatie met inbegrip van DD0-5 zijn identiek. Alle cellen worden gekweekt als embryoid lichamen uit DD0-3 in N2:KSR (1:1) aangevuld met de BMP-remmer LDN-193189 en de Wnt remmer XAV-939. Op de DD3, worden de cellen "gelost" in N2:KSR (1:1) met LDN-193189, XAV-939 en de ROCK-remmer Y-27632. Om te verrijken voor SST-subtypen, wordt SHH vanuit DD5-12 toegevoegd. Anderzijds is SHH toegevoegd van DD8-12 omdat, in onze ervaring, de toevoeging van SHH uit DD5 versus DD8 vanaf geen aanzienlijk invloed heeft de verhouding van PV:SST subtypen gegenereerd. Eerdere versies van het protocol (Zie Tyson et al.. 15) deed een opnieuw identificatietekens stap op DD8 niet nemen en in plaats daarvan de media met exogene SHH op DD5 aangevuld. Dit protocol werd later veranderd om op te nemen een opnieuw identificatietekens stap op DD8 samen met de invoering van SHH, die geen van beide aanzienlijk de PV:SST verhouding veranderen. In dit protocol "high-SHH" zijn Lhx6::GFP + cellen gekweekt in het bijzijn van exogene SHH FACS geïsoleerd op DD12 voor gebruik in downstream toepassingen. (B) voor de "lage-SHH" PV-protocol, exogene SHH evenals de opnieuw identificatietekens stap op DD8 worden weggelaten. In plaats daarvan, Nkx2.1::mCherry+ cellen zijn FACS geïsoleerd op DD17 voor gebruik in downstream toepassingen. (C) voor de "+ aPKCi" PV protocol, aPKCi samen met SAG vanuit DD8-10 wordt toegevoegd en alleen aPKCi verder uit DD10 is toegevoegd. Op DD11 of DD17 zijn Nkx2.1::mCherry cellen FACS geïsoleerd voor gebruik in downstream toepassingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: PV en SST immunokleuring in Lhx6::GFP + cellen 30 dagen na transplantatie in neonatale neocortex. (A) krachtige afbeelding van een SST-uiten, Lhx6::GFP + cel 30 dagen na transplantatie in neonatale neocortex. In elke kolom van vier beelden zijn enkellijns beelden van Lhx6::GFP, PV en SST expressie met een 3-kanaals samengevoegde afbeelding aan de onderkant. Zoals getoond in het bovenste netdeel, werkt deze neuron Lhx6::GFP + meerdere processen suggestief voor een volwassen morfologie. (B) krachtige afbeelding van twee PV-uiten, Lhx6::GFP + cellen 30 dagen na transplantatie. (C) High power image van een SST- / PV-double negatieve, Lhx6::GFP + cell. Hoewel deze cel wordt ingegaan op meerdere processen consistent met volledige differentiatie en corticale integratie, wordt deze cel niet duidelijk uitdrukken PV of SST. Merk op dat er een PV + nucleus grenzend aan de Lhx6::GFP + cell is maar dat het niet overlapt. Schaal bars = 50 µm (A-C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Medium en low power beelden van PV, SST en Lhx6::GFP eiwit expressie 30 dagen na transplantatie in neonatale neocortex. (A) middellange macht beeld van een regio van muis neocortex met 30 Lhx6::GFP + cellen 30 dagen na transplantatie. Deze cellen werden gekweekt met behulp van de PV-protocol (+ aPKCi van DD8-11; FACS isoleren en transplantatie Nkx2.1::mCherry+ op DD11). Van de 30 cellen hier te zien, 16 express PV, 4 express SST en 10 express PV noch SST. (B) energiebesparende beeld van een regio van muis neocortex met talrijke, goed gedifferentieerde Lhx6::GFP + cellen 30 dagen na transplantatie. Opmerking de overvloed van Lhx6::GFP + processen dwars in de cortex. Occasionele cellen zijn ook gevonden in de hippocampus, waar ze lijken te integreren en uit processen consistent met een volwassen fenotype te werken. Schaal bar = 50 µm (A); 550 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: normale weergave van muis embryonale fibroblast feeder laag en ongedifferentieerde stamcellen. (A) getoond hier zijn 4 X en 10 X vergroting helderveld beelden tonen de typische uitstraling van onze muis embryonale fibroblast (MEF) feeder lagen 24u na beplating. (B) hier wordt de typische uitstraling van onze muis embryonale stamcellen (mESCs) 2 dagen na beplating op MEF feeders komt te staan. Merk op dat de koloniën een heldere omtrek hebben en elliptische of eivormige in verschijning zijn. Als de kolonies deze heldere omtrek verliest of beginnen met het verzenden van de naar buiten uitstekende delen, zijn dit tekenen dat de cellen kunnen worden onderscheiden. (C) getoond hier zijn mESCs 1 en 2 dagen na opnieuw plating op gelatine gecoat gerechten om te verdunnen uit MEF feeders voorafgaand aan het begin van differentiatie. Merk op dat de stamcellen aanzienlijk na 48u op gelatine breiden en beginnen te opnieuw ophalen een eivormige uitstraling met een lichte omtrek. Schaal bar = 100 µm in 4 X en 10 X foto's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: verschijning van muis embryonale stamcellen op differentiatie dagen 1 t/m 7. (A) een dag na de drijvende, de stam cellen kunnen worden gezien die kleine embryoid organen (EBs). Door dag twee de EBs aanzienlijk gegroeid. Merk op dat sommige EBs hebben elkaar geplakt en grotere clusters van cellen gevormd. Wij vinden niet dat dit een negatieve invloed de differentiatie. Na 3 dagen, de EBs hebben zelfs groter geworden en sommige niet langer licht door hen doorgeven. Het is normaal dat cel puin in de achtergrond. (B) getoond hier zijn de cellen van de stam 24 uur na de landing op differentiatie dag 4 (DD4). Opmerking de dichtheid van de cellen. Velen zijn begonnen om uit te breiden van kleine processen, die toenemen zal naarmate de differentiatie blijft. Opmerking hier dat de cellen nog zijn gekleurd met kleine zwarte stippen, verspreid over. Als de cellen zijn glanzend of homogene verschijnen, is dat een teken van afwijkende differentiatie. (C) door DD5, de cellen blijven vermenigvuldigen en neurale rozetten vormen. Veel cellen hebben lange, dunne processen uitgebreid. (D) door DD7, de cellen moeten worden confluente. Het is normaal om te zien een patroon van de "Swiss-kaas", waarin grote, platte, multinucleaire cellen (eventueel Ependymale of gliacellen) circulaire eilanden binnen een laag van neurale voorlopercellen maken. Af en toe doet wanneer de celdichtheid hoger is dan normaal, dit patroon van de "Swiss-kaas" niet ontwikkelen, zoals in de middelste afbeelding. Afhankelijk van de differentiatie, kan dit van invloed zijn op neurale inductie. 4 x en 10 x geven de vergroting. Schaal bar = 100 µm in 4 X en 10 X foto's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: verschijning van differentiatie op dagen 9 tot en met 14. (A) afzonderlijke cellen kunnen worden gevisualiseerd één dag na het opnieuw plating. Let op de bipolaire vormgeving, die typisch is voor neurale progenitoren. De cultuur is homogene met enkele andere infiltrating celtypes. De dichtheid is geschikt voor deze fase. (B) door DD11, de cellen uitgegroeid tot een enkelgelaagde. Vergelijkbaar met eerdere stadia bij de differentiatie, grote "ei-achtige" multi genucleëerde cellen kunnen gezien worden afgewisseld door. (C) door DD13 die de cellen nog steeds te vermenigvuldigen. Ze kunnen nu worden gezien vormen van kleine heuvels. Vele "ei-achtige" cellen zijn nog steeds aanwezig. Vanaf dit punt verder, de cultuur zal alleen een paar wijzigingen weergegeven, met uitzondering van de terpen groeien groter. 4 X, 10Xx, en 20 X geven de vergroting. Schaal bar = 100 µm in 4 X en 10 X foto's, en schaal bar = 50 µm in 20 X foto's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: verschijning van een mislukte differentiatie op dag 4. DD4 is belangrijk op het gebied van de evaluatie van het succes van een differentiatie, omdat hieruit een van de moeilijkste stappen van het protocol volgt: de landing op de DD3. Door DD4 hebben de cellen 24u te herstellen na wordt losgekoppeld van embryoid instanties. Zoals hier te zien, zijn de meeste van de cellen glanzend en homogene verschijnen. Afgewisseld door zijn incidenteel cellen die normaal verschijnen, een donkere uitstraling met kleine zwarte stippen, verspreid over. Bovendien, zijn grote platte cellen (zoals kunnen worden gezien in de onderste linker paneel) indicatief voor afwijkende differentiatie. In het rechterpaneel onder weergegeven ten minste drie groepjes van cellen (gele pijlen) als kleine embryoid lichamen, die aangeeft of defecte differentiatie, onvolledige EB dissociatie of slechte hechting aan het oppervlak van de cel cultuur plaat. Deze beelden zijn in tegenstelling tot die worden weergegeven in figuur 7B, die verbeelden gezonde, normale cellen op DD4 verschijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel deze methode is zeer effectief bij patronen J1-afgeleide mESCs (SCRC-1010), hebben we ervaren variabele succes met andere mESC lijnen en klonen isolaten. Bijvoorbeeld, Foxg1::venus mESCs (EB3-afgeleid; Danjo et al. 13) reageren slecht bij dit protocol en de Foxg1 inductie door DD12 is meestal over de volgorde van 1-2%. Om redenen die wij niet volledig begrijpen, produceert een andere Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever kloon (zogenaamde JQ59) dat werd geïsoleerd gelijktijdig als de regel wordt beschreven in dit protocol (zogenaamde JQ27), minder dan 1% Nkx2.1-uiten cellen als volwassen onder identieke omstandigheden. De bovenliggende lijn (J1; ATCC SCRC-1010), maar reageert goed op dit protocol en produceert percentages van Nkx2.1-uiten cellen op DD12 vergelijkbaar zijn met die wordt weergegeven in figuur 1B. Indien nodig, kunnen de concentraties van XAV-939 en SHH/SAG worden aangepast voor het optimaliseren van de voorwaarden van de differentiatie op basis van de regel voor regel. Onze ervaring met behulp van dit protocol om te onderscheiden van andere mESC lijnen in MGE-achtige progenitoren is echter beperkt.

Niet alle Nkx2.1 + cellen uiten met betrekking tot onze Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC lijn, mCherry. Hoewel bijna alle mCherry + cellen express Nkx2.1 eiwit, achterblijft verslaggever expressie bij Nkx2.1 eiwit expressie, met name tijdens de vroege stadia van de differentiatie (DD7-9). De Fractie van de Nkx2.1 + cellen die uitdrukking geven aan mCherry gestaag toeneemt in de loop van de differentiatie. Op piek niveaus (~ DD12-14) mCherry wordt uitgedrukt in ongeveer 30% van alle Nkx2.1 uiten van progenitoren17. Bovendien, is het dezelfde bacteriële kunstmatig chromosoom gebruikt op station mCherry expressie gebruikt om te rijden van Cre recombinase in Nkx2.1-expressie domeinen van transgene muizen24. In deze muizen, Cre-expressie was zwak binnen Nkx2.1-uiten cellen van de dorsale meest-regio van de MGE en lot-mapping met deze muis leek te geringe label SST-uiten CIns waarvan bekend is dat het grotendeels worden gegenereerd uit deze regio25, 26,27,28. Ondanks deze verschillen, kunnen miljoenen GFP of uiting van mCherry cellen echter geïsoleerd met slechts een paar uur van FACS.

Er zijn twee belangrijkste voordelen van deze techniek. Eerst, wanneer gecombineerd met onze Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC lijn, het is mogelijk om grote aantallen interneuron precursoren verrijkt om PV of SST-gedoemd corticale interneuron subtypen. Het tweede grote voordeel is het relatieve gemak met die grote aantallen interneuron gedoemd cellen kunnen worden verkregen. Hoewel verschillende andere gewijzigde EB technieken bestaan om te differentiëren MGE progenitoren en neuronen, afhankelijk deze protocollen meestal van het gebruik van de Wnt-remmende molecules zoals Dkk113,14,29. We hebben vastgesteld dat de Wnt remmer XAV-939 sterk de generatie van pallidal telencephalic progenitorcellen verbetert, zoals blijkt uit de Foxg1 en Nkx2.1 expressie15.

Zoals eerder vermeld, bestaan er verschillende andere methoden voor het genereren van MGE-achtige voorlopercellen van mESCs. Watanabe et al. 14 pionier op het gebied van differentiatie van de telencephalic van mESCs door als eerste een serumvrij schorsing cultuur methode gevolgd door opnieuw plating op een aanhangend oppervlak te ontwikkelen. Zij vonden dat de Wnt en de Nodal antagonisten, Dkk1 en LeftyA, respectievelijk, efficiënt reed mESCs in de vroege neuroectodermal lineages13. Door SHH toe te passen aan deze culturen, zij opgemerkt dat tussen 5-15% van alle cellen in cultuur samen uitgesproken Nkx2.1/Foxg1 en kunnen worden beschouwd als MGE-achtige progenitoren13. Echter, tijdens het leggen van de basis voor vele studies te komen, deze studie had geen een manier om te isoleren MGE progenitoren of verrijken voor bepaalde CIn subtypen.

Enkele jaren later Danjo et al. 13 gebruikt dezelfde serumvrij schorsing cultuur methode in combinatie met de getimede administratie van verschillende groeifactoren, in bepaalde SHH, om de subregionale specificatie van mESC afkomstige ventrale telencephalic weefsels. De opdrachtregel Foxg1::venus verslaggever, vonden ze dat SHH administratie van DD3-12, na Dkk1 behandeling vielen tussen 45-68% van alle cellen in cultuur uiten de Foxg1::venus verslaggever13. Binnen de Foxg1::venus + bevolking uitgedrukt ongeveer 32% van de cellen Nkx2.113. Door vervanging van SHH voor SAG en toevoeging van Fgf8, versterkt ze de breuk van Nkx2.1 voorlopercellen binnen de bevolking Foxg1::venus + tot en met ongeveer 41%13. Wanneer vehiculumcontrolegroep lot, deze cellen geproduceerd ongeveer 17% SST, 21% PV, 18% NPY en 8% calretinin subtypen13. Echter terwijl deze studie een methode als u wilt opgeven CGE versus MGE afkomstige CIn lot beschreven, beschrijven het niet een methode om selectief verrijken voor PV of SST subtypen.

Het volgende jaar, pas et al. 11 gebruikt een serumvrij enkelgelaagde methode met opnieuw plating op DD5 te bestuderen van het effect van activin op de differentiatie en de identiteit van telencephalic neurale precursoren afgeleid van muis en mens SER's. Hoewel deze studie heeft geen verslag van het percentage van de Nkx2.1 cellen gegenereerd in hun protocol, rapporteren zij dat ongeveer 54% van de cellen in cultuur samen uitgedrukt Nestin/Foxg1 op DD2 (5 dagen van de groei in serum mediagroep gevolgd door een extra 2 dagen van cultuur na opnieuw plating)11. Ook meldden zij dat met de toevoeging van activin, ~ 55% van de cellen samen uitgedrukt nestin en CouptfII, die aangeeft dat deze cellen caudal ganglionaire eminentie-achtige cellen, die de meerderheid van de calretinin-uiten corticale interneuronen produceren kunnen betekenen 11. inderdaad, door 8 dagen in cultuur (13 dagen algemene) 39% van de cellen uitspreken mede calretinin/BIII-tubuline, terwijl 59% van de cellen werden gevonden mede uitspreken GABA/BIII-tubuline11werden gevonden. Deze studie heeft de productie van PV of SST subtypen niet onderzocht.

Weer met behulp van een gemodificeerde EB methode, Chen et al. 12 aangetoond dat MGE-specifieke enhancer elementen kunnen worden gebruikt om te volgen en te zuiveren die zijn afgeleid van de cel van de stam MGE-achtige cellen12. In deze studie, ze ten opzichte van het effect van verschillende kweekomstandigheden tijdens gestuurde differentiaties van mESCs in MGE-achtige progenitoren via een Lhx6::GFP verslaggever lijn; dezelfde regel die als de bovenliggende lijn voor de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter regel beschreven in dit manuscript diende. Zij toonden aan dat door het toevoegen van Dkk1 aan de cultuur voorwaarden van de DD0-3, gevolgd door de toevoeging van SAG, gevolg van ~ 10% van alle cellen in cultuur uitgedrukt Lhx6::GFP12. Zij vond ook dat hetzelfde protocol, toegepast op de lijn van de Foxg1::venus beschreven door Danjo et al. 12, resulteerde in ongeveer 37% van alle cellen, uiting geven aan de verslaggever van de Foxg1::venus. Toen Lhx6::GFP cellen waren getransplanteerde in vivo, de volgende gemiddelde percentages van CIn subtype markers werd waargenomen: 22% PV, SST 58% en 16% NPY12.

Meer recentelijk, andere groepen zijn gewend geraakt de gedwongen expressie van transcriptiefactoren lineage-definiëren rechtstreeks opgeven CIns. Misschien was de eerste demonstratie hiervan door Petros et al. 10 wie doxycycline-afleidbare promotor gebruikt om te rijden Nkx2.1 expressie in Ainv15 mESCs die werden aangepast en bevatten een bacteriële kunstmatig chromosoom Lhx6::GFP. Deze studie gebruikt kweekomstandigheden vergelijkbaar zijn met die in het huidige manuscript, maar zonder de toevoeging van XAV-93910beschreven. Echter, om redenen die slecht worden begrepen, een lager percentage van Lhx6::GFP + cellen werden waargenomen dezelfde voorwaarden differentiatie in vergelijking met toen de J1 Lhx6::GFP bovenliggende opdrachtregel in dit manuscript10beschreven. Ondanks het bereiken van hetzelfde niveau van Foxg1 expressie (totaal onbekende %), was er een gematigde vermindering van het totale aantal Nkx2.1 cellen met niet meer dan 2% van alle cellen, uiting geven aan de Lhx6::GFP verslaggever10. Deze studie belicht de inherente verschillen die bestaan tussen verschillende lijnen van het ESC en de uitdagingen waarmee onderzoekers geconfronteerd wanneer u probeert toe te passen differentiatie protocollen op ESC regels afwijken die werden gebruikt voor oorspronkelijk ontwikkelen de protocollen.

Met behulp van een Au et al. , elegante aanpak 9 de sequentiële gedwongen expressie van transcriptiefactoren gebruikt voor het genereren van specifieke subtypen van corticale interneuronen met behulp van de dezelfde ventrale telencephalic differentiatie paradigma ontwikkeld door Watanabe et al. 14 terwijl ze niet de exacte percentages of Foxg1 +, Nkx2.1 +, Olig2 + precursoren geproduceerd in cultuur aangifte doen, ze staat dat ongeveer 50% van alle cellen in cultuur in GABAergic neuronen9 onderscheiden. Op 11 dagen na differentiatie, waren de EBs losgekoppeld en in de MGE van E13.5 host embryo's9getransplanteerd. Een klein percentage van deze (minder dan 1%) van de MGE gemigreerd naar de cortex, waar ze werden geïdentificeerd door hun Dlx5/6-eGFP verslaggever en geanalyseerd voor lot9. De auteurs waargenomen een verscheidenheid van percentages van PV, SST en CGE-achtige lot gebaseerd op hun gekozen gedwongen inductie strategie9. Interessant is dat met de uitdrukking van de transcriptiefactor Lmo3, ze waargenomen gemiddeld ongeveer 57% PV, SST 21% en 15% CGE afkomstige subtypen (SST- / reeline + of VIP-enige +)9. Het grootste percentage van SST subtypen waargenomen werd verkregen met behulp van een Nkx2.1/Dlx2 GOF lijn, die ongeveer 32% SST, PV van 35% en 25% CGE afkomstige subtypen9geproduceerd.

In 2015, Colasante et al. 30 bleek dat de gedwongen expressie van vijf transcriptiefactoren (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 en Lhx6) binnen de fibroblasten van GAD67-GFP reporter muizen 15% van alle cellen in de GABAergic-achtige CIns omgezet. Opmerkelijk, ongeveer 90% van deze cellen ging express PV, met alleen zeldzame cellen uiten van SST30. Hoewel deze methode niet op mESCs toegepast is, werd het gebruikt met menselijke iPSCs, waar het werd geschat dat ongeveer 30% van alle cellen een GABAergic identiteit30aangenomen.

Zoals blijkt uit Figuur 2, zijn er verschillende manieren voor het genereren van verrijkte populaties van PV of SST CIns. De belangrijkste voordelen van de PV-protocol met behulp van aPKCi via het protocol van DD17 zijn het grotere aantal cellen één kunt isoleren, cel levensvatbaarheid en duur van cultuur. Hoewel we geen gegevens voor DD17 inductie niveaus in Figuur 1 vertonen, er zijn ongeveer twee keer zoveel mCherry + cellen op DD11 omdat er op DD17 (gegevens niet worden weergegeven). Bij het verzamelen van cellen voor transplantatie, vinden we dat een groter aantal cellen (zie hieronder) starten is gunstig, aangezien ongeveer 30-50% van de cellen gaan verloren in het proces van concentratie van hen voor injectie. Bovendien, kan een groter aantal cellen worden verkregen met kortere FACS pauzes, die beperkt de hoeveelheid tijd die de cellen op ijs en verlaagt de totale kosten. Waarschijnlijk omdat een hoger percentage van de Cherry + cellen progenitorcellen, vertonen cellen uit eerdere fasen van de cultuur (bijvoorbeeld, DD11) meer overleving in vergelijking met DD17 cellen na de transplantatie in neonatale neocortex. Wanneer grote aantallen van levensvatbare cellen nodig zijn, is bijvoorbeeld in het geval van transplantatie van de cel voor de behandeling van epilepsie, met zowel een grotere startende populatie en de grotere levensvatbaarheid een groot voordeel.

Zoals afgebeeld in Figuur 2, afhankelijk van het protocol, ongeveer 25-39% van de Lhx6::GFP + cellen geanalyseerd 30 dagen na transplantatie doen niet express detecteerbare niveaus van PV of SST proteïne met routine immunohistochemistry. In het algemeen, deze PV- / SST-cellen express GABA evenals Sox6, een marker van MGE afkomstige corticale interneuronen (Zie Tyson et al. 15, Tischfield et al. 17). minder dan 1% van PV- / SST - Lhx6::GFP + cellen uitdrukkelijke markers van andere interneuron subgroepen, zoals calretinin, reeline of neuropeptide Y (gegevens niet worden weergegeven). Dit is vergelijkbaar met in vivo lot toewijzing studies die hebben aangetoond dat tussen ~ 15-25% van MGE afkomstige interneuronen doen niet express PV of SST23,25,31. Wanneer Nkx2.1::mCherry+ of Lhx6::GFP + cellen zijn geïsoleerd en verguld naar rat corticale feeders in vitro, vonden we dat hebben ~ 40-70% van de Lhx6::GFP + cellen geanalyseerd na 28 dagen in cultuur PV zijn-/ SST-, met een meerderheid van degenen die vlek positief uitdrukken van SST. Deze toename van PV- / SST-cellen kunnen als gevolg van het ontbreken van een extrinsieke maturational signaal dat is aanwezig in vivo, zoals met name het geval voor volwassen PV uitdrukking, of een suboptimaal elektrofysiologische ingang feeder cellen kan zijn. Wat de reden ook moge zijn, liever wij transplantatie van cellen in neonatale neocortex voor analyse in plaats van in vitro differentiatie van de lot.

Voor de meeste transplantatie experimenten, is het raadzaam drijvend op DD0 een minimum van twee 10-cm niet-aanhanger weefselkweek gerechten elke met 7,5 x 105 mESCs in 10 mL N2/KSR (7,5 x 104 cellen/mL; het totale volume 20 mL). Samen zullen beide platen meestal 8-12 x 106 cellen na EB dissociatie op DD3, waarvan 5,4 x 106 cellen kunnen worden gebruikt om het zaad van twee 6-well Weefselkweek behandeld platen (50.000 cellen/cm2; ongeveer 110 cm2 totaal) opleveren. Door DD8 levert elke plaat 6-well ongeveer 5-7 x 107 cellen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het zonebeheer van een extra drie tot vijf 6-Wells-platen bij een dichtheid van 250.000 cellen/cm2 (waarbij een totaal van 4.05 x 107 cellen in het geval van drie 6-well platen of 6,75 x 107 cellen in het geval van vijf 6-Wells-platen). Door DD14, zal elke 6-well plaat meestal 1-2, 5 x 106 mCherry of GFP-uiten cellen opleveren. Afhankelijk van de behoeften van het experiment, hebben we een minimum van 7,5 x 105 mESCs voor kleinschalige immunohistochemistry analyses aan omhoog van 6 x 106 mESCs voor grote transplantatie projecten gedreven.

De belangrijkste stappen van het protocol zijn het behoud van de mESCs in een pluripotente staat vóór begin differentiatie en de aanvoer/dissociatie stap op DD3. Als de cellen zijn goed gebleven, maar de landing/dissociatie op DD3 zorgvuldig is gedaan, zal de differentiatie meestal succesvol zijn. Alleen stamcellen die gezond lijken en moet worden gebruikt voor de differentiatie. Als EBs niet vormen tussen DD0-3 of meerdere vormen, kleine, asymmetrische organen, de differentiatie dreigt te worden afgewezen. Bovendien, tijdens EB dissociatie op DD3, moet van de EB worden zorgvuldig gecontroleerd totdat niet langer zichtbaar met het blote oog te vermijden van langdurige blootstelling aan de niet-trypsine bevat cel-dissociatie regent.

De resultaten gepresenteerd in dit document werden verkregen geoptimaliseerde omstandigheden gebruikmaken van kwaliteit-gecontroleerde reagentia. Dit is belangrijk om opmerking omdat we soms ondervindt bij het bereiken van de robuuste Nkx2.1 inductie, en bij uitbreiding, mCherry en GFP verslaggever expressie. Gebaseerd op onze ervaring, wij zijn van mening dat veel-op-veel-variabiliteit van FBS meest waarschijnlijke rekeningen voor deze veranderingen. Als zodanig, is het verstandig om te testen verschillende veel FBS te bepalen die het beste werkt voor het behoud van de mESCs. Hoewel we het 2i/LIF-systeem (serumvrij opslagmedium met de MEK-remmer PD03259010 en GSK-3α/β-remmer CHIR99021) niet hebt gebruikt, is het mogelijk dat serumvrij mESC voorwaarden meer consistente resultaten kunnen opleveren. Wij hebben echter niet deze hypothese hebben getest en hebben geen gegevens over de vraag of het gebruik van serumvrij mESC media de differentiatie van mESCs in MGE-achtige progenitoren beïnvloedt. Daarnaast moet u gebruiken verse groeifactoren indien mogelijk door aliquoting hen voor eenpersoonsgebruik. Afhankelijk van de gebruiker wellicht cel dichtheden worden verhoogd om de overleving van de cel van de voldoende, vooral tijdens de stap van de landing op de DD3.

Interneuronen de opmerkelijke capaciteit hebben om te overleven, migreren en integreren van host-circuits na transplantatie. Zo, dit protocol kan worden gebruikt voor transplantatie interneuron precursoren in epileptische muis en andere modellen van neurologische en neuropsychiatrische ziekten (Zie Southwell et al. 32 en Tyson en Anderson33 voor beoordelingen van interneuron cel gebaseerde therapieën). Bijvoorbeeld, in een recente studie Donegan et al. 34 verrijkt populaties van PV en SST CIns voor transplantatie in een muismodel van schizofrenie. Zij vonden dat de PV en SST transplantaties geproduceerd verschillende effecten op het muisgedrag van de, verrijkt met PV verrijkt populaties normaliseren van de schizofrenie Endofenotypen die ze aan het bestuderen waren.

In de afgelopen jaren heeft het PiggyBac transposon systeem is gebruikt om stabiele uitdrukking van transgenen in een aantal systemen. Snel en eenvoudig maken stabiel uiten doxycycline-afleidbare miRNA constructies om te bestuderen van de rol van specifieke genen tijdens interneuron ontwikkeling hebben we dit systeem gebruikt. Wij zijn ook gebruik van deze technologie voor het maken van dual verslaggever mESC lijnen die uitdrukking geven aan channelrhodopsin-2 (ChR2) te optogenetically station mESC afgeleid interneuronen of DREADD receptor technologie op of uit te schakelen getransplanteerde cellen massaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn dankbaar Qing Xu voor de ontwikkeling van de Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual verslaggever mESC lijn evenals Jennifer Tyson Asif Maroof en Tim Petros voor hun vroege werk op het helpen ontwikkelen van dit protocol. Wij danken ook de CHOP stroom cytometry kern voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door een NIH R01 MH066912 (nv) en de F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 130 hersenen muis interneuron differentiatie schors celcultuur stamcellen transplantatie
Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter